CN104568930B - 一种测定茶叶和茶制品儿茶素含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种测定茶叶和茶制品儿茶素含量的方法，该方法是采用间苯二酚替代儿茶素对照品配制成梯度标准溶液，将茶叶或茶制品制成待测液，在盐酸‑香草醛显色体系于510nm波长下，测定梯度标准溶液的吸光度，建立以摩尔浓度为横坐标的标准曲线并确定回归方程，再测定待测液吸光度，从回归方程求得待测液的间苯二酚单元浓度，然后根据稀释倍数、儿茶素对照品的单位相对分子质量包含的间苯二酚单元数和校正因子计算出茶叶或茶制品中的儿茶素含量；本发明所用间苯二酚性质稳定、易得且价格低廉，可解决儿茶素对照品来源受限、价格昂贵及测定成本高的问题，且操作简单、结果准确、重复性好。

Description

一种测定茶叶和茶制品儿茶素含量的方法

技术领域

本发明涉及一种用于茶叶和茶制品儿茶素含量的测定方法。

背景技术

茶叶中的儿茶素类化合物是茶叶中含量较为丰富的一类功能性活性成分，具有广泛的保健和药理功效以及较强的食品抗氧化特性，茶叶和茶制品中儿茶素现已成为医药和食品领域研究的热点之一。

现代科学已证明，儿茶素是一组具有环烷-3-醇结构的植物多酚，其总量约占茶多酚的65~80%，主要包括儿茶素（C）、表儿茶素（EC）、棓儿茶素(GC)、表棓儿茶素(EGC)、儿茶素棓酸酯(CG)、表儿茶素棓酸酯(ECG)、棓儿茶素棓酸酯(GCG)、表棓儿茶素棓酸酯(EGCG)等【Irena Vovk,et al, Separation of eight selected flavan-3-ols on cellulosethin-layer chromatographic plates (J). Journal of Chromatography A, 2005,1077 (6):188-194】。

儿茶素含量不仅是衡量茶叶及茶制品质量的重要指标，也是判断其药用价值的重要依据，还用于茶树多酚代谢的生理调控机制的研究。因此，建立准确、高效、便捷和低成本的儿茶素测定方法非常重要也显得十分迫切【Marina Naldi, et al. UHPLCdetermination of catechins for the quality control of green tea (J). Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2014, 88(25):307-314】。

目前，茶叶及茶制品中多酚类物质的测定方法主要有两大类【王丽丽等，茶叶中茶多酚检测方法研究进展（J），茶叶科学技术，2013（4）：6-12 】。一类是多酚总量测定法，主要有分光光度法（酒石酸亚铁比色法，福林酚比色法）、氧化滴定法、原子吸收分光光度法、近红外光谱法和电化学分析法等。这类方法的问题是不能测定儿茶素总量更不能分别测定儿茶素的组分含量。另一类是茶多酚组分测定法，主要有特殊显色体系的分光光度法（香草醛法和4-二甲基氨基肉桂醛法等）、高效液相色谱法(HPLC)、液质联用分析法和毛细管电泳法等。这类方法能分别测定儿茶素中单个组分的含量（如HPLC和毛细管电泳法），特殊显色体系分光光度法则只能测定儿茶素的总量。因此，目前测定儿茶素组分的首选方法为HPLC法，我国现行测定茶叶中儿茶素组分及咖啡碱（CAF）的最新国家标准GB/T8313-2008也是HPLC法。该法的问题是涉及柱层析分离，流动相组成复杂、操作繁琐、分析时间长，更大的问题是仪器昂贵，操作技能要求高，并需采购各种价格昂贵的儿茶素标准品，这些因素都会导致测定成本过高，不能满足中小型生产企业和茶产品贸易过程对儿茶素指标的例行和快速测定需求。目前，鉴于HPLC法测定儿茶素存在的问题，特殊显色体系的分光光度法仍然是茶叶及茶制品儿茶素测定中被广泛使用的方法，这种方法是在酸性条件下，香草醛转变成阳离子分子，可与儿茶素中黄烷-3-醇结构中A环的间苯二酚或间苯三酚亲核位点结合形成有色物质，得以实现分光光度法测定【Price M L et al,Aritical evaluation of the vanillinreaction as an assay for tannin in sorghum gain (J).Journal of Agriculture and Food Chemistry,1978,26(5):1214-1248】。

