CN101224240A

CN101224240A - 一种具有降血糖作用的提取物、制备方法及其用途

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Publication number: CN101224240A
Application number: CNA2007101083016A
Authority: CN
Inventors: 周应军
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2007-01-17
Filing date: 2007-05-11
Publication date: 2008-07-23

Abstract

本发明涉及一种从植物中提取分离得到的药物组合物，包含其制剂的制备方法，用于治疗或预防糖尿病及其并发症。本发明提供的植物提取物由桑科桑属植物的叶通过提取分离得到的黄酮类和生物碱组份组成的，组合物中含黄酮类组份和生物碱组份的比例为0.5～10∶1。本发明提供的植物提取物较单一组份降低Ⅱ型糖尿病血糖作用更强。

Description

一种具有降血糖作用的提取物、制备方法及其用途

技术领域

本发明涉及一种从植物中提取分离得到的药物组合物，包含其制剂的制备方法，用于治疗或预防糖尿病及其并发症。

背景技术

桑科植物桑Morus alba L.的叶是传统入药的部位，民间入药中常用其他桑属植物鸡桑Morus australis Poir.、蒙桑M.mongolica Schnoid.、山桑M.bombycis koidz.、川桑M.notabilis Schne.、华桑M.cathayana Hensl.等的叶入药。国内外的大量文献叶也报道桑属植物具有很好的降血糖功能，其降血糖的机理研究表明主要与其中氮杂糖类生物碱物质密切相关。

桑属植物的叶中主要含有黄酮及其衍生物，香豆精衍生物，三萜类，生物碱类等。国内外的文献报道中，对桑叶水提物降血糖活性进行了大量研究，其提取物在心血管系统、血液系统、神经系统、泌尿系统和消化系统等都有显著的药理作用：其复方浓缩液对链脲霉素所致血糖升高及葡萄糖性高血糖都有较好的降血糖作用桑叶的水浸液对实验性糖尿病大鼠有明显的降血糖作用；桑叶粉饲料可使自然发病且症状类似成人型糖尿病和糖尿病并发症的大鼠空腹血糖值明显降低；桑叶提取物能阻止四氧嘧啶高血糖小鼠从饮食中摄入的淀粉和葡萄糖的高血糖反应；用50％桑属植物甲醇提取物可在大鼠小肠管实验中迅速抑制蔗糖吸收，显示对二糖类分解酶活性有抑制作用；桑属植物水提部分可作用于淀粉消化的最后阶段，对二糖酶(麦芽糖酶和乳糖酶)有明显的抑制作用，可能是控制餐后血糖的有效手段；从桑叶中分离出6种氮杂糖化合物，观察其对STZ引起的糖尿病小鼠，认为可能有不同成分通过增加胰岛素的释放和抑制2-糖苷酶活性的途径来起到降低血糖值的作用；亦有报道称从桑白皮中分离出的蛋白多糖，在腹腔给药后可以使正常小鼠血糖值和链脲霉素引起的高血糖降低49％～66％。；国外的文献报道亦表明以1-脱氧野尻霉素(DNJ)为主的氮杂糖类生物碱是降血糖的活性成分。

发明内容

本发明提供一种桑科桑属的叶为原料的药物组合物，该组合物由黄酮类组份和生物碱类组份构成，其比例可为0.5～10∶1。

其中当比例为4∶1时，降血糖作用最佳。

本发明首次指出从桑属植物叶中所得到的黄酮类组份和生物碱类组份组合较单一组份降低II型糖尿病小鼠血糖作用更有效。

本发明提供的降糖组合药物是由桑科桑属植物的叶通过提取分离得到的黄酮类和生物碱组份组成，其特征在于，所分离得到的组分中各组份按照质量百分比，黄酮类组份含量为50-80％，生物碱类组份含量为20-50％；其黄酮类组份中总黄酮部位含量50-95％，芦丁含量为5-20％；其生物碱类组份中氮杂糖类生物碱部位含量为50-95％，1-脱氧野尻霉素(DNJ)含量为5-30％。

