CN113820422A - 一种白芍总苷指纹图谱检测方法 - Google Patents

一种白芍总苷指纹图谱检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种白芍总苷指纹图谱检测方法，所述方法包括以下步骤：1)供试品溶液的配制：取白芍总苷，加入甲醇，混合均匀，滤过，取续滤液；2)检测：吸取供试品溶液，注入液相色谱仪，得到色谱图；3)对比分析：将步骤2所得色谱图和白芍总苷标准指纹图谱通过指纹相似性软件对比，符合率80％以上为合格；其中，所述液相色谱仪的色谱条件如下：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；以磷酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱。

Description

一种白芍总苷指纹图谱检测方法
技术领域
本发明涉及一种中药提取物的指纹图谱检测方法，特别涉及一种白芍总苷的指纹图谱检测方法。
背景技术
白芍，中药名。为毛茛科植物芍药Paeonialactiflora Pall.的干燥根。夏、秋二季采挖，洗净，除去头尾和细根，置沸水中煮后除去外皮或去皮后再煮，晒干。具有养血调经，敛阴止汗，柔肝止痛，平抑肝阳之功效。常用于血虚萎黄，月经不调，自汗，盗汗，胁痛，腹痛，四肢挛痛，头痛眩晕。
从白芍干燥根中得到芍药苷(paeoniflorin)、芍药内酯苷(albiflorin)、苯甲酰芍药苷(benzoylpaeoniflorin)等具有生理功效成分的混合物，总称白芍总苷(totalglucosides of paeonia，TGP)。
白芍总苷按干燥品计，含芍药苷(C23H28O11)不得少于40.0％，含芍药内酯苷(C23H28O11)不得少于10.0％，含1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖(C41H32O26)不得少于8.0％。
已知，白芍总苷的制备方法如下：取白芍，用75％乙醇溶液提取3次，第一次和第二次为1.5小时，第三次为1小时，滤过，合并滤液，滤液浓缩至相对密度1.15～1.25(50℃～65℃)的浸膏，加入饱和碳酸氢钠溶液调节pH值至5.9～6.1，再用乙酸乙酯提取两次，弃去乙酸乙酯层，母液用乙酸乙酯-正丁醇混合溶剂提取3次，合并提取液，提取液浓缩至相对密度1.13～1.20(50℃～65℃)后进行喷雾干燥，粉碎，过筛，混合，即得。
白芍总苷的检测方法如下：
供试品溶液：取本品约50mg，精密称定，置100ml量瓶中，加甲醇适量，超声使溶解，取出，放冷，用甲醇稀释至刻度，摇匀，离心，取上清液。
对照品溶液：取芍药苷对照品、芍药内酯苷对照品与1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖对照品各适量，精密称定，加甲醇溶解并定量稀释制成每1ml中约含芍药苷0.2mg、芍药内酯苷75μg和1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖30μg的混合溶液。
色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(4.6mm×250mm，5μm或效能相当的色谱柱)，以乙腈为流动相A，以三乙胺磷酸溶液[三乙胺-磷酸-水(1:1:1000)]为流动相B按下表进行梯度洗脱；流速为每分钟0.8ml；检测波长为230nm；进样体积5μl。
Figure BDA0003276720150000021
系统适用性要求
芍药内酯苷峰、芍药苷峰与1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖峰之间的分离度应符合要求。
测定法
精密量取供试品溶液与对照品溶液分别入液相色谱仪，记录色谱图。
限度
供试品溶液色谱图中，除溶剂峰、芍药苷峰、芍药内酯苷峰与1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖峰外，按峰面积归一化法计算单个最大组分峰面积不得大于总峰面积的6％，各组分峰面积的和不得大于总峰面积的26％。
白芍总苷胶囊具有抑制自身免疫，抗炎，止痛作用，是国内唯一植物来源治疗类风湿关节炎的药品，是立华制药独家专利产品，是风湿免疫性疾病的基础用药，属国家医保目录产品。根据多年临床应用发现，白芍总苷对干燥综合征、系统性红斑狼疮、银屑病等皮肤科疾病也有很好的疗效。