在这种方法中，显色反应只针对儿茶素分子中的间苯二酚或间苯三酚结构（见式I），具有一定的选择性和特异性。这种方法虽然可用分光光度法测出儿茶素的总量，但测定中仍需使用高纯度儿茶素或儿茶素单个组分，如EC、EGC、EGCG对照品先建立标准曲线。与HPLC法类似，也存在儿茶素对照品来源有限、价格昂贵和测定成本高的问题。

面对以上现实，另辟蹊径地采用替代对照品的测定方法必然引起人们的重视。虽然，目前在天然产物和药物定性鉴别和定量测定中对照品仍然是必不可少的标准物质，但如果对照品存在稳定性差、毒性强、来源有限、制备成本高等“先天不足”的原因，必将导致对照品价格昂贵以及使用不便和测定成本高的问题。如此一来，采用替代对照品进行测定自然地就成为解决这类问题的一种有效途径【Xie Y C et al. Determination of radixsalvise multionhizae and compound tablet of Danshen By substitute referencesubstance[J].Chin J Pharm Anal,2007,27(4):497-502】。目前，文献中已有了一些利用替代对照品实现相关成分测定的成功范例，《欧洲药典》5.0中将大蒜辣素列为大蒜粉质量的控制指标，并采用羟基苯丁酯做为大蒜辣素的替代对照品，从而解决了大蒜素不稳定，作为对照品难于制备和使用的难题【European Pharmacopoeia commission, EuropeanPharmacopoeia 5.0 [S].Stresbourg:Councill of Europe,2006:1651】。王永生等则采用苏丹I作为替代对照品建立了测定样品中番茄红素的HPLC-UV新方法，大大降低了分析检测的成本【王永生，发酵法生产番茄红素[D].北京：北京化工大学，2003】。

为解决目前茶叶及茶制品中仍广泛使用的盐酸-香草醛显色分光光度法存在儿茶素对照品来源受限、价格昂贵及测定成本高的问题，受到香草醛儿茶素显色反应对儿茶素中间苯二酚或间苯三酚选择性识别化学原理的启发，得益于前人关于天然产物和药物检测中建立替代对照品检测方法的积累。经研究发现，在传统的盐酸-香草醛-儿茶素显色反应条件下，间苯二酚也可发生显色反应，其显色产物的紫外可见吸收曲线与对照品（EGCG等）相似(见图1)，且有较大的摩尔吸收系数和显色灵敏度(图2)。这就为间苯二酚作为盐酸-香草醛显色分光光度法测定茶叶及茶制品中儿茶素总量的方法中作为对照品（如EGCG）的替代物奠定了较为坚实的的化学基础和光谱学依据。随后，我们以间苯二酚为替代对照品，确定了稳定且有效的盐酸-香草醛显色反应体系和条件，确定了稳定且可靠的分光光度法测定方法和条件，确定了校正因子f并考察了校正因子的耐用性，确定了该法对儿茶素总量测定结果的计算公式。通过方法考证，证明该方法操作简单、精密度高、准确性好、重现性强，非常适用于茶叶及茶制品中儿茶素总量的测定。目前，利用间苯二酚作为EGCG等儿茶素对照品的替代对照品通过盐酸-香草醛显色测定茶叶及茶制品中儿茶素总量的方法国内外均未见报道。

发明内容

本发明提供了一种测定茶叶和茶制品儿茶素含量的方法，该方法是以间苯二酚作为EGCG等儿茶素对照品的替代对照品的盐酸-香草醛显色分光光度法，可简便、快速、准确和低测定成本地测定茶叶及茶制品中的儿茶素总量，以解决现有盐酸-香草醛显色分光光度法和HPLC法存在对照品来源有限、价格昂贵和测定成本高的问题，也可为天然产物中与儿茶素化学结构类似的复杂化合物的检测提供参考。

