CN103070912A

CN103070912A - 一种苦参总黄酮提取物及其制备方法、质量检测方法

Info

Publication number: CN103070912A
Application number: CN2012104690505A
Authority: CN
Inventors: 张思巨; 姚梅芬; 王金华; 白水朋; 李琳; 张志伟; 厉博文; 雷娜
Original assignee: BEIJING ZHENDONG GUANGMING PHARMACEUTICAL RESEARCH INSTITUTE Co Ltd
Current assignee: BEIJING ZHENDONG GUANGMING PHARMACEUTICAL RESEARCH INSTITUTE Co Ltd
Priority date: 2012-11-19
Filing date: 2012-11-19
Publication date: 2013-05-01
Anticipated expiration: 2032-11-19
Also published as: CN103070912B

Abstract

本发明公开了一种苦参总黄酮提取物及其制备方法、质量检测方法。所述苦参总黄酮提取物中黄酮类成分的含量以重量计为60～95%，三叶豆紫檀苷、苦参酮和降苦参酮三种含量较高、活性较强的黄酮化合物占全部黄酮类成分含量以重量计为30～45%，其中三叶豆紫檀苷占总黄酮类成分含量以重量计为9～12％、苦参酮占总黄酮类成分含量以重量计为15～25%、降苦参酮占总黄酮类成分含量以重量计占6～8%。以中药苦参（Sophora flavescens Ait.）为原料，经溶剂提取、聚酰胺吸附柱层析法分离，分部洗脱，收集含黄酮部位的洗脱液经减压回收溶剂得到苦参总黄酮提取物。

Description

一种苦参总黄酮提取物及其制备方法、质量检测方法

技术领域

本发明涉及一种中药提取物及其制备方法、质量检测方法，具体涉及一种苦参总黄酮提取物及其制备方法、质量检测方法。

背景技术

中药苦参为豆科植物苦参Sophora flvescens Ait.的干燥根。始载于汉代神农本草经，列为中品，在2000多年来的临床实践中发挥了诸多功效。具有清热燥湿，杀虫，利尿的功能。临床用于热痢，便血，黄疸尿闭，赤白带下，阴肿阴痒，湿疹，湿疮，皮肤瘙痒，疥癣麻风；外治滴虫性阴道炎。

文献报道[1.郑顺亮.清络方活性部位物质基础研究[D]北京协和医学院-中国医学科学院硕士研究生学位论文.2009；2.赵平、张颖君、山本浩文等．苦参异戊稀基黄酮类化合物的化学、活性及其生物合成研究进展[J]天然产物研究与开发，2004，16(2)；172-178]苦参主要有下列药理活性：抗肿瘤作用、抗炎抑菌作用、抗病毒作用、免疫调节作用、抗肝损伤、抗过敏和平喘、降血糖、对酶的抑制作用、对中枢神经的抑制作用；此外苦参中的苦参碱和黄烷酮类化合物对胃粘膜损伤均有明显的保护作用，其异戊烯基二氢黄酮类化合物具有抗雄性激素样作用；苦参尚具有抗寄生虫、体外杀精、利尿、利胆、止泻等药效作用。

苦参中主要含有生物碱和黄酮体两大类成分。生物碱为苦参的主要活性成分，至今已从中分离得到34种生物碱(包括喹诺里西啶类、金雀花碱型、臭豆碱型、鹰爪豆碱型、羽扇豆碱型和双呱啶类)，其中含量较高、活性较强的为氧化苦参碱、苦参碱、氧化槐果碱、槐定碱及槐果碱。苦参中另一大类成分为黄酮类化合物，至今已得到85个，具有八种结构类型，包括二氢黄酮类33个、二氢黄酮醇类22个、黄酮醇类(3-OH取代)4个、异黄酮类8个、二氢异黄酮类9个、查尔酮类6个、双黄酮类2个以及其他类型的黄酮1个；其中的60个化合物均具有异戊烯基侧链。这些化合物中的异戊烯基侧链包括A～E五种类型以及两种与苯环成吡喃环形式的共七种类型，侧链均存在于A环上；大多数化合物则多以lavandulyl的分枝异戊烯基侧链及其羟基化形式存在于A环的C-8位上。这是苦参的这类黄酮化合物区别于同属其他植物最明显的化学结构特征。

发明内容

本发明目的在于公开一种苦参总黄酮提取物及其制备方法、质量检测方法。

本发明目的是通过如下技术方案实现的：

所述苦参总黄酮提取物中黄酮类成分的含量以重量计为60～95%，其中黄酮类成分包括三叶豆紫檀苷、苦参酮、降苦参酮、苦参醇、苦参醇I、苦参醇A、苦参醇E等多种化合物。三叶豆紫檀苷、苦参酮和降苦参酮三种含量较高、活性较强的黄酮化合物占全部黄酮类成分含量以重量计为30～45%，其中三叶豆紫檀苷占总黄酮类成分含量以重量计为9～12％、苦参酮占总黄酮类成分含量以重量计为15～25%、降苦参酮占总黄酮类成分含量以重量计占6～8%。

所述苦参总黄酮提取物是从野生或栽培的豆科槐属植物苦参的干燥根中提取获得。

本发明的苦参总黄酮提取物经HPLC-MS-MS(负离子)分析表明，主要含有下列化合物：三叶豆紫檀苷、苦参醇、(2S)-8-异戊烯基-5-甲氧基-7,2’,4’-三羟基-5-甲氧基二氢黄酮、苦参醇Q、苦参醇I、苦参醇N、5-甲氧基苦参醇C、苦参酮、苦参醇C、苦参醇X、降苦参酮、苦参醇L、苦参醇E、苦参啶、苦参醇A等。结构式如下：