为提高白芍总苷胶囊生产过程质量控制水平，根据有关规定，需开发白芍总苷原料和制剂指纹图谱检测方法，并建立标准指纹图谱。现有技术CN201811513973.X提供了一种江芍药HPLC指纹图谱检测方法，其检测对象为江芍药。白芍总苷作为中药提取物，其所含的有效成分组成及各组分含量与其制备方法息息相关，本发明白芍总苷是采用特定的方法制备而成，采用现有技术不能建立适合本发明白芍总苷的标准指纹图谱，因此有必要开发一种适合本发明白芍总苷进行指纹图谱检测技术。
发明内容
本发明提供一种新的白芍总苷指纹图谱检测方法，所述方法包括以下步骤：
1)供试品溶液的配制：取白芍总苷，加入甲醇，混合均匀，滤过，取续滤液；
2)检测：吸取供试品溶液，注入液相色谱仪，得到色谱图；
3)对比分析：
将步骤2)所得色谱图和白芍总苷标准指纹图谱通过指纹相似性软件对比，符合率80％以上为合格；
其中，所述液相色谱仪的色谱条件如下：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；以磷酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱。
优选的，本发明的白芍总苷指纹图谱检测方法，所述方法包括以下步骤：
1)供试品溶液的制备：取白芍总苷20～30mg，精密称定，置20～30mL量瓶中，加甲醇适量，超声处理使溶解，取出，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
2)检测：精密吸取供试品溶液2～10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图；
3)比对分析：将步骤2)所得色谱图和白芍总苷标准指纹图谱进行比对，相似度在90％以上的供试品为合格；
其中，所述色谱条件如下：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；以0.05％～0.2％磷酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为0.8mL/min～1.2mL/min；检测波长为230nm；柱温为15℃～25℃，理论板数按芍药苷峰计算应不低于8000；
Figure BDA0003276720150000031
更优选的，本发明的白芍总苷指纹图谱检测方法，所述方法包括以下步骤：
1)供试品溶液的制备：取白芍总苷粉末25mg，精密称定，置25mL量瓶中，加甲醇适量，超声处理使溶解，取出，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
2)检测：精密吸取供试品溶液5μL，注入液相色谱仪，记录色谱图；
3)比对分析：将步骤2)所得色谱图和白芍总苷标准指纹图谱进行比对，相似度在90％以上的供试品为合格；
其中，所述色谱条件如下：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；以0.05％磷酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为1.0mL/min；检测波长为230nm；柱温为20℃，理论板数按芍药苷峰计算应不低于8000；
Figure BDA0003276720150000041
其中，所述于所述超声处理优选在300W，40kHz下进行；所述十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，其规格优选柱长25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm；所述十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱选自Extend-C18、Eclipse Plus C18或ZORBAX SB-C18，更优选Extend-C18。
另外，本发明还提供了一种白芍总苷标准指纹图谱的制备方法，所述制备方法如下：
1)参照物溶液的制备取芍药苷对照品、芍药内酯苷对照品、没食子酸对照品、儿茶素对照品、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含芍药苷200μg、芍药内酯苷40μg、没食子酸8μg、儿茶素10μg、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖20μg的混合溶液，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
