CN105334174B

CN105334174B - 利用紫外分光光度法测定草豆蔻主要活性成分含量的方法

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Publication number: CN105334174B
Application number: CN201510272183.7A
Authority: CN
Inventors: 何文英; 陈昱学; 吴秀丽; 吴禄勇
Original assignee: Hainan Normal University
Current assignee: Hainan Normal University
Priority date: 2015-05-26
Filing date: 2015-05-26
Publication date: 2017-11-21
Anticipated expiration: 2035-05-26
Also published as: CN105334174A

Abstract

本发明公开了一种利用紫外分光光度法测定草豆蔻主要活性成分含量的方法，该方法利用超声波作为辅助工具，包括取样、样品制备、溶剂超声波辅助浸提、紫外检测、主要活性成分含量的计算等步骤。能够完全快速的提取草豆蔻主要活性成分并加以测定。该方法应用草豆蔻的紫外光谱测试体系，实现了对草豆蔻的主要活性成分山姜素和小豆蔻明浓度的快速定量检测。该方法操作简单，测定结果准确，不易受到其它物质成分的干扰。

Description

利用紫外分光光度法测定草豆蔻主要活性成分含量的方法

技术领域

本发明涉及测定草豆蔻主要活性成分含量的方法，属于分析化学领域，特别涉及紫外光谱法测定草豆蔻主要活性成分含量的相关技术。

背景技术

草豆寇为姜科(Zingiberaceae)山姜属植物草豆蔻(Alpinia katsumadaiHayata)的干燥种子团,为较常用中药，主产于广东、广西和云南等地,具有燥湿,健脾,温胃止呕的功能,主治寒湿内阻,肮腹胀满冷痛,暖气呕逆,不思饮食等病症。草豆蔻是傣药品种之一，根茎可治因风湿引起的各种酸痛。草豆蔻的提取物具有明显的抗氧化性作用。

草豆蔻的成分主要含挥发油与黄酮类成分，山姜素和小豆蔻明是其的有效成分。山姜素，分子式：C₁₆H₁₄O₄。化学名称：7-羟基-5甲氧基二氢黄酮(7-hydroxy-5-methoxy-flavanone)，小豆蔻明，分子式：C₁₆H₁₄O₄。化学名称：2’，4’-二羟基-6’-甲氧基查耳酮（2’,4’-dihydroxy-6’methoxy-chalcone）。而目前常采用于测定草豆蔻主要成分山姜素和小豆蔻明含量的技术方法为：高效液相色谱，薄层色谱法和胶束电动毛细管色谱法。这几种方法中，高效液相色谱法操作条件不易控制且较繁琐，时间过长。薄层色谱法样品用量较大，分离手续麻烦，分离时间较长，并可能有杂质干扰。而胶束电动毛细管色谱法容易产生气泡，柱子易断，检测灵敏度低，填料种类有限等。为了解决这些问题，就必须改善现有的技术，使其具备操作简单，准确快速可行的方法。并且在将草豆蔻制成现代化中药制剂的生产过程中，快速准确的测定其浓度是非常重要的一个步骤，所以本发明提供的方法就可以快速的完成这个检测任务。

发明内容

本发明的目的在于针对以上现有技术的不足，提供一种方法简单、准确性高，易操作的紫外光谱法测定草豆蔻主要活性成分山姜素和小豆蔻明的含量测定的方法。

本发明的技术方案是：

一种利用紫外分光光度法测定草豆蔻主要活性成分含量的方法，包括标准样品溶液的制备，标准曲线线性回归方程的获得，待测样品的制备，紫外检测及浓度的计算，所述的待测样品的制备，紫外检测及浓度的计算包括如下步骤：

a. 待测样品的制备：将草豆蔻样品烘干，分别用粉碎机粉碎后过目筛，精确称取草豆蔻粉末5g,置于试剂瓶中加95%乙醇定容100mL，超声溶解，再放置过夜，过滤，取续滤液过微孔滤膜，最后的滤液分装备用；

b. 待测样品的紫外检测：采用紫外分光光度法测定草豆蔻溶于95%乙醇的样品提取液在286nm和346nm处的吸光度；

c. 待测样品浓度的计算：将“b”步骤测得的草豆蔻样品溶液分别在286nm和346nm处的吸光度平均值作为山姜素和小豆蔻明含量的测定值，代入标准曲线线性回归方程，计算出待测样品中山姜素和小豆蔻明的含量。