所述苦参总黄酮提取物的制备方法如下：以中药苦参(Sophora flavescens Ait.)为原料，经溶剂提取、聚酰胺吸附柱层析法分离，分部洗脱，收集含黄酮部位的洗脱液经减压回收溶剂得到苦参总黄酮提取物。

可按如下步骤操作：

苦参干燥根，粉碎成粗粉，以95%乙醇6～8倍回流提取三次，每次提取1-2小时，减压回收溶剂得到乙醇浓缩物；乙醇浓缩物以聚酰胺分散后置聚酰胺层析柱上干法上样，先以水充分洗脱，直至用糖类显色试剂、生物碱的鉴别试剂检测除尽单糖、寡糖及无机盐和生物碱；再以浓度为5～8%的乙醇洗脱，以除尽生物碱,该洗脱液浓缩物和上述水洗脱浓缩物一并另器保存；提高洗脱液乙醇的浓度至10～20%，经减压回收溶剂，以黄酮体的鉴别试剂检测浓缩的洗脱液，得到含黄酮体的浓缩液段A(含三叶豆紫檀苷及其它黄酮体的浓缩液段)；再提高洗脱液乙醇浓度至50～60％，得到浓缩液段B(含苦参酮和降苦参酮等含量较多的黄酮类成分)；最后用95％乙醇或无水乙醇把黄酮类洗脱净，得到浓缩液段C(含酚羟基较多的黄酮类化合物)，将浓缩液段A、B、C合并，得到本发明苦参总黄酮提取物。

所述苦参总黄酮提取物中三叶豆紫檀苷的提取和纯化方法为：

苦参干燥根，粉碎成粗粉，以95%乙醇6～8倍回流提取三次，每次提取1-2小时，减压回收溶剂得到乙醇浓缩物；乙醇浓缩物以聚酰胺分散后置聚酰胺层析柱上干法上样，先以水充分洗脱，直至用糖类显色试剂检测除尽单糖、寡糖及无机盐；再以浓度为5～8%的乙醇洗脱，以除尽生物碱,该洗脱液浓缩物和上述水洗脱浓缩物一并另器保存；提高洗脱液乙醇的浓度至10～20%，经减压回收溶剂，以黄酮类化合物的鉴别试剂检测浓缩的洗脱液，收集含有三叶豆紫檀苷的析出物，得到的粗品经重结晶法得纯品。纯度大于98%。

所述糖类显色试剂包括但不限于费林氏试液、Molish试剂等。

所述黄酮类化合物的鉴别试剂包括但不限于：三氯化铝乙醇试剂、盐酸-镁粉试剂、浓氨水溶液等。

所述生物碱的鉴别试剂包括但不限于Dragendorff试剂、Mayer试剂和Wagner试剂等。

所述乙醇浓缩物提取方法优选为：以95%乙醇回流提取三次，第一次用8倍量提取2小时，第二、三次用6倍量提取1.5小时。

本发明所述苦参总黄酮提取物可单独或与其他组分混合制成单方或复方制剂，如胶囊剂、片剂、颗粒剂、冲剂、糖浆、酒剂、凝胶剂、巴布剂、栓剂、膏剂和散剂等。各种制剂可应用于医药、兽药、保健品、化妆品等领域。如苦参总黄酮提取物加总生物碱配伍黄芪皂苷提取物、龙胆草提取物制成胶囊剂治疗慢性乙型肝炎；总黄酮提取物、配伍人参总皂苷、五味子、麦冬制成片剂治疗心律失常；苦参总黄酮提取物加总生物碱配伍杏仁、桑白皮制成颗粒剂治疗哮喘；苦参总黄酮提取物加总生物碱配伍黄柏、蛇床子制备成凝胶剂或栓剂治疗阴道滴虫；苦参总黄酮提取物加生物碱配伍百部制备成凝胶剂或软膏剂治疗皮肤病。

本发明苦参总黄酮提取物的质量检测方法包括如下含量测定方法中的一种或几种。

1.紫外-可见分光光度法测定总黄酮含量：

对照品溶液的制备：取苦参酮(纯度＞98%)对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含25ug的溶液，即得。

供试品溶液制备：取总黄酮提取物适量，精密称定，置50ml量瓶中，加甲醇至刻度，制成每1ml含0.2mg的溶液，摇匀，即得。

标准曲线的制备：精密吸取对照品溶液0.5ml、1ml、1.5ml、2ml、2.5ml、3ml、3.5ml和4ml分别置5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀；以甲醇为空白，照紫外-可见分光光度法(中华人民共和国药典2010年版附录VA)，在288nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，回归方程为：Y=41.601x+0.0126，r=0.9998。

测定法：精密吸取供试品溶液0.4、0.5、0.6ml，分别置5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。照标准曲线的制备项下的方法，“自以甲醇为空白”起，依法测定吸光度，代入回归方程计算，即得。

2.HPLC法测定三叶豆紫檀苷含量：

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水(20～30∶80～70)为流动相；检测波长为310nm；柱温30℃；流速1mL/min。三叶豆紫檀苷峰与相邻峰分离度不低于1.5，理论板数以三叶豆紫檀苷峰计算应不低于4000。

对照品溶液的制备取经减压干燥至恒重的三叶豆紫檀苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含0.05mg的溶液，即得。

供试品溶液的制备取苦参总黄酮提取物约10mg，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇超声溶解，放置室温，加甲醇至刻度，摇匀，制成每1mL含0.4mg的溶液，即得。