本发明方法是采用间苯二酚替代儿茶素对照品配制成梯度标准溶液，将茶叶或茶制品制成待测液，在盐酸-香草醛显色体系于510nm波长下，测定梯度标准溶液的吸光度，建立以摩尔浓度mmol/L为横坐标的标准曲线并确定回归方程A =kc+b，再测定待测液吸光度，从回归方程求得待测液的间苯二酚单元浓度，然后根据稀释倍数、儿茶素对照品的单位相对分子质量包含的间苯二酚单元数N和校正因子f计算出茶叶或茶制品中的儿茶素含量Q 。

本发明方法的具体步骤如下：

A、标准曲线和校正因子f的测定

将儿茶素对照品和替代对照品间苯二酚分别配制成浓度20mg/L~500mg/L的对照品和替代对照品标准溶液储备液，从中分别移取0.1~1.0mL，用盐酸-香草醛显色体系显色后在510nm波长处测定吸光度A，并绘制以摩尔浓度为横坐标的标准曲线，得到回归方程，获取其斜率k和b值，并按下式采用作图法测定获得校正因子f：

其中，A为吸光度，C为摩尔浓度mmol/L，下标i表示替代对照品间苯二酚，下标j表示儿茶素对照品，用Ai/Ci对Aj/Cj作图（以采用替代对照品测得的吸光度数据Ai除以对应的浓度数据Ci所得数据为纵坐标值，以采用儿茶素对照品测得的吸光度数据Aj除以对应的浓度数据Cj所得数据为横坐标值，即可完成作图），其斜率值即为校正因子f值；

B、待测样品的前处理

不同类型的待测样品分别按下述方法进行前处理：

（1）茶叶样品:准确称取1.5g茶叶粉末，置于锥形瓶中加入质量百分比浓度为60%的乙醇60mL回流提取60分钟后得到提取液，蒸发除去大部分溶剂后，高速离心后用沙芯漏斗过滤后分离出提取液，将其用质量百分比浓度为60%乙醇定容至25mL即为待测液；

（2）茶叶提取物样品:准确称取20~100mg的茶叶提取物（茶多酚）样品，加水50mL用超声辅助溶解后用水定容到100mL即为待测液；

（3）茶饮料样品:将茶饮料样品用0.45μm滤膜过滤即得待测液；

C、待测样品的测定

取待测液1mL，按制定标准曲线相同的测定步骤测定吸光度A；

儿茶素含量计算

待测样品中儿茶素含量的测定值按下式计算:，

其中，Ｑ为儿茶素总含量，mg/g；ｆ 为校正因子； A为待测样品溶液的吸光度；l为待测样品溶液的体积，L； n为待测样品溶液的稀释倍数；m为茶叶或茶叶提取物的干质量，g； b为标准曲线截距；k为标准曲线的斜率 L/mmol；N为儿茶素对照品的单位相对分子质量所含间苯二酚单元个数，即；当样品为茶饮料时，式中Q的单位为mg/L，m为1×10^-3 L。

所述盐酸-香草醛显色体系是质量百分比浓度4%的香草醛甲醇溶液与盐酸混合制得，其中香草醛在显色反应液中的质量占比为0.5~3%，盐酸在显色反应液中的体积占比为5~40%，常温条件下显色反应时间为15~20分钟。

所述儿茶素对照品为儿茶素、表儿茶素、棓儿茶素、表棓儿茶素、儿茶素棓酸酯、表儿茶素棓酸酯、棓儿茶素棓酸酯或表棓儿茶素棓酸酯。

所述标准曲线采用横坐标单位为mmol/L制定，以EGCG对照品校正时所述校正因子f取0.82，所述EGCG单位相对分子质量所含间苯二酚单元数N _EGCG 为2.2×10^-3 。所述儿茶素含量计算公式中需采用N _EGCG 值折算和f值修正。