待测样品溶液用紫外分光光度计测定样品在286nm和346nm处的吸光度，取平均值代入山姜素和小豆蔻明的标准曲线方程求出回归值，即为样品溶液山姜素和小豆蔻明的浓度C，草豆蔻样品中山姜素和小豆蔻明的含量为(C×V／W) ×100%，其中V是草豆蔻粉末加入95%乙醇定容的体积，W是待测草豆蔻样品的干重。

本发明方法中所诉的超声波作为辅助工具超声溶解即为将定容好的待测样品放置于超声波仪中，超声消解30~50min。

本发明所述的标准样品溶液的制备包括以下步骤：用95%乙醇分别配制1.0×10^-3mol·L^-1的山姜素和小豆蔻明标准溶液，再用95%乙醇分别稀释成多个不同浓度的标准样品溶液，即山姜素与小豆蔻明的线性范围分别为1.61~10.81µg·mL^-1 和 0.82~8.11µg·mL^-1。配制呈浓度梯度的标准样品溶液。

所述的标准曲线线性回归方程的获得是将线性范围内的以95%乙醇作溶剂的山姜素与小豆蔻明的浓度范围分别为1.61~10.81µg·mL^-1 和 0.82~8.11µg·mL^-1。配制的多个不同浓度的标准样品溶液分别采用紫外分光光度法进行检测，检测波长为山姜素是286nm，小豆蔻明是346nm，将所得的吸光度值及对应的浓度绘制标准曲线，并根据郎伯-比尔定律A=kcb计算获得标准曲线回归方程

A：吸光度

K：摩尔吸收系数

C：待测物质的浓度，单位可为g/L，mol/L

B：吸收介质的厚度，一般以cm为单位。

本发明所述的待测物为姜科植物草豆蔻，所测的部位可以是茎，叶，根，果实皮和种子等。所述的待测物优选海南白沙草豆蔻和霸王岭草豆蔻近成熟的干燥种子团，测定其中的山姜素和小豆蔻明含量。并且根据紫外光谱的“吸收最大，干扰最小”测定原则，而山姜素和小豆蔻明的最大紫外吸收波长相差达60nm，故可同时测定草豆蔻中山姜素和小豆蔻明成分的含量。

山姜素和小豆蔻明属于黄酮类，具有以下结构式：

山姜素

小豆蔻明。

本发明采用紫外分光光度法建立了一种操作简单的测定植物中主要成分含量的方法。该方法不需要用到复杂的仪器设备、昂贵和有毒的药品，只需要常规的紫外分光光度计和常规药品即可完成。

具体地，样品溶液的溶剂是水、乙醇、甲醇、异丙醇、正丁醇中的至少一种。

优选地，所述待测样品和标准样品溶液的溶剂是乙醇。

优选地，所述样品烘干温度为50 ~70℃。

优选地，所述样品烘干时间为4 ~6h。

优选地，所述过目筛粒度为40 ~60目。

优选地，所述样品超声溶解时间为30 ~50min。

优选地,所述微孔滤膜直径为0.25~0.45μm。

优选地，所述待测样品溶液原始浓度为5×10^-2g/mL，紫外检测时稀释按与溶剂比为10μL:3mL。

优选地,所述标准溶液的浓度为1.0×10^-3mol/L。

优选地,所述山姜素标准溶液浓度梯度为0.20×10^-5mol/L~10.0×10^-5mol/L。

优选地，所述小豆蔻明标准溶液浓度梯度为0.10×10^-5mol/L~8.0×10^-5mol/L。

优选地，所述测定待测物吸光度时紫外波长为286±1nm和346±1nm。

本发明提供的草豆蔻主要活性成分山姜素和小豆蔻明的含量测定方法的回收率高，结果准确。实验结果表明回收率的范围在84.28～117.41%。另外，本发明提供的方法具有良好的精密度、稳定性和重复性。

精密度：准确移取样品溶液60μL，按紫外条件重复测定3次，得到相对标准偏差RSD值分别为0.42%、0.29%，表明仪器的精密度良好。

稳定性：取同一样品溶液10μL，按紫外条件在24h内测定。白沙草豆蔻以95%乙醇为溶剂的山姜素与小豆蔻明吸光度的RSD 分别为0.21%，0.59%。霸王岭草豆蔻以95%乙醇为溶剂的山姜素和小豆蔻明吸光度的RSD分别为0.11%，0.25%。结果表明样品溶液在24h内稳定。

重现性：白沙草豆蔻以95%乙醇为溶剂的山姜素与小豆蔻明吸光度的RSD 分别为1.91%，1.75%。霸王岭草豆蔻以95%乙醇为溶剂的山姜素和小豆蔻明吸光度的RSD分别为2.46%，4.70%。表明重现性好。