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10～15ul，注入液相色谱仪，测定，即得。

所述流动相优选的为乙腈-水(24∶76)。

3.HPLC法测定苦参酮、降苦参酮含量。

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-1%甲酸水溶液(48～45：52～55)为流动相；检测波长:290nm，流速:0.8mL～1.0/min；柱温：30～35℃;理论塔板数按苦参酮峰计算应不低于5000。

对照品溶液的制备取苦参酮、降苦参酮对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml分别含苦参酮0.1264mg、降苦参酮0.0286mg的混合溶液。

供试品溶液制备取苦参总黄酮提取物约10mg，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇超声溶解，放置室温，加甲醇至刻度，摇匀即得。

测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各5～15μl，注入液相色色谱仪，测定，即得。

所述流动相优选的为乙腈-1%甲酸水溶液(48:52)；流动相中甲酸可用冰醋酸替代。

所述适量按《中华人民共和国药典》规定的常规取样量而定。

中药苦参中主要含有黄酮和生物碱两大类活性成分，本发明主要选用了聚酰胺吸附剂对苦参中的黄酮类化合物进行选择性可逆吸附而达到除杂富集的目的。聚酰胺(Polyamide)为酰胺聚合而成的一类高分子物质，其酰胺羰基可与黄酮类的酚羟基形成氢键，产生了吸附作用；苦参中还含有34 种生物碱，其中含量高活性强的为氧化苦参碱、苦参碱、氧化槐果碱、槐果碱和槐定碱等，这些化合物均不含酚羟基，而亲水性又很强，故不易被聚酰胺吸附，这就决定了用聚酰胺吸附层析法可以较简便地把苦参中的两大类成分分离开。在聚酰胺吸附柱上用水洗脱时大部分生物碱就能和糖类成分一起被洗脱下来，再用5～8%的乙醇洗脱，生物碱类均被洗脱下来，与黄酮类成分得以分离。本法分离此两类成分比有些文献和专利报道的如需要用多种吸附剂、有机溶剂(包括有毒溶剂)及酸、碱处理等要简便易得。若需同时又得到总生物碱，只要将上述“所述聚酰胺吸附柱层析法可按如下步骤操作”中“另器保存”的部分上AB-8等类中极性大孔吸附树脂或强酸型离子交换树脂处理即可得到总生物碱。对苦参总黄酮化合物而言在聚酰胺吸附柱上富集仅需用乙醇一种溶媒、不需要混用其它有毒溶剂就能完成，而且样品上柱量大、聚酰胺可反复使用，方法简便，所得提取物黄酮含量高，并可自主选择提取物中黄酮的种类，成本低，十分适合于大量制备性生产。

三叶豆紫檀苷为苦参中的异黄酮紫檀素类化合物，具有抗肿瘤、抗炎、抑菌等药理活性，在苦参和复方苦参注射液中均为活性成分。其唯一的酚羟基与葡萄糖结合了，在聚酰胺吸附柱上吸附力弱，用低浓度的乙醇即被洗脱下来。比较了数种三叶豆紫檀苷制备方法，本方法无需用有毒溶媒处理、比常规用硅胶多次分离要简便、实用且纯度高，十分适合于大量制备性生产；总之本提取物的提取分离工艺简便、费用低、污染少特别适用于工业大生产。

苦参总黄酮提取物药效学研究结果表明：1.毒性很小，其最大耐受剂量为3g提取物·kg-1；动物在药后14天的观察期内进食正常、体重增长与对照组无差异，未见明显的毒性反应症状。观察结束后进行大体解剖，肉眼观察各主要脏器(心、肝、脾、肺、肾等)，与对照组比较，各脏器未见明显的异常。说明该药物无明显的迟发性毒性反应。其毒性远低于苦参生物碱类。2.具有明显的抗肿瘤作用(口服用药尤其对于小鼠肝癌)；3.有一定的镇痛作用(镇痛作用强度略低于苦参碱和氧化苦参碱)；4.在一定剂量范围内，具有明显的降血糖作用；5.苦参总黄酮与化药环磷酰胺联合用药后有协同免疫抑制作用。6.苦参总黄酮中、高剂量可明显增强泼尼松诱导的免疫机能低下小鼠的腹腔巨噬细胞的吞噬功能。7.三叶豆紫檀苷具有抗炎、抑菌作用，对人源肝癌(SMMC7721)细胞增殖有非常显著的抑制作用。