2)供试品溶液的制备：取10批量以上的按照本发明方法制备的合格的白芍总苷，每一批25mg，精密称定，置25mL量瓶中，加甲醇适量，超声处理使溶解，取出，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
3)测定法分别精密吸取空白溶液、参照物溶液和供试品溶液各5μL，注入液相色谱仪，测定，分别记录色谱图；
4)对上述10批量以上的每一批次的色谱图，采用计算机模拟矫正，经过计算和输出，得到本发明标准指纹图谱，该图谱作为标准对照指纹图谱被用于生产过程中得到的任何一个批次的产品的指纹图谱的比较；
其中，所述色谱条件如下：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；以0.05％～0.2％磷酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为0.8mL/min～1.2mL/min；检测波长为230nm；柱温为15℃～25℃，理论板数按芍药苷峰计算应不低于8000；
Figure BDA0003276720150000051
优选的，本发明白芍总苷标准指纹图谱制备方法所述的色谱条件如下：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；以0.05％磷酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为1.0mL/min；检测波长为230nm；柱温为20℃，理论板数按芍药苷峰计算应不低于8000；
Figure BDA0003276720150000052
其中，所述十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，其规格优选柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm；所述色谱柱选自Extend-C18、Eclipse Plus C18或ZORBAX SB-C18，优选Extend-C18。
现有技术尚未有针对本发明制备方法制备的白芍总苷指纹图谱的检测方法，本发明即对其指纹图谱检测方法进行了开发：
实验一、色谱条件筛选优化
本发明白芍总苷指纹图谱检测方法使用ZJT29(批号171007)样品先后优化了色谱条件。先后优化了测定波长、色谱柱、流动相、色谱柱温度、流速等对指纹图谱影响较大的色谱条件。
色谱条件优化采用如下供试品制备方法：
称取白芍总苷原料药约25mg，精密称定，置25mL量瓶中，加甲醇适量，超声处理(300W，40kHz)使溶解，取出，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
1、测定波长的选择
指纹图谱需兼顾大多数组分在整张图谱中都有所体现，而且达到较好的紫外吸收，因此需要选择合适的分析波长。本实验采用二极管阵列DAD检测器，对白芍总苷原料药的色谱-紫外光谱进行了测定，采集230～275nm全波长扫描，通过不同波长色谱图(图1)选择波长。
从图1可以看到，芍药苷类化合物在低波长处和230nm附近有较强的吸收，且在230nm处大部分物质都有体现，折中选择230nm。
2、色谱柱选择
反相C18色谱柱是中药分析中最常用的色谱柱，对于多数类别的天然产物结构表现出良好的选择性。但不同的键合相使不同款C18色谱柱又有着不同的选择性和适用范围。因此为了比较不同色谱柱对白芍总苷原料药所含成分保留行为的影响，本节通过对9种不同的反相C18色谱柱进行比较，选择最佳的C18色谱柱对白芍总苷原料药样品进行分析。
所比较的色谱柱包括表1中来自4个厂家的9款色谱柱。其中Triart C18色谱柱的pH耐受范围最广；ZORBAX Eclipse XDB是分析和法规方法的可靠选择；ZORBAX StableBond色谱柱更适用于低pH环境；ZORBAX Extend-C18色谱柱是双配位键合，可以在高pH下开发高分离度分离方法；ZORBAX Bonus-RP色谱柱是一种对碱性化合物具有良好峰形的烷基酰胺色谱柱，可改变选择性；Ultimate LP-C18色谱柱适合在极低pH至中等pH条件下分离极性化合物；Hydrosphere C18对亲水性化合物保留强且对于碱性化合物分离良好；Fortis XiC18通过疏水相互作用可分离极性、中等极性和非极性化合物。