附图说明：

图1为本发明实施例1山姜素标准溶液浓度与吸光度的线性关系图；

图2为本发明实施例2小豆蔻明标准溶液浓度与吸光度的线性关系图；

图3为本发明实施例3标准溶液与不同草豆蔻样品紫外光谱图；

具体实施方式

以下通过具体实例进一步说明本发明。但实施例的具体细节仅用于解释本发明，不应理解为对本发明总的技术方案的限定。其中需要特别说明的是草豆蔻分别购于海南白沙和霸王岭。

为了便于对草豆蔻主要活性成分山姜素和小豆蔻明含量的测定，本发明优选对得到的草豆蔻样品进行前处理，具体包括以下步骤：

将草豆蔻样品进行烘干、粉碎，得到草豆蔻样品粉末。所述的烘干温度优选为50～70℃，更优选为60～65℃，所述的烘干时间优选为4～6h，更优选为4.5～5h，所述的过目筛粒度优选为40～60目，更优选为50～60目。

得到草豆蔻粉末配制成待测样品溶液，具体包括以下步骤：

将精确称取5g草豆蔻粉末置于试剂瓶中定容100mL，超声溶解，微孔过滤，分装备用。所述的超声溶解时间优选为30～50min，更优选为35～40min，所述的微孔过滤膜优选为0.25～0.45μm。

得到所述草豆蔻待测溶液，按待测样品与溶剂比为10μL:3mL进行稀释，检测待测样品，本发明优选采用紫外分光光度法检测所述待测样品，得到所述待测溶液的紫外光谱数据。所述的紫外检测波长优选为山姜素为286nm，小豆蔻明为346nm。

根据上述技术方案得到的紫外光谱数据和标准曲线，即可得到草豆蔻主要活性成分山姜素和小豆蔻明的含量。

在本发明中，所述标准曲线的获得包括以下步骤：

配制系列浓度的标准溶液；

检测得到系列浓度标准溶液的紫外光谱数据；

根据所述紫外光谱数据及系列浓度绘制标准曲线。

本发明中所述标准溶液优选95%乙醇溶液，配制成标准物质的储备液，使用时将得到的储备液稀释成多个不同浓度的标准溶液，山姜素标准溶液浓度优选为0.20×10^-5mol/L~10.0×10^-5mol/L，更优选为0.60×10^-5mol/L~4.0×10^-5mol/L，小豆蔻明标准溶液浓度优选为0.10×10^-5mol/L~8.0×10^-5mol/L，更优选为0.3×10^-5mol/L~3.0×10^-5mol/L。

将得到系列浓度的标准溶液优选紫外光谱检测，检测过程与上述技术方案中待测样品的检测过程相同。

根据上述技术方案中的检测过程，得到系列浓度标准溶液的紫外光谱数据，根据所述的紫外光谱数据及其对应的浓度绘制标准曲线，所述的标准曲线优选线性标准曲线。

根据上述技术方案得到的草豆蔻样品溶液的紫外光谱数据和标准曲线线性方程，经过计算可得到草豆蔻主要活性成分山姜素和小豆蔻明的质量，再将所述的山姜素和小豆蔻明的质量除以草豆蔻样品的干重，得到草豆蔻主要活性成分中山姜素和小豆蔻明的含量。

本发明中，对海南白沙草豆蔻和霸王岭草豆蔻中山姜素和小豆蔻明的含量进行测定，均得到了准确的结果，实验结果表明回收率的范围在84.28～117.41%。另外，本发明提供的方法具有良好的精密度、稳定性和重复性。

为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的利用紫外分光光度法测定草豆蔻主要活性成分含量的方法进行详细描述，但不能将它们理解为本发明保护范围的限定。

实施例1：

山姜素标准曲线线性回归方程的建立

（1）配制山姜素标准溶液：精确称取山姜素0.0135g，用95%乙醇分别配制成浓度都为1.0×10^-3mol/L的标准样品溶液。使用时再稀释成适当的不同浓度；

（2）标准曲线线性回归方程的获得：将上诉多个不同浓度的标准样品溶液分别采用紫外分光光度法进行测定，检测波长为山姜素为286nm，将得到的吸光度绘制成标准曲线，并根据郎伯-比尔定律计算获得标准曲线线性回归方程（如图1所示）。

实施例2：

小豆蔻明标准曲线线性回归方程的建立

（1）配制小豆蔻明标准溶液：精确称取小豆蔻明0.0135g，用95%乙醇分别配制成浓度都为1.0×10^-3mol/L的标准样品溶液。使用时再稀释成适当的不同浓度；