附图说明：

图1为化合物1二级质谱及裂解方式 m/z

图2为化合物2二级质谱及裂解方式 m/z

图3为化合物5二级质谱及裂解方式 m/z

图4为化合物8二级质谱及裂解方式 m/z

图5为化合物9二级质谱及裂解方式 m/z

图6化合物11二级质谱及裂解方式 m/z

下述实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明。

实验例1乙醇提取物上聚酰胺吸附柱层析法制备苦参总黄酮提取物

苦参总黄酮其特征在于由野生或栽培的苦参的干燥根中提取获得。提取溶剂也可用70％以上的乙醇，但优选的为95％乙醇，因乙醇浓度高可以去除多糖、糖肽、蛋白等大分子物质的杂质干扰；提取方法曾用过浸渍加渗漉、超声提取，优选的为回流提取三次，第一次用8倍量提取2小时，第二、三次用6倍量提取1.5小时；过滤方法包括常压滤布过滤、离心或抽滤等，可依据实验条件选用；溶剂的浓缩方法优选为减压浓缩。将苦参干燥根粉碎成粗粉，按优选的方法用95%乙醇回流提取三次，滤过，滤液减压浓缩至近干得乙醇提取物。聚酰胺吸附柱可取30～60目聚酰胺(筛去细分)按常规预处理后，用纯净水浸泡搅拌至无气泡，湿法装柱，乙醇提取物以聚酰胺分散、干燥后置层析柱干法上样，先以水充分洗脱，直至用糖类显色试剂显示不含糖止；再以适量低浓度的乙醇(5～8%)洗脱，以除尽生物碱等杂质，该洗脱浓缩物和上述水洗脱浓缩物一并另器保存。提高洗脱液乙醇的浓度至10～20%，经减压回收溶剂，以黄酮体的鉴别试剂检测浓缩的洗脱液(如：三氯化铝乙醇试剂、盐酸-镁粉试剂、浓氨水溶液等)，收集含三叶豆紫檀苷及其它黄酮体的浓缩液段A；逐级提高洗脱液乙醇浓度至30%～80％，分部收集洗脱液，减压回收溶剂，时时用黄酮类检测试剂检查，得到含不同酚羟基的黄酮类化合物B，50～60％乙醇洗脱液减压浓缩后得量最高，活性物质苦参酮和降苦参酮等包含于此，最后用95％或无水乙醇把黄酮体洗脱净，得到含酚羟基较多的黄酮类化合物C，把上述A、B和C合并得到了总黄酮提取物；也可以根据需要而合并某些部位得到了以某些化合物为主的黄酮提取物。

实验中也用了更简便的方法即得到了A浓缩液段后，直接用95％或无水乙醇洗脱，洗脱浓缩液加上A物，亦为总黄酮提取物。

实验例2本发明的苦参总黄酮提取物(按实施例1的方法制备)的HPLC-MS-MS分析，指认和推断了10余个黄酮化合物。

化合物1：M=446，m/z491与三叶豆紫檀苷（trifolirhizin）对照品液相色谱保留时间及质谱行为一致。负离子模式中，491为[M+甲酸]－，二级质谱中283为[M-葡萄糖基]－。正离子模式中，m/z447为[M+H]+，其结构式如附图1所示。

化合物2：M=456，m/z455，根据苦参黄酮类化学成分检索，推断为苦参醇（kurarinol），其结构式如附图2所示。二级质谱碎片峰：m/z293、235、

所以二级质谱中会有m/z137的碎片。

化合物3：M=370，m/z 369，根据苦参黄酮类化学成分检索，推断为(2S)-8-异戊烯基-5-甲氧基-7,2’,4’-三羟基-5-甲氧基二氢黄酮((2S)-8-prenyl-5-methoxy-7,2’,4’-trihydroxy-5-methoxy-flavanone)。在二级质谱中，m/z 207为C环断裂得到的碎片，其裂解规律与化合物2相似。

化合物4：M=442，m/z 441，根据苦参黄酮类化学成分检索，分子量为442的已知化合物只有苦参醇Q(kushenol Q)，所以推断其中有一个峰应该是苦参醇Q。在二级质谱中m/z 279为C环断裂得到的碎片(1-2位、4-10位断裂)，其裂解规律与化合物2相似。

化合物5：M=454，m/z453，根据苦参黄酮类化学成分检索，推断为苦参醇I（kushenol I）、苦参醇N（kushenol N）或5-甲氧基苦参醇C（5-methylkushenol C）。二级质谱碎片峰：m/z275、177、149、139、137。在二级质谱中，C环断裂（1-2位、4-10位断裂），得到m/z275、137（薰衣草基）两个特征碎片，其结构式如附图3所示。

化合物6：M=438，m/z 437与苦参酮(kurarinone)对照品液相色谱保留时间及质谱行为一致。在二级质谱中，C环断裂(1-2位、4-10位断裂)，得到m/z 275的碎片，其裂解规律与化合物2相似。

化合物7：M=440，m/z 439，根据苦参黄酮类化学成分检索，推断为苦参醇C(kushenol C)或者苦参醇X(kushenol X)，其结构式如下图所示。二级质谱碎片峰：m/z 261、217、193、177、137。在二级质谱中，C环断裂(1-2位、4-10位断裂)，得到m/z 261、193、137的碎片峰。其裂解规律与化合物8相似。因为有137的碎片峰，所以排除苦参醇L。

化合物8：M=424，m/z423与降苦参酮（kurarinone）对照品液相色谱保留时间及质谱行为一致。其裂解规律与文献报道一致^［］。二级质谱碎片峰：m/z261、193、161、137、125，其结构式如附图4所示。

化合物9：M=440，m/z439，根据苦参黄酮类化学成分检索，推断为苦参醇L（kushenol L），结构式如附图5所示。二级质谱碎片峰：m/z261、193、177、149、124。二级质谱中，C环断裂，得到m/z261、193的碎片峰，未见m/z137的碎片峰，推断不含有薰衣草基，所以排除苦参醇C和苦参醇X。

化合物10：M=424，m/z423，根据苦参黄酮类化学成分检索，推断为苦参醇E（kushenol E），结构式如下图所示。二级质谱碎片峰：m/z261、193、192、161、124。二级质谱中，得到m/z261、193的特征峰。未见137的碎片峰，可能不含有薰衣草基，由此推断化合物为苦参醇E。其裂解规律与化合物9相似。

化合物11：M=438，m/z437，根据苦参黄酮类化学成分检索，推断为苦参啶（kuraridin），结构式如附图6所示。二级质谱碎片峰：m/z275、191、161、139、137。二级质谱中，得到m/z275、137的特征峰。