本发明提供上述提取物主要组份的制备方法：

(1)将桑科桑属植物的叶粉碎后，加入水、含水醇或含0.001N-0.1N酸的上述溶剂，在30-100℃进行提取或渗漉，重复提取或渗漉1-4次，每次提取30-90分钟，过滤或离心除去药渣，药液浓缩至一定浓度，通过醇沉、絮凝等方法，沉淀杂质，过滤或离心除去沉淀，清液通过吸附柱色谱，水洗2-10柱体积，收集水洗液，浓缩，得药液1；

(2)用10-95％的醇液或0.001N-0.1N的氨水继续洗脱吸附柱色谱(大孔吸附树脂、聚酰胺等)，收集洗脱液，浓缩，干燥，得到黄酮类组份；

(3)将药液1通过阳离子交换柱色谱I，水洗，0.005-1N氨水洗脱，收集氨水洗脱液，浓缩，通过阳离子交换柱色谱II，水洗，0.005-1N氨水洗脱，收集氨水洗脱液，浓缩，干燥，得生物碱类组份。

本发明获得的提取物，为黄酮类组份和生物碱类组份组合较单一组份降低II型糖尿病血糖作用更强。

附图说明

图1桑叶降糖活性部位筛选流程图；；

图2层析分离流程图；

图3离子交换分离流程图。

注：“-”、“+”表示提取物降血糖的活性。

具体实施方式

实施例1

取桑叶粗粉1000g，加水煎煮3次，每次1小时，药液过滤，减压浓缩至2∶1(药液：药材量)，搅拌加入10％的1％壳聚糖乙酸溶液絮凝，静置，过滤，上清液通过D101大孔树脂，水洗5倍柱体积，收集水洗液，浓缩，得药液1；继续用70％的乙醇洗脱大孔树脂，收集醇洗液，浓缩，干燥，得到黄酮类组份22g，测定总黄酮含量为68.2％，其中芦丁含量为10.4％。药液1通过001×7型离子交换柱色谱，水洗至流出液无色，1.0N氨水洗脱，收集氨水洗脱液，浓缩，通过D113型离子交换树脂，水洗，0.1N氨水洗脱，收集氨水洗脱液，浓缩，干燥，得生物碱类组份8g，其中氮杂环类生物碱含量为80.5％，1-脱氧野尻霉素(DNJ)含量为10.7％。

实施例2

取山桑叶粗粉1000g，加0.02N的盐酸煎煮2次，每次90分钟，药液过滤，减压浓缩至相对密度约1.10，加入乙醇沉淀使药液中乙醇浓度达50％，过滤，回收乙醇至无醇味，加水稀释至1L，通过聚酰胺柱色谱，水洗5倍柱体积，收集水洗液，浓缩，得药液1；用0.1N氨水继续洗脱聚酰胺柱，收集洗脱液，浓缩，干燥，得到黄酮类组份18g，其中总黄酮部位含量55.7％，其中芦丁含量为7.2％。将药液1通过D113离子交换柱色谱，水洗，0.2N氨水洗脱，收集氨水洗脱液，浓缩，通过001×7离子交换柱色谱，水洗，1.0N氨水洗脱，收集氨水洗脱液，浓缩，干燥，得生物碱类组份12g，其中氮杂环类生物碱部位含量为92.8％，其中1-脱氧野尻霉素(DNJ)含量为13.7％。

实施例3

取桑叶粗粉10kg，加入50％乙醇回流提取三次，每次45分钟，过滤，回收乙醇，药液浓缩至2∶1(药液：药材量)，搅拌加入10％的1％壳聚糖乙酸溶液絮凝，静置，过滤，清液通过AB-8大孔吸附树脂柱，水洗6倍柱体积，收集水洗液，浓缩，得药液1；用75％的乙醇继续洗脱树脂柱，收集洗脱液，浓缩，干燥，得到黄酮类组份310g，其中总黄酮部位含量80.4％，其中芦丁含量为11.1％。将药液1通过001×7离子交换柱色谱，水洗至流出液无色，1.0N氨水洗脱，收集氨水洗脱液，浓缩，通过D113离子交换树脂，水洗，0.05N氨水洗脱，收集氨水洗脱液，浓缩，干燥，得生物碱类组份88g，其中氮杂环类生物碱含量为87.5％，1-脱氧野尻霉素(DNJ)含量为13.7％。