所述待测的含儿茶素质样品为茶叶提取物粉末（茶多酚I和茶多酚II、绿茶（普洱生茶）、红茶（滇红）、绿茶饮料和乌龙茶饮料。

采用上述技术方案，本发明实现了对现有盐酸-香草醛法的改进。与现有技术相比，本

发明提供的方法具有以下优点：

（1）采用性质稳定、容易制备高纯物，且在试剂市场上容易采购、价格低廉的高纯间苯二酚来替代来源缺乏、制备困难且价格昂贵的EGCG、EC、ECG；（2）通过显色体系和测定条件的优化、标准准曲线采用横坐标单位为mmol/L制定，儿茶素含量计算公式中采用N _EGCG 值折算和f值修正等技术手段，可在接近传统盐酸-香草醛法的条件下低成本地实现对茶叶、茶叶提取物和茶饮料在常温常压下的快速测定，其测定结果准确，重现性好，是对目前广泛使用的盐酸-香草醛法和HPLC法测定茶产品中儿茶素含量方法的重要补充；（3）本发明相对于现在广泛采用的儿茶素测定方法，其测定成本大大降低，且操作简单、准确度高且结果重复性好，特别适合不具备HPLC仪器、无法承受昂贵儿茶素标准品购买带来的资金压力的中小型企业和贸易公司，在茶产品生产和商贸过程中对相关原料、中间和终端产品中儿茶素指标的例行测定和质量监控。

附图说明

图1是EGCG（曲线1）和间苯二酚(曲线2)的盐酸-香草醛显色产物的紫外可见吸收曲线图；

图2是梯度浓度间苯二酚经盐酸-香草醛显色后绘制的以摩尔浓度为横坐标的标准曲线图；

图3是以EGCG为对照品以间苯二酚为替代对照品绘制的Ai/Ci～Aj/Cj图（直线斜率为校正因子f值）；

图4是香草醛浓度对吸光度的影响图；

图5是盐酸浓度对吸光度的影响图；

图6是显色反应时间对吸光度的影响图；

图7是茶叶提取物粉末（茶多酚I）水溶液(曲线1)和是普洱生茶乙醇提取液（曲线2）/盐酸-香草醛显色产物的紫外可见吸收曲线图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明保护的范围不限于此实施例。

实施例1：利用间苯二酚作为儿茶素（以EGCG为例）替代对照品测定茶叶和茶制品中儿茶素总量的盐酸-香草醛分光光度法按以下步骤建立：

1、间苯二酚替代对照品与儿茶素对照品的光谱学比较

间苯二酚性质稳定，容易获得高纯物，在化学试剂市场很容易采购到高纯产品且价格较低。经测定EGCG和间苯二酚经盐酸-香草醛显色后的紫外可见吸收曲线（图1）发现，在440~600nm的波长范围，间苯二酚和EGCG与香草醛的缩合产物具有相似的光谱性质，显色灵敏度高。在后续的标准曲线测定中发现间苯二酚显色产物的吸光度与其摩尔浓度满足线性回归方程A = Kc+ b，相关系数大于0.999，且b值很小（标准曲线过原点）。

上述结果为间苯二酚作为EGCG的替代品进行茶叶及茶产品中儿茶素含量进行盐酸-香草醛显色光度法测定提供了依据。但是，由于间苯二酚与EGCG作为标准品相比还是存在显著差别，主要表现在:（1）间苯二酚与EGCG的相对分子质量M(分别为110和456)和单位相对分子质量所含间苯二酚单元数N _间苯二酚 和N _EGCG （分别为9.1×10^-3和2.2×10^-3）存在明显差异，在盐酸-香草醛这样一种主要针对间苯二酚单元进行的显色反应中，必然带来显色和显色灵敏度的差异（图1）；（2）间苯二酚与盐酸-香草醛的显色产物的最大吸收波长与EGCG相比发生了红移。鉴于这些差异，需要对间苯二酚作为EGCG的替代对照品的测定结果加以必要的修正。可行的措施其一是采用摩尔浓度为横坐标单位制定标准曲线，测定出与样品中儿茶素相当的间苯二酚单元摩尔浓度，然后用N _EGCG 值折算成以EGCG为参照物的样品中所含儿茶素的质量；其二是利用间苯二酚和EGCG并行测定梯度摩尔浓度溶液的吸光度和摩尔浓度以确定校正因子f，并将其引入样品中儿茶素测定结果的计算式。通过这两个措施可较为满意地消除间苯二酚与EGCG标准品之间的差别引起的采用间苯二酚替代对照品与采用EGCG对照品对样品中儿茶素测定结果之间的差异。