化合物12：M=408，m/z407，根据苦参黄酮类化学成分检索，推断为苦参醇A（kushenol A），结构式如附图4所示。二级质谱中，得到m/z261、193、137、125的碎片峰，其裂解规律与化合物8一致。

实验例3苦参总黄酮提取物最大耐受量测定

本发明苦参总黄酮提取物(实施例1制备)，是从苦参中提取的黄酮类成分的总体。经小鼠一次性口服灌胃给药测得的急性毒性(最大耐受量)实验结果表明：

苦参总黄酮提取物采用小鼠一次性灌胃给药(因该物质毒性相对较小，故受药物浓度和给药体积的限制)测不出LD₅₀，但测得小鼠的一次性灌胃给药的最大耐受剂量为3g·kg¹。

实验例4苦参总黄酮提取物(实施例1)镇痛作用研究：

(1)对醋酸溶液诱导的小鼠扭体反应表明：苦参总黄酮的高、中、低三个剂量组进行口服灌胃给药，每日一次，连续给药3-5天.结果表明：样品所设置的3个剂量组均可明显抑制由冰醋酸溶液诱导的小鼠扭体的次数(与对照组比较，P＜0.05，或P＜0.01))。说明该物对于小鼠的外周性疼痛具有明显的抑制作用。

(2)对热刺激诱导的小鼠痛阈值的影响：

该物质连续灌胃给药3-5天，大剂量组在药后120分钟可明显延长小鼠的热痛阈值(与对照组比较，P＜0.01)，说明其对中枢性疼痛具有明显的镇痛作用。

实验例5苦参总黄酮提取物(实施例1制备)对小鼠肝癌(H22)和S180移植性肿瘤的抑瘤作用考察

苦参总黄酮提取物设高、中、低三个剂量组。连续灌胃给药10d，分别于停药后次日处死小鼠，称体重和瘤重，计算抑瘤率。结果经统计学处理表明：该物质的高、中、低三个剂量组均可明显抑制小鼠肝癌H22、肉瘤S180的瘤重(与模型组比较P＜0.05或P＜0.01)。对小鼠肝癌H22高剂量组的抑瘤率可达67.5％，与阳性对照药环磷酰胺40mg·kg¹的抑瘤率65.98％大体相当。

实验例6苦参总黄酮提取物(实施例1制备)对四氧嘧啶致小鼠高血糖症的影响

以四氧嘧啶致小鼠实验性高血糖为模型，观察了苦参总黄酮的降血糖作用。结果表明，造模小鼠血糖值均明显高于11mmol/L，且模型稳定。阳性对照药二甲基双胍80mg·kg^-1降糖作用非常显著；苦参总黄酮设高、中、低三个剂量组，每日上午给药一次，连续给药16d。全部小鼠禁食16h后取血，测定小鼠的血糖值。

结果表明：模型组小鼠的血糖值在药后16天仍明显高于正常对照组(P＜0.01)，表明模型组小鼠依然处于高血糖状态；而苦参总黄酮提取物的中、高剂量组均可明显降低小鼠的血糖值(与模型组比较，P＜0.01)，并可明显改善高血糖模型小鼠的多尿症状和小鼠的一般状态(如毛色、精神状态等)。

实验例7苦参总黄酮提取物(实施例1制备)对小鼠免疫功能的调节作用

(1)对环磷酰胺所诱导的体液免疫机能低下小鼠脾脏B淋巴细胞抗体生成能力的影响：

以环磷酰胺诱导小鼠免疫机能低下为模型，观察黄酮提取物对小鼠脾脏 B淋巴细胞抗体生成能力的影响。结果表明：苦参总黄酮高、中、低三个剂量组，每日灌胃给药一次，连续给药10天，各剂量组与环磷酰胺合用对小鼠的脾脏抗体生成能力均显示明显的协同抑制作用(与环磷酰胺组比较，P＜0.01或P＜0.05)，对小鼠的胸腺和脾脏重量也显示明显的协同抑制作用。结果提示，苦参总黄酮提取物与环磷酰胺联合用药，对小鼠的体液免疫功能具有协同抑制作用。

(2)对泼尼松诱导的免疫机能低下小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响

实验以泼尼松诱导小鼠免疫机能低下为模型，观察了苦参总黄酮对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响。结果表明，泼尼松3mg·kg¹可明显抑制小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能，使巨噬细胞的吞噬百分率和吞噬指数明显低于正常对照组(P＜0.01)；苦参总黄酮提取物的中、高剂量组均可明显提高免疫机能低下小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬百分率和吞噬指数(与泼尼松组比较，P＜0.001)，并显示出明显的量效关系。

实验例8三叶豆紫檀苷抑菌、抗炎作用及对人源肝癌SMMC-7721细胞增殖的作用影响

实验结果证明，三叶豆紫檀苷的中、大剂量组连续灌胃给药7天对于巴豆油所致的小鼠耳廓炎症和角叉菜胶所致的大鼠足趾肿胀等渗出性炎症均具有明显的抗炎作用；对于多数细菌如：大肠杆菌、痢疾杆菌、肺炎双球菌等均有明显的抑制作用。

体外实验观察了不同浓度的三叶豆紫檀苷作用于人源肝癌SMMC-7721细胞后不同的时间(24、48、72h)对细胞增殖的影响。结果表明，高浓度的三叶豆紫檀苷对其细胞增殖具有明显的抑制作用，并显示出明显的量效和时效关系。