实施例4

胶囊剂

[处方]桑叶降糖组合物浸膏300g

制成胶囊1000粒

[制法]取桑叶降糖组合物浸膏，加入微晶纤维素等辅料混匀，制粒，干燥，填充1000粒胶囊，即得。

注：桑叶降糖组合物浸膏为按上述实施例二方法制备所得，以下均同。

实施例5

片剂

[处方]桑叶降糖组合物浸膏300g

制成1000片

[制法]取桑叶降糖组合物浸膏，加入药用辅料微晶纤维素和糊精等，混匀，制粒，干燥，加入崩解剂和润滑剂，混匀，压制成1000片干燥，即得。

实施例6

颗粒剂

[处方]桑叶降糖组合物浸膏100g

制成1000g颗粒

[制法]取桑叶降糖组合物浸膏，加入糊精、矫味剂等辅料，混匀，制粒，干燥，制成1000g颗粒，小袋包装，即得。

实施例7

丸剂

[处方]桑叶降糖组合物浸膏600g

制成1000g丸剂

[制法]取桑叶降糖组合物浸膏，加入药用辅料微晶纤维素等，混匀，制丸，干燥，包装，即得。

实施例8

口服液

[处方]桑叶降糖组合物浸膏100g

制成1000ml口服液

[制法]取桑叶降糖组合物浸膏，加入适量增溶剂，溶解于水，加入矫味剂，过滤，灭菌，灌装，即得。

实施例9

一、桑叶降糖活性部位筛选

1、溶剂极性增大法

具体流程见图1。

试验方法：取C57肝脏葡萄糖激酶基因敲除小鼠，体重25～35g，雌雄兼用，按基础血糖值均分组(n＝10)，第一组为对照组，等体积蒸馏水灌胃，其余为药物组；给药前禁食12小时，一次性给药后(2.0g/kg)，均灌胃蔗糖4.0g/kg，由尾静脉采血，测定给糖前及给糖后1.0小时小鼠的血糖，实验室温度20℃～26℃。

评判标准：“-”表示与对照组相比，血糖值降低差异P＞0.10；“+”表示P＞0.05；“++”表示P＜0.05；“+++”表示P＜0.01。

结论：试验结果说明，桑叶中的非极性成分基本无降糖作用，降糖活性部位存在于乙醇提取所得的弱极性和极性部分中，因此需要对乙醇提取物进一步的分离筛选。

2、层析分离法

层析分离流程图见图2。

结论：试验结果说明，桑叶乙醇提取物和水提取物中的极性部分与弱极性部分均具有较好的降糖活性作用；弱极性部分可以用吸附树脂对其进行吸附分离得到有效部位，极性部分可用离子交换树脂对其进一步分离。

3、离子交换法分离极性部分

离子交换分离流程图见图3。

结论：试验结果表明，能吸附于阳离子树脂但不能被阴离子树脂吸附的碱性化合物，是具有降糖活性的吸附树脂水洗部分的有效部位。

二、桑叶降血糖活性部位化学成分分析和鉴定

1、合并层析分离中15％～75％乙醇洗脱部分，对其进行理化分析和成分分离，确定其主要含有黄酮类化合物，其中分离得到单个黄酮化合物有芦丁、槲皮素、槲皮苷、异槲皮苷等。

2、对上述水洗脱物(G)进行分析，为生物碱成分，主要含有氮杂环类化合物，分离得到的单个氮杂环化合物有1-脱氧野尻霉素(DNJ)，N-甲基-1-脱氧野尻霉素，2-O-β-D-吡喃半乳糖基-1-脱氧野尻霉素，fagomine(1，2，5-三脱氧-1，5-亚胺基-D-阿拉伯糖醇)，1，4-二脱氧-1，4-亚胺基-D-阿拉伯糖醇，1，4-二脱氧-1，4-亚胺基-(2-O-β-D-吡喃葡萄糖基)-D-阿拉伯糖醇等。