2、显色体系和测定方法

2.1显色体系:预先配制质量百分浓度为4%的香草醛甲醇溶液，显色时与盐酸混合，其中香草醛在显色反应液中的质量占比为0.5~3%，盐酸在显色反应液中体积占比为5~40%。

2.2测定方法

（1）标准曲线与校正因子f的测定：将对照品(EGCG)和替代对照品(对苯二酚)配制成20mg/L~500mg/L的对照品和替代对照品标准溶液储备液，从中取0.1~1.0mL，分别移入铝箔遮光的比色管中，分别加水补足1mL后，移入6mL香草醛甲醇溶液和3mL浓盐酸摇匀，在20℃水浴中反应显色20分钟，在510nm波长下用752型紫外可见分光光度计测定吸光度A，并绘制以摩尔浓度(C，mmol/L)为横坐标的标准曲线（图2），得到回归方程并获取其斜率k和b值，然后将测定结果(A和C值)按下述步骤3中的方法测定校正因子f。

（2）样品待测液的制备及测定

茶叶样品：准确称取1.5g（m）茶叶粉末，置于100mL锥形瓶中加入质量百分比浓度为60%的乙醇60mL回流提取60分钟后，得到提取液，蒸发出去大部分溶剂后，高速离心后用沙芯漏斗过滤后分离出提取液，将其用质量百分比浓度为60%的乙醇定容至25mL，移取1mL，按2.2（1）中的方法测定吸光度A，用式（2）计算儿茶素含量。

茶叶提取物粉末（茶多酚）样品：准确称取20~100mg（m）的茶多酚样品，加水50mL，用超声辅助溶解后用水定容到100mL，移取1mL，按2.2(1)中的方法测定吸光度A，用式（2）计算儿茶素含量。

茶饮料样品:将茶饮料样品用0.45μm滤膜过滤后直接移取滤液1mL，按2.2(1)中的方法测定吸光度A，用式（2）计算儿茶素含量，但式中Q的单位为mg/L，m为1×10^-3L。

3、校正因子的确定及耐用性考察

为消除替代对照品测定结果与对照品测定结果之间的差异，需测定校正因子f，其测定公式为：

式（1）

其中，A为吸光度，C为摩尔浓度，下标i表示替代对照品（间苯二酚），下标j表示对照品(EGCG)，可以用Ai/Ci对Aj/Cj作图，其斜率值即为校正因子f值(图3)。

在测定校正因子f值的过程中，重点考察了其耐用性，即在盐酸-香草醛显色条件有小的波动时考察f值受影响的程度，f值的耐用性考察结果如下：

（1）香草醛在显色反应液中的质量占比对f值测定的影响

在香草醛质量占比1%~3%之间分别于1%、1.5%、2%和3%测定校正因子f，结果显示香草醛质量占比在这个浓度范围内的波动对校正因子影响不大，RSD为1.2%；

（2）盐酸在显色反应液中体积比占比对f值测定的影响

在盐酸体积占比10%~40%之间分别于10%、15%、20%、30%和40%下测定校正因子f，结果显示在盐酸体积占比在这个浓度范围内的波动对校正因子影响不大，RSD为1.5%；