实验例9总黄酮含量测定方法试验

曾预试过①.盐酸-镁粉比色法测定总黄酮含量以苦参酮或降苦参酮为对照品，该法适用于黄酮、黄酮醇、二氢黄酮和二氢黄酮醇类化合物，它们在盐酸-镁粉作用下发生还原反应，显橙红~紫红色；但苦参总黄酮中含有查尔酮类(如苦参啶)、异黄酮类(包括紫檀素类-三叶豆紫檀苷等)等成分均不能被检测；另在热提取过程中，二氢黄酮类成分也可能部分地转变成了查尔酮类化合物，使测定结果更低。故暂不取用。

②按2010年中国药典(P30)收载的总黄酮测定法测定，结果显示该法测定本品重复性较差。

③紫外-可见分光光度法测定总黄酮含量以苦参酮为对照品，苦参酮的甲醇溶物最大吸收波长为290nm，而总黄酮的甲醇溶物的最大吸收波长为288nm，该方法测定结果表明稳定性、重复性较好。

测定总黄酮类化合物的方法如前所述有数种，每一种方法都有它的适应面，前述背景技术中已阐明了苦参含有85个黄酮类化合物，具有八种结构类型，故结构类型不同的黄酮类化合物无法用常用的一种测定方法准确地测定。本定量方法适宜于紫外吸收波长为288nm±的黄酮体、对距该波长较远的化合物误差就大，故测定值也不可能很准确，至今尚未建立测定所有结构类型的黄酮体含量的方法，本法为与上述另两种方法比较后选用的。

实验例10HPLC法测定三叶豆紫檀苷含量的线性关系考察-

制备供试品溶液时，依据化合物的性质比较了甲醇、乙醇和80%甲醇三种溶剂，结果选用甲醇为溶剂；并采用了超声溶解的方法。

对照品溶液的制备取经减压干燥至恒重的三叶豆紫檀苷对照品5mg，精密称定，加甲醇制成每1mL含0.1mg的溶液，即得。

供试品溶液的制备取苦参总黄酮提取物10mg，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇超声溶解，放置室温，加甲醇至刻度，摇匀，制成每1mL含0.4mg的溶液，即得。

线性关系考考察：精密吸取对照品溶液1，2，5，8，11，14，17，20μl，按前述色谱条件依次进样，以峰面积为纵坐标，进样量(μg)为横坐标作标准曲线。回归方程(n＝8)为y＝9186x-1130，r＝0.9998，三叶豆紫檀在0.1~2μg范围内线性关系良好。

样品测定按上述方法对数批总黄酮提取物样品进行了测定，含量为9~12％。

实验例11HPLC法测定总黄酮提取物中苦参酮和降苦参酮含量的方法学考察

苦参酮甲醇溶物最大吸收波长为290nm，降苦参酮为294nm，总黄酮的最大吸收波长为288nm，样品测定时选用290nm。流动相选用了乙腈和酸水溶液，因苦参酮和降苦参酮均含有酚羟基，故使用了0.5-1.5％甲酸或冰醋酸；两种溶剂比例以酸水溶液＞乙腈为宜，如：1％甲酸(冰醋酸)水溶液-乙腈(52～55：48～45)，流速0.8～1ml/min均可。比较了几种对照品和供试品溶液制备的溶剂，确认甲醇较合适。经比较优选的方法如下：

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-1%甲酸水溶液(48：52)为流动相；检测波长:290nm，流速:0.8mL～1.0/min；柱温：35℃;理论塔板数按苦参酮峰计算应不低于5000。

对照品溶液的制备取苦参酮、降苦参酮对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.316mg的苦参酮和0.0715mg的降苦参酮的储备液。依次移取储备液0.2,0.4,1,2,2.4,3ml,以甲醇定容于5ml容量瓶中，配制成系列对照品溶液。

线性关系考察精密吸取系列对照品溶液各10μl，按色谱条件依次进样，测定峰面积的积分值，以峰面积为纵坐标、进样量(μg)为横坐标进行线性回归，苦参酮和降苦参酮的回归方程(n＝6)分别为Y=2217X-19.90,r=0.9999和Y=2132X+0.942；r=0.99999。

下述实施例均能实现上述实验例所述效果。

实施例1：苦参总黄酮提取物的制备-聚酰胺吸附柱层析法

苦参干燥根1kg，粉碎成粗粉，以95%乙醇回流提取三次，第一次用8倍量提取2小时，第二、三次用6倍量提取1.5小时；减压回收溶剂得到乙醇浓缩物；聚酰胺(30～60目)按常规预处理后，用纯净水浸泡、搅拌至无气泡，湿法装柱；乙醇浓缩物以聚酰胺80～100g分散、干燥后置层析柱干法上样，以水充分洗脱，时时以费林氏试液、Dragendorff等试剂检测，至除去单糖、寡糖及无机盐和生物碱，再以低浓度的乙醇洗脱(5～8％)，以除尽生物碱，其洗脱浓缩物和上述水洗脱浓缩物一并另器保存。提高洗脱液乙醇的浓度至10～20%，经减压回收溶剂，以黄酮体的鉴别试剂检测浓缩的洗脱液(如：三氯化铝乙醇试剂、盐酸-镁粉试剂、浓氨水溶液等)，收集含三叶豆紫檀苷及其它黄酮体的浓缩液段A；再提高洗脱液乙醇浓度至50～ 60％，得到浓缩液段B(苦参酮和降苦参酮等含量较多的活性成分)；最后用95％或无水乙醇把黄酮类充分洗脱净，洗脱浓缩液得到含酚羟基较多的黄酮体浓缩液段C。将浓缩液段A、B、C合并，得苦参总黄酮提取物。