三、有效部位及单体的分析方法

1、黄酮类成分测定

(1)总黄酮测定

对照品溶液的制备精密称取在120℃减压干燥至恒重的芦丁对照品50mg，置25ml量瓶中，加70％乙醇20ml，置水浴上微热使溶解，放冷，加70％乙醇至刻度，摇匀。精密量取5ml，置50ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得(每1ml中含无水芦丁0.2mg)。

标准曲线的制备精密量取对照品溶液1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml、6.0ml，分别置25ml量瓶中，加水至6ml，加5％亚硝酸钠溶液1ml，混匀，放置6分钟，加10％硝酸铝溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液10ml，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟；以相应的溶液为空白。照分光光度法(附录V B)，在500nm波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线。

测定法取样品粉末精密称取约0.2g，置100ml量瓶中，加70％乙醇70ml，置水浴上微热并时时振摇30分钟，放冷，加70％乙醇至刻度，摇匀，放置4小时，精密量取上清液1ml，置25ml量瓶中，照标准曲线的制备项下的方法，自“加水至6ml”起，依法测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中芦丁的重量，计算，即得。

(2)芦丁含量测定

照高效液相色谱法(中国药典2005年版附录VI D)测定。

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.2％磷酸溶液(40∶60)为流动相，检测波长为358nm。理论板数按芦丁峰计算应不低于3000。

对照品溶液的制备取在120℃减压干燥至恒重的芦丁对照品适量，精密称定，用甲醇制成每1ml含0.05mg的溶液，即得。

供试品溶液的制备取样品粉末约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率500W，频率40KHz)40分钟，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足损失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

2、生物碱类成分测定

(1)总生物碱测定

精密称定样品约0.3g，加50％乙醇20ml溶解，再加水40ml，加0.1g醋酸铅，摇匀，静置20分钟后，滤过，滤液蒸干，残渣加0.1mol/L的硫酸溶液20ml溶解，滤过，滤液加在强酸性阳离子交换树脂柱上，以水洗200ml，弃去水液，再以2mol/L氨溶液200ml洗脱，收集洗脱液，蒸干。残渣精密加无水冰醋酸50ml使溶解，作为供试品溶液。取2份，每份精密量取20ml，加结晶紫指示液1滴，用0.05mol/L的高氯酸滴定液缓缓滴定至蓝色，并将滴定的结果用空白试验校正。每1ml高氯酸滴定液(0.1mol/L)相当于16.3mg的1-脱氧野尻霉素(化学式C₆H₁₃NO₄)。

(2)1-脱氧野尻霉素(DNJ)

照高效液相色谱法(中国药典2005年版附录VI D)测定。

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.1％醋酸溶液为流动相B，按下表进行梯度洗脱，色谱图记录时间25分钟。检测波长为265nm；理论板数按1-脱氧野尻霉素峰计算应不低于2000。

时间(分钟)	流动相A(％)	流动相B(％)
时间(分钟)	流动相A(％)	流动相B(％)	0～25	25	75
25～40	50	50	0～25	25	75

对照品溶液的制备精密称取1-脱氧野尻霉素对照品适量，加50％甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，摇匀。精密量取上述溶液1ml，置25ml量瓶中，加入0.4mol/L的硼酸-氯化钾缓冲液(pH＝8.5)1ml，再加入10mmol/L的FMOC-Cl乙腈溶液2ml，室温下超声处理(功率250W，频率20kHz)20分钟，加0.1％的醋酸溶液至刻度，摇匀，即得。

供试品溶液的制备精密称定样品约0.2g，用0.05mol/L盐酸超声处理2次(功率500W，频率20KHz)，每次40ml，20分钟，过滤，合并滤液，滤液离心10分钟(转速为3500转/分)，上清液转移至100ml量瓶中，加0.05mol/L盐酸稀释至刻度。精密量取上述溶液1ml，置10ml量瓶中，加入0.4mol/L的硼酸-氯化钾缓冲液(pH＝8.5)1ml，再加入10mmol/L的FMOC-Cl乙腈溶液2ml，室温下超声处理(功率250W，频率20kHz)20分钟，加0.1％的醋酸溶液至刻度，摇匀，即得。