色谱柱选择对应色谱条件如下：流动相由A相含0.1％磷酸水和B相乙腈组成，梯度为：0-10min 14-17％B；10-24min 17-32％B；24-45min 32-70％B；45-50min 70％B；50-51min 70-14％B；51-60min 14％B。柱温20℃，进样量10μL，流速0.8mL/min。
不同色谱柱比较色谱图，见图2。
表1不同色谱柱信息归纳
Figure BDA0003276720150000071
表2色谱柱选择数据
Figure BDA0003276720150000072
分析以上图表数据后，选择用色谱保留较弱且具有较高分离度和选择性的Agilent Extend C18色谱柱进行白芍总苷原料药后续分析方法开发。
3、流动相选择
(1)流动相体系选择
比较乙腈-水和甲醇-水两种常用流动相体系。
流动相体系选择实验的色谱条件如下：Agilent Extend-C18(4.6×250mm,5μm)色谱柱，流动相由A相纯水和B相乙腈或甲醇组成，梯度为：0-10min14-17％B；10-24min 17-32％B；24-45min 32-70％B；45-50min 70％B；50-51min70-14％B；51-60min 14％B。柱温20℃，进样量10μL，流速0.8mL/min。
从图3可以看出，相同条件下，乙腈-水流动相体系峰容量明显高于甲醇-水体系，且乙腈截止波长小于甲醇，因此选择乙腈-水流动相体系分析白芍总苷。
(2)流动相添加剂选择
比较不同流动相添加剂(0.1％甲酸、0.1％磷酸、0.1％磷酸-0.1％三乙胺)对白芍总苷中化合物色谱行为的影响。结果表明有紫外吸收的甲酸不适宜做流动相的添加剂(图4)，磷酸或磷酸-三乙胺添加剂均满足系统适应性要求(表3)，折中选择在水相中加磷酸作为流动相A。
表3流动相添加剂选择
Figure BDA0003276720150000081
(3)添加剂浓度选择
比较水相添加剂不同浓度(0.1％，0.05％，0.02％磷酸)对白芍总苷原料药中化合物色谱行为的影响。结果表明三种浓度均满足要求(表4和图5)。考虑到流动相pH和色谱柱耐受pH范围，选择0.05％磷酸浓度作为流动相A。
表4添加剂浓度选择
Figure BDA0003276720150000082
(4)色谱柱温度选择
比较不同色谱柱温度对分离的影响。结果表明随着温度升高，大部分色谱峰保留时间缩短，理论塔板数降低，分离度变差(表5和图6)。因此选择20℃柱温。
表5色谱柱温度选择
Figure BDA0003276720150000091
(5)流速选择
比较了不同流速(0.8mL/min，1.0mL/min，1.2mL/min)对色谱分离的影响。结果表明，流速对峰形、柱效均有微小影响(表6和图7)，综合考虑分析时间、各峰的分离度、对称性等因素，选择1.0mL/min流速。
表6流动相流速选择
Figure BDA0003276720150000092
(6)梯度选择
梯度选择实验的色谱条件如下：Agilent Extend-C18(4.6×250mm，5μm)色谱柱，流动相由A相0.05％磷酸水溶液和B相乙腈组成，柱温20℃，进样量10μL，流速1.0mL/min。
优化结果为：0min 12％B；5min 14％B；16min19％B；30min 40％B；40min90％B；45min 90％B；46min 12％B；60min 12％。
色谱条件总结
通过上述色谱条件优化，最终确立的白芍总苷指纹图谱样品检测分析方法为：色谱柱：Agilent Extend C18(4.6×250mm，5μm)；柱温：20℃；流动相A：0.05％磷酸水溶液；流动相B：乙腈；流速：1.0mL/min；检测波长：230nm；进样量：5μL。
洗脱梯度：
Figure BDA0003276720150000093
Figure BDA0003276720150000101
采用上述方法对白芍总苷进行分析三主成分的分析指标见表7。
表7本发明指纹图谱检测方法分析指标
Figure BDA0003276720150000102
二、指纹图谱方法学验证实验
本发明按中国药典2015年版四部通则《9101药品质量标准分析方法验证指导原则》及参考《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》(国药管注[2000]348号)相关要求，对本发明指纹图谱检测方法进行方法学验证，具体情况如下：
(一)仪器设备、试剂材料与对照品样品
(1)仪器与设备