实施例2：苦参中三叶豆紫檀苷的提取和纯化

苦参干燥根1kg，粉碎成粗粉，以95%乙醇回流提取三次，第一次用8倍量提取2小时，第二、三次用6倍量提取1.5小时，减压回收溶剂得到乙醇浓缩物。聚酰胺按常规预处理后，用纯净水浸泡、搅拌至无气泡，湿法装柱；另取浓缩物以聚酰胺100g±分散、干燥后置层析柱干法上样，以水充分洗脱，时时以费林氏试液等检测至除尽单糖、寡糖及无机盐止，再以5～8％的乙醇洗脱以除尽生物碱等，继用10～20%乙醇液洗脱，洗脱液经减压回收溶剂，收集含有三叶豆紫檀苷的白色析出物，得到的粗制品经甲醇水重结晶得到纯度＞98％的样品。含量为9～15％。

实施例3苦参总黄酮提取物片剂

取实施例1制备的苦参总黄酮提取物1000g，粉碎成细粉，加入适量淀粉、硬脂酸镁混匀制成颗粒，干燥，压制成片剂，即得。

实施例4苦参总黄酮提取物丸剂

取实施例1制备的苦参总黄酮提取物1000g，粉碎成细粉，过筛，每100g细粉加炼蜜60～80g，制成蜜丸，即得。

实施例5苦参总黄酮提取物颗粒剂

取实施例3制备的苦参总黄酮提取物1000g，加蔗糖、糊精适量制成颗粒，干燥，即得。

实施例6苦参总黄酮提取物复方胶囊制剂-

取实施例1制备的苦参总黄酮提取物1kg，加苦参总生物碱1kg，黄芪皂苷提取物1kg，龙胆草提取物1kg，混合均匀，制成颗粒，干燥，即得。用于治疗慢性乙型肝炎。

实施例7质量检测方法：紫外-可见分光光度法测定总黄酮含量

对照品溶液的制备：取苦参酮对照品适量(纯度＞98%)，精密称定，加甲醇制成每1ml含25ug的溶液，即得。

供试品溶液制备：取实施例1制备的苦参总黄酮提取物约10mg，精密称定，置50ml量瓶中，加甲醇至刻度，制成每1ml含0.2mg的溶液，摇匀，即得。

标准曲线的制备：精密吸取对照品溶液0.5ml、1ml、1.5ml、2ml、2.5ml、3ml、3.5ml和4ml分别置5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀；以甲醇为空白，照紫外-可见分光光度法(中华人民共和国药典2010年版附录VA)，在288nm的波长处分别测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。回归方程为：Y=41.601x+0.0126，r=0.9998.

测定法：精密吸取供试品溶液0.4、0.5、0.6ml,分别置5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。照标准曲线的制备方法，“自以甲醇为空白”起，依法测定吸光度，代入回归方程计算，即得。

数批测定含量约为62％-70％。

实施例8质量检测方法：HPLC法测定三叶豆紫檀苷含量

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水(24∶76)为流动相；检测波长为310nm；柱温30℃；流速1mL·min-1。按上述色谱条件测定，三叶豆紫檀苷峰与相邻峰分离度不低于1.5，理论板数以三叶豆紫檀苷峰计算不低于4000。

对照品溶液的制备：取经减压干燥至恒重的三叶豆紫檀苷10mg，精密称定，加甲醇制成每1mL含0.05mg的溶液，即得。

供试品溶液的制备：取实施例1制备的苦参总黄酮提取物约10mg，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇超声溶解，放置室温，加甲醇至刻度，摇匀制成每1mL含0.4mg的溶液，即得。

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10～15μl，本品按干燥品计算，数批测定含三叶豆紫檀苷为9.5-11%。

实施例9质量检测方法：HPLC法测定苦参酮、降苦参酮含量

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙睛-1%甲酸水溶液(48∶52)为流动相;检测波长:290nm，流速:0.8mL～1.0/min;柱温:35℃;理论塔板数按苦参酮峰计算应不低于5000。

对照品溶液的制备取苦参酮、降苦参酮适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.1264mg的苦参酮和0.0286mg的降苦参酮溶液。

供试品溶液制备取实施例1制备的苦参总黄酮提取物约10mg，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇超声溶解，放置室温，加甲醇至刻度，摇匀即得。

测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10～15μl，注入液相色色谱仪，测定，即得。

本品含苦参酮18mg-2%、降苦参酮6.5-7.5%。

Claims

1.一种苦参总黄酮提取物，其特征在于该提取物中黄酮类成分的含量以重量计为60～95%，；三叶豆紫檀苷、苦参酮和降苦参酮占全部黄酮类成分含量以重量计为30～45%；其中三叶豆紫檀苷占总黄酮类成分含量以重量计为9～12％、苦参酮占总黄酮类成分含量以重量计为15～25%、降苦参酮占总黄酮类成分含量以重量计占6～8%。

2.如权利要求1所述的苦参总黄酮提取物，其特征在于所述苦参总黄酮提取物是从野生或栽培的豆科槐属植物苦参的干燥根中提取获得。

3.如权利要求1所述的苦参总黄酮提取物，其特征在于该提取物主要含有下列化合物：三叶豆紫檀苷、苦参醇、2S-8-异戊烯基-5-甲氧基-7,2’,4’-三羟基-5-甲氧基二氢黄酮、苦参醇Q、苦参醇I、苦参醇N、5-甲氧基苦参醇C、苦参酮、苦参醇C、苦参醇X、降苦参酮、苦参醇L、苦参醇E、苦参啶、苦参醇A。