（3）显色反应时间对f值测定的影响

在显色反应时间10~20分钟之间分别于10、15和20分钟测定校正因子f，结果显示在盐酸体积占比在这个浓度范围内的波动对校正因子影响稍大，RSD为2.0%。因此在实际测定中显色反应时间不能波动过大。

4、测定结果的计算公式

测定结果的计算公式如下：

（式2）

式中：Ｑ为儿茶素总量，mg/g；ｆ为校正因子；A为样品溶液测定的吸光度；l为样品溶液体积，L； n为测定中试液的稀释倍数；m为茶叶或茶多酚样品的干质量，g；b为标准曲线截距；k为标准曲线的斜率 L/mmol；N _EGCG 为对照品EGCG的单位相对分子质量所含间苯二酚单元个数，2.2 ×10^-3（EGCG相对分子质量为456，每个EGCG分子含间苯二酚单元1个，N _EGCG =1/456 = 2.2 ×10^-3）。当样品为茶饮料时，式中Q的单位为mg/L，m为1×10^-3 L。

5、精密度实验和重复性实验

取含间苯二酚10mg/L（0.0908mmol/L）的替代品标准溶液，重复测定5次吸光度，结果表明RSD为0.8%。

取茶叶提取物（I），采用替代对照品间苯二酚测定其儿茶素总含量，平行测定5次，计算得到标示含量为46.0%，RSD=1.5%。

6、回收率实验

取茶叶提取物（I）配制成250mg/L和300mg/L的水溶液100mL，分别加入间苯二酚替代对照品标准溶液0.2、0.3、0.4mL及0.25、0.50、0.75mL，测得加标回收率分别为103.2%、101.0%、106.8%和104.8%、105.1%、96.1%。

实施例2：本实施例对本发明提供的方法中盐酸-香草醛显色反应体系进行了优化，具体步骤如下：

（1）替代对照品和对照品标准溶液的配制

取高纯间苯二酚（纯度≥99.5%，HPLC级）和EGCG（标准品）各10mg溶解并定容于50mL蒸馏水中，配制成200mg/L的替代对照品和对照品的标准溶液储备液。测定中移取一定量的标准溶液储备液稀释定容制成梯度浓度的溶液用于标准曲线和f值的测定以及显色反应体系的优化。

(2)显色剂的配制

将香草醛（分析纯）用甲醇溶解配制成4%（质量百分浓度），显色时与盐酸混合。其中，香草醛在显色反应液中的质量占比为0.5~3%，盐酸在显色反应液中体积比占5~40%。

（3）显色体系最佳香草醛浓度的确定

在控制盐酸在显色反应液中体积占比为30%时，改变显色体系中香草醛的在显色反应液中的质量占比0.3%，0.5%，1.0%，1.5%，2%，2.5%，3%，分别测定吸光度A(显色反应时间20分钟/20℃)，确定出1.5%为最佳香草醛浓度(见图4)。

（4）显色体系最佳盐酸浓度的确定

在控制香草醛在显色反应液中质量占比为1.5%时，改变显色体系中盐酸在显色反应液中的体积占比5%，10%，15%，20%，30%，40%，分别测定吸光度A (显色反应时间20分钟/20℃)，确定出15%为最佳盐酸浓度(见图5)。

（5）显色体系最佳反应时间的确定

在控制香草醛在显色反应液中质量占比为1.5%、盐酸在显色反应液中体积占比为15%、显色反应温度为20℃时，测定吸光度A与显色反应时间的关系曲线，从中确定出15~20分钟为最佳反应时间(见图6)。

实施例3：本实施例对本发明提供的方法与其它方法测定茶叶提取物（茶多酚I）中儿茶素含量结果进行了比较，具体步骤如下：

(1)本发明建立的方法

分别准确称取茶叶提取物粉末（茶多酚I）样品20mg，30mg，40mg，50mg，60mg，加水50mL，用超声辅助溶解后用水定容到100mL，移取1mL，按实施例1中2.2(1)中的方法测定吸光度A(紫外可见吸收曲线见附图7曲线1)，以间苯二酚标准曲线数据，用式（2）（f取0.82）求得其平均儿茶素含量为460.0mg/g，RSD=1.6%。