（2）标准曲线线性回归方程的获得：将上诉多个不同浓度的标准样品溶液分别采用紫外分光光度法进行测定，检测波长为小豆蔻明为346nm，将得到的吸光度绘制成标准曲线，并根据郎伯-比尔定律计算获得标准曲线线性回归方程（如图2所示）。

实施例3

紫外光谱法测定白沙草豆蔻和霸王岭草豆蔻中山姜素与小豆蔻明含量方法的建立

1. 配制待测样品：将白沙草豆蔻样品和霸王岭草豆蔻样品从-80度冰箱取出，去皮，留种子团，置于60℃烘箱中烘干，然后分别用粉碎机粉碎后过50目筛，精确称取白沙草豆蔻和霸王岭草豆蔻粉末5g,置于试剂瓶中加95%乙醇定容100mL，超声溶解40min，再放置过夜，过滤，取续滤液过0.25µm微孔滤膜，最后的滤液分装备用；

2. 测样品的测定：每份待测样品再分别吸取10μL定容至3mL，再转入石英比色皿中，紫外检测操作与实施例1和实施例2相同，用紫外分光光度计测定在286nm和346nm处的吸光度值，紫外图谱如图3所示；

3. 待测样品浓度的计算：将步骤2所得的平均值作为草豆蔻中山姜素和小豆蔻明含量的测定值，代入标准曲线线性回归方程，计算出待测样品中山姜素和小豆蔻明的浓度C。草豆蔻样品中山姜素和小豆蔻明的含量为(C×V／W) ×100%，其中V是草豆蔻粉末加入95%乙醇定容的体积，W是待测草豆蔻样品的干重；

按上述方法测定白沙和霸王岭草豆蔻样品。

本发明方法测定样品中山姜素和小豆蔻明含量，根据标准曲线方程以95%乙醇为溶剂的山姜素与小豆蔻明的回归方程分别为Y =18749.08261X -0.022797(r =0.99972, n=6),Y=29679.45143X-0.00932(r =0.99989, n=5)，结果如表1所示：

表1

药材来源	溶剂	山姜素的含量（%）	小豆蔻明的含量（%）	山姜素、小豆蔻明的总含量（%）
					白沙草豆蔻	乙醇	4.23%	3.83%	8.60%
霸王岭草豆蔻	乙醇	3.72%	3.34%	7.06%

Claims

1.利用紫外分光光度法测定草豆蔻主要活性成分含量的方法，包括标准样品溶液的制备，标准曲线线性回归方程的获得、待测样品的制备、紫外检测及浓度计算，其特征在于所述的待测样品的制备、紫外检测及浓度计算包含如下步骤：

a.待测样品的制备：将草豆蔻样品烘干，用粉碎机粉碎后过目筛，精确称取草豆蔻粉末5g，置于试剂瓶中加95％乙醇定容100mL，超声溶解，再放置过夜，过滤，取续滤液过微孔滤膜，最后的滤液分装备用；

b.待测样品的紫外检测：采用紫外光谱法测定草豆蔻样品提取液在286nm和346nm处的吸光度；

c.待测样品浓度的计算：将“b”步骤测得的草豆蔻样品溶液分别在286nm和346nm处的吸光度平均值作为山姜素和小豆蔻明含量的测定值，代入标准曲线线性回归方程，计算出待测样品中山姜素和小豆蔻明的含量；

所述的标准样品溶液的制备包括以下步骤：精确称取山姜素标准品适量，用95％乙醇配置成浓度都为1.0×10^-3mol/L的标准品溶液，使用时配制成山姜素浓度为0.20×10^- ⁵mol/L～10.0×10^-5mol/L标准溶液；精确称取小豆蔻明标准品适量，用95％乙醇配置成浓度都为1.0×10^-3mol/L的标准品溶液，使用时配制成小豆蔻明浓度为0.10×10^-5mol/L～8.0×10^-5mol/L标准溶液；

所述的标准曲线线性回归方程的获得是将在线性范围内的多个不同浓度的标准样品溶液分别采用紫外分光光度法进行检测，检测波长为山姜素是286nm，小豆蔻明为346nm，将得到的标准样品溶液吸光度绘制标准曲线，并根据郎伯-比尔定律计算获得标准曲线线性回归方程。

2.权利要求1所述的方法，其特征在于步骤“a”所述的超声溶解的时间为超声溶解30～50min。

3.权利要求1所述的方法，其特征在于步骤“a”所述烘干的温度为50～70℃。

4.权利要求1所述的方法，其特征在于步骤“a”所述烘干的时间为4～6h。

5.权利要求1所述的方法，其特征在于步骤“a”所述过目筛的粒度为40～60目。

6.权利要求1所述的方法，其特征在于步骤“a”所述微孔滤膜的直径为0.25～0.45μm。