4.如权利要求１、２或３所述的苦参总黄酮提取物的制备方法，其特征在于该方法为：

取苦参干燥根，粉碎成粗粉，以95%乙醇6～8倍回流提取三次，每次提取1-2小时，减压回收溶剂得到乙醇浓缩物；乙醇浓缩物以聚酰胺分散后置聚酰胺层析柱上干法上样，先以水充分洗脱，直至用糖类显色试剂、生物碱的鉴别试剂检测除尽单糖、寡糖、及无机盐；再以浓度为5～8%的乙醇洗脱，以除尽生物碱,并和上述水洗脱浓缩物一并另器保存；提高洗脱液乙醇的浓度至10～20%，经减压回收溶剂，以黄酮类化合物的鉴别试剂检测浓缩的洗脱液，收集含黄酮体的浓缩液段A；再提高洗脱液乙醇浓度至50～60％，得到浓缩液段B；最后用95％乙醇或无水乙醇把黄酮类洗脱净，得到浓缩液段C，将浓缩液段A、B、C合并，得到本发明苦参总黄酮提取物。

5.如权利要求4所述的苦参总黄酮提取物的制备方法，其特征在于所述糖类显色试剂包括但不限于Fehling试剂、Molish试剂；所述黄酮类化合物的鉴别试剂包括但不限于三氯化铝乙醇试剂、盐酸-镁粉试剂、浓氨水溶液；所述生物碱的鉴别试剂包括但不限于Dragendorff试剂、Mayer试剂。

6.如权利要求4所述的苦参总黄酮提取物的制备方法，其特征在于所述乙醇浓缩物提取方法为：以95%乙醇回流提取三次，第一次用8倍量提取2小时，第二、三次用6倍量提取1.5小时。

7.如权利要求１或３所述的三叶豆紫檀苷的提取纯化方法，其特征在于该方法为：

苦参干燥根，粉碎成粗粉，以95%乙醇6～8倍回流提取三次，每次提取1-2小时，减压回收溶剂得到乙醇浓缩物；乙醇浓缩物以聚酰胺分散后置聚酰胺层析柱上干法上样，先以水充分洗脱，直至用糖类显色试剂检测除尽单糖、寡糖及无机盐；再以浓度为5～8%的乙醇洗脱，以除尽生物碱, 洗脱浓缩物和上述水洗脱浓缩物一并另器保存；提高洗脱液乙醇的浓度至10～20%，经减压回收溶剂，以黄酮类化合物的鉴别试剂检测浓缩的洗脱液，收集含有三叶豆紫檀苷粗品的析出物，得到的粗品经重结晶法得纯品，纯度大于98% 。

8.如权利要求7所述的三叶豆紫檀苷的提取纯化方法，其特征在于所述乙醇浓缩物提取方法为：以95%乙醇回流提取三次，第一次用8倍量提取2小时，第二、三次用6倍量提取1.5小时。

9. 如权利要求１、２或３所述的苦参总黄酮提取物的质量检测方法，其特征在于该方法包括如下含量测定方法中的一种或几种：

A．紫外-可见分光光度法测定总黄酮含量

对照品溶液的制备：取纯度﹥98%的苦参酮适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含25ug的溶液，即得；

供试品溶液制备：取总黄酮提取物适量，精密称定，置50ml量瓶中，加甲醇至刻度，制成每1ml含0.2 mg的溶液，摇匀，即得；

标准曲线的制备：精密吸取对照品溶液0.5ml、1 ml、1.5 ml、2ml、2.5 ml、3 ml、3.5 ml和4 ml分别置5 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀；以甲醇为空白，照紫外-可见分光光度法，在288nm的波长处分别测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；回归方程为：Y=41.601x + 0.0126，r=0.999 8；

测定法：精密吸取供试品溶液0.4、0.5、0.6 ml，分别置5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀；照标准曲线的制备项下的方法，自“以甲醇为空白”起，依法测定吸光度，代入回归方程计算，即得;

B. HPLC法测定三叶豆紫檀苷含量

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以20～30︰80～70的乙腈-水流动相；检测波长为310nm；柱温30℃；流速1mL/min；三叶豆紫檀苷峰与相邻峰分离度不低于1.5，理论板数以三叶豆紫檀苷峰计算应不低于4000；

对照品溶液的制备：取经减压干燥至恒重的三叶豆紫檀苷5mg，精密称定，加甲醇制成每1mL含0.05mg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取苦参总黄酮提取物10mg，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇超声溶解，放置室温，加甲醇至刻度，摇匀，制成每1mL含0.4mg的溶液，即得；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 ～15 ul，注入液相色谱仪，测定，即得；

C. HPLC法测定苦参酮、降苦参酮含量

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以的乙腈－1%甲酸溶液为流动相；检测波长:290nm，流速:0.8mL～1.0/min；柱温：30～35℃; 理论塔板数按苦参酮峰计算应不低于5000；

对照品溶液的制备：取苦参酮、降苦参酮对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.1264mg的苦参酮和0.0286mg的降苦参酮溶液；

供试品溶液制备：取苦参总黄酮提取物10mg，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇超声溶解，放置室温，加甲醇至刻度，摇匀即得；

测定：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液5～15μl,注入液相色谱仪，测定，即得。

10.如权利要求１、２或３所述的苦参总黄酮提取物在制备具有镇痛、抑制肿瘤、降血糖或增强免疫力的药物中的应用。三叶豆紫檀苷在抑菌、抗炎、抑制肿瘤的药物中的应用。