(2)EGCG为对照品的盐酸-香草醛法

分别准确称取茶叶提取物粉末20mg，30mg，40mg，50mg，60mg茶叶提取物粉末（茶多酚I）样品，加水50mL，用超声辅助溶解后用水定容到100mL，移取1mL，按实施例1中2.2(1)中的方法测定吸光度A，利用EGCG标准曲线数据求得其平均儿茶素含量为465.0 mg/g，RSD=1.3%。

同时，茶多酚(I)的总儿茶素含量的HPLC测定值为455.3mg/g。通过与其它方法的比较,本实施例测定结果介于EGCG为对照品的盐酸-香草醛法和HPLC法之间。但所用替代对照品间苯二酚（纯度≥99.5%，HPLC级）价格最低（约100~300元/25g），而另外两种方法所用的EGCG（纯度≥99.5%，HPLC级）等标准品则价格昂贵（约1元/mg，折合1000元/g），本发明的方法无疑在测定成本上有较大的优势。

实施例4：本实施例对本发明提供的方法与其它方法测定茶叶提取物（茶多酚II）中儿茶素含量结果进行了比较，具体步骤如下：

分别准确称取茶叶提取物粉末（茶多酚II）样品20mg，30mg，40mg，50mg，60mg，加水50mL，用超声辅助溶解后用水定容到100mL，移取1mL，按实施例1中2.2(1)中的方法测定吸光度A，以间苯二酚标准曲线数据，用式（2）（f取0.82）求得其平均儿茶素含量为746.7mg/g，RSD=1.8%。与此同时，用EGCG对照品盐酸-香草醛法测得其儿茶素含量为758.9mg/g，RSD=1.5%。

实施例5：本实施例对本发明提供的方法与其它方法测定普洱生茶（绿茶）中儿茶素含量结果进行了比较，具体步骤如下：

准确称取1.5g普洱茶叶粉末（由普洱生茶茶饼研碎过20目筛制得），置于100mL锥形瓶中加入60%的乙醇60mL回流提取60分钟后，得到提取液，蒸发出去大部分溶剂后，高速离心后将提取液用60%乙醇定容至25mL，移取1mL，按实施例1中2.2(1)中的方法测定吸光度A(紫外可见吸收曲线见附图7曲线2)，以间苯二酚标准曲线数据，用式（2）(f取0.82）)求得儿茶素含量为78.2mg/g，同时，用EGCG对照品盐酸-香草醛法测得其儿茶素含量为80.9mg/g。

实施例6：本实施例对本发明提供的方法与其它方法测定红茶中儿茶素含量结果进行了比较，具体步骤如下：

准确称取1.5g“滇红”红茶粉末（由风庆红茶研碎过20目筛制制得），置于100mL锥形瓶中加入60%的乙醇60mL回流提取60分钟后，得到提取液，蒸发出去大部分溶剂后，高速离心后将提取液用60%乙醇定容至25mL，移取1mL，按实施例1中2.2(1)中的方法测定吸光度A，以间苯二酚标准曲线数据，用式（2）（f取0.82）求得儿茶素含量为44.7mg/g，同时用EGCG对照品盐酸-香草醛法测得其儿茶素含量为为46.0mg/g。

实施例7：本实施例用本发明提供的方法测定绿茶饮料的儿茶素含量，具体步骤如下：

将市售绿茶饮料样品用0.45 μm滤膜过滤后直接量取滤液1mL，按实施例1中2.2(1)中的方法测定吸光度A， 以间苯二酚标准曲线数据，用式（2）（f取0.82）计算儿茶素含量（但式中Q的单位为mg/L，m为1×10^-3L），求得其儿茶素含量为168.1mg/L。