测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

四、有效部位配比筛选试验

1、药物：桑叶黄酮类组分，桑叶生物碱类组分，自制；格列本脲片，2.5mg/片，浙江南洋药业有限公司；拜唐苹，拜尔医药保健有限公司。

2、动物：清洁级昆明种小鼠，体重20～25g，雌雄各半。

3、试剂：蔗糖，分析纯，上海第一化工厂产品。

4、仪器：稳步倍加型血糖监测仪，美国强生公司。

5、试验方法与结果：取C57肝脏葡萄糖激酶基因敲除小鼠，体重25～35g，雌雄兼用，按基础血糖值均分组(n＝10)，第一组为对照组，等体积蒸馏水灌胃，第二、三组为阳性药物组；其余各组为黄酮类组份和生物碱组份不同比例的组合；给药前禁食12小时，按表1设计剂量一次性给药后，均灌胃蔗糖4.0g/kg，由尾静脉采血，测定给糖前及给糖后1.0小时小鼠的血糖，实验室温度20℃～26℃。试验结果见表1。

表1不同比例的桑叶提取物对II型糖尿病小鼠灌胃蔗糖后血糖值的影响

注：与对照组比较：#P＞0.10；*P＞0.05；**P＜0.05；***P＜0.01

6、结论：(1)单个黄酮类和生物碱类部位均有一定的降血糖活性；

(2)黄酮类成分：生物碱类成分为0.5～10∶1均能有效的提高小鼠糖耐量；

(3)当黄酮类成分：生物碱类成分为1～4∶1时，有显著降血糖作用，其中以4∶1比例为最佳。

Claims

1.一种具有降血糖作用的植物提取物，其特征在于是由桑科桑属植物的叶通过提取分离得到的黄酮类和生物碱组份组成的，组合物中含黄酮类组份和生物碱组份的比例为0.5～10∶1。

2.根据权利要求1中所述的植物提取物，其特征在于所述的黄酮类组份中总黄酮部位含量50-95％，其中芦丁含量为5-20％。

3.根据权利要求1中所述的植物提取物，其特征在于所述的生物碱类组份中氮杂环类生物碱部位含量为50-95％，其中1-脱氧野尻霉素(DNJ)含量为5-30％。

4.根据权利要求1至3之一所述的植物提取物，其特征在于组合物中含黄酮类组份和生物碱组份的比例为4∶1。

5.权利要求1至4之一中所述的植物提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤

(1)将桑科桑属植物的叶粉碎后，加入水、有机溶剂、含水有机溶剂或含0.001N-0.1N酸的上述溶剂，在30-100℃进行提取或渗漉，重复提取或渗漉1-4次，每次提取30-90分钟，过滤或离心除去药渣，药液浓缩至一定浓度，除杂质，过滤或离心除去沉淀，清液通过吸附柱色谱，水洗2-10柱体积，收集水洗液，浓缩，得药液1，其中有机溶剂为中等极性溶剂；

(2)用10-95％的醇液或0.001-0.1N氨水继续洗脱吸附柱色谱，填料为大孔吸附树脂、聚酰胺，收集洗脱液，浓缩，干燥，得到黄酮类组份；

(3)将药液1通过离子交换柱色谱I，水洗，氨水洗脱，收集氨水洗脱液，浓缩，通过离子交换柱色谱II，水洗，氨水洗脱，收集氨水洗脱液，浓缩，干燥，得生物碱类组份，其中离子交换柱色谱I和II所用的填料可为强酸性离子交换树脂、弱酸性离子交换树脂，其中氨水的浓度为0.005-1N。

6.根据权利要求5中所述的植物提取物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中用于提取的有机溶剂为乙醇、丙酮、正丁醇。

7.权利要求1至4中所述的植物提取物在制备治疗或预防糖尿病及其并发症的药物或食品中的应用。

8.根据权利要求7所述的植物提取物的用途，其特征在于该药物的剂型为胶囊、丸剂、颗粒剂、口服液或片剂。