实施例8：本实施例用本发明提供的方法测定乌龙茶饮料中儿茶素含量，具体步骤如下：

将市售绿乌龙茶饮料样品用0.45 μm滤膜过滤后直接量取滤液1mL，按实施例1中2.2(1)中的方法测定吸光度A，以间苯二酚表准曲线数据，用式（2）（f取0.82）计算儿茶素含量（但式中Q的单位为mg/L，m为1×10^-3L），求得其儿茶素含量为90.6mg/L。

Claims (3)

1.一种测定茶叶和茶制品儿茶素含量的方法，其特征在于：该方法是采用间苯二酚替代儿茶素对照品配制成梯度标准溶液，将茶叶或茶制品制成待测液，在盐酸-香草醛显色体系于510nm波长下，测定梯度标准溶液的吸光度，建立以摩尔浓度mmol/L为横坐标的标准曲线并确定回归方程A =kc+b，再测定待测液吸光度，从回归方程求得待测液的间苯二酚单元浓度，然后根据稀释倍数、儿茶素对照品的单位相对分子质量包含的间苯二酚单元数N和校正因子f计算出茶叶或茶制品中的儿茶素含量；

回归方程中b为标准曲线截距；k为标准曲线的斜率，c为摩尔浓度，A为吸光度；

上述方法的具体步骤如下：

A、标准曲线和校正因子f的测定

将儿茶素对照品和替代对照品间苯二酚分别配制成浓度20mg/L~500mg/L的对照品和替代对照品标准溶液储备液，从中分别移取0.1~1.0mL，用盐酸-香草醛显色体系显色后在510nm波长处测定吸光度A，并绘制以摩尔浓度为横坐标的标准曲线，得到回归方程，获取其斜率k和b值，并按下式采用作图法测定获得校正因子f：

其中，A为吸光度，C为摩尔浓度mmol/L，下标i表示替代对照品间苯二酚，下标j表示儿茶素对照品，用Ai/Ci对Aj/Cj作图，其斜率值即为校正因子f值；

B、待测样品的前处理

不同类型的待测样品分别按下述方法进行前处理：

（1）茶叶样品:准确称取1.5g茶叶粉末，置于锥形瓶中加入质量百分比浓度为60%的乙醇60mL回流提取60分钟后得到提取液，蒸发除去大部分溶剂后，高速离心后用沙芯漏斗过滤后分离出提取液，将其用质量百分比浓度为60%乙醇定容至25mL即为待测液；

（2）茶叶提取物样品:准确称取20~100mg的茶叶提取物样品，加水50mL用超声辅助溶解后用水定容到100mL即为待测液；

（3）茶饮料样品:将茶饮料样品用0.45μm滤膜过滤即得待测液；

C、待测样品的测定

取待测液1mL，按制定标准曲线相同的测定步骤测定吸光度A；

D、儿茶素含量计算

待测样品中儿茶素含量的测定值按下式计算:，

其中，Ｑ为儿茶素总含量，mg/g；ｆ为校正因子；A为待测样品溶液的吸光度；l为待测样品溶液的体积，L； n为待测样品溶液的稀释倍数；m为茶叶或茶叶提取物的干质量，g； b为标准曲线截距；k为标准曲线的斜率 L/mmol；N为儿茶素对照品的单位相对分子质量所含间苯二酚单元个数，即；当样品为茶饮料时，式中Q的单位为mg/L，m为1×10^-3 L。

2.根据权利要求1所述的测定茶叶和茶制品儿茶素含量的方法，其特征在于：盐酸-香草醛显色体系是质量百分比浓度4%的香草醛甲醇溶液与盐酸混合制得，其中香草醛在显色反应液中的质量占比为0.5~3%，盐酸在显色反应液中的体积占比为5~40%，常温条件下显色反应时间为15~20分钟。

3.根据权利要求1所述的测定茶叶和茶制品儿茶素含量的方法，其特征在于：儿茶素对照品为儿茶素、表儿茶素、棓儿茶素、表棓儿茶素、儿茶素棓酸酯、表儿茶素棓酸酯、棓儿茶素棓酸酯或表棓儿茶素棓酸酯。