Agilent 1260HPLC高效液相色谱仪，二极管阵列检测器；十万分之一电子天平Sartorius BT125D(Sartorius Scientific Instruments(Beijing)Co.,Ltd)；KQ-300DB型数控超声仪(昆山市超声仪器有限公司)；色谱柱Agilent Extend C18(4.6×250mm，5μm)。
(2)试剂与材料
乙腈(HPLC，Merck)、甲醇(LC-MS，Merck)、乙醇(AR，上海泰坦科技有限公司)、蒸馏水(NA，广州屈臣氏食品饮料有限公司)、磷酸(HPLC，上海安谱实验科技股份有限公司)、有机相针式滤器(0.22μm，尼龙，上海安谱实验科技股份有限公司)、容量瓶(25mL，江苏省三爱思科学仪器有限公司)。
(3)对照品与样品
对照品：没食子酸对照品(纯度98％，批号5705)、芍药苷对照品(纯度98.2％，批号5856)、芍药内酯苷对照品(纯度99.4％，批号5857)、儿茶素对照品纯度98.9％，批号6297)、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖对照品(纯度98.0％，批号6298)，以上对照品均由上海诗丹德标准技术服务有限公司提供。
(二)指纹图谱测定方法验证过程
以白芍总苷原料药ZJT29(批号171007)为测试样品，进行方法专属性、仪器精密度、供试品溶液稳定性、方法重复性和方法耐用性测试，以考察HPLC分析方法的可靠性。
(1)专属性
空白溶液的制备：取适量甲醇溶液，滤过，取续滤液，即得。
照本发明分析方法分别制备参照物溶液和供试品溶液，取上述各溶液进样测定。结果见图8。图8专属性考察(注：图中a为化合物没食子酸，b为化合物儿茶素，c为化合物芍药内酯苷，d为化合物芍药苷，g为化合物1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖)色谱图
结论：空白图谱无干扰，对照品出峰位置与样品出峰位置一致，专属性结果良好。
(2)仪器精密度
称取白芍总苷原料药约25mg，精密称定，置25mL量瓶中，加甲醇适量，超声处理(300W，40kHz)使溶解，取出，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。取该溶液连续进样6次，测定指纹图谱。结果见表8和表9。
表8仪器精密度评价相对保留时间结果
Figure BDA0003276720150000111
表9仪器精密度评价相对峰面积结果
Figure BDA0003276720150000121
结论：各共有峰相对保留时间RSD在0.06％～0.36％之间，相对峰面积RSD在0.20％～4.67％之间。结果表明仪器精密度良好。
(3)重复性
取同一批白芍总苷同法制备6份供试液进行测定。结果见表10和表11。
表10重复性评价相对保留时间结果
Figure BDA0003276720150000122
表11重复性评价相对峰面积结果
Figure BDA0003276720150000131
结论：各共有峰相对保留时间RSD为0.06％～0.21％，相对峰面积RSD为0.06％～2.94％。方法的重复性良好。
(4)中间精密度
表12中间精密度评价相对保留时间结果
Figure BDA0003276720150000132
表13中间精密度评价相对峰面积结果
Figure BDA0003276720150000141
3名实验人员按照供试品制备方法于不同日期平行制备供试品溶液3份进行测定。结果各共有峰相对保留时间RSD为0.06％～0.21％(表12)，相对峰面积RSD为0.15％～2.82％(表13)，该方法中间精密度较好。
(5)供试品溶液稳定性
取同一供试品溶液，分别于第0、1、2、4、6、8、12、24、48小时进行测定，结果未出现新的色谱峰，各共有峰相对保留时间RSD为0.10％～0.51％(表14)，相对峰面积RSD为0.29％～6.62％(表15)。说明样品在48小时内稳定性良好。
表14供试品溶液稳定性评价相对保留时间结果
Figure BDA0003276720150000142
Figure BDA0003276720150000151
表15供试品溶液稳定性评价相对峰面积结果
Figure BDA0003276720150000152
(6)耐用性
柱温
考察该方法对色谱柱温度的耐用性。在15℃、20℃、25℃色谱柱温度下分别测定白芍总苷原料药供试品溶液，色谱图见图9，使用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版》进行分析检验，结果(表16)显示相似度均大于0.99，表明该方法对色谱柱温度有较好的耐用性。
表16不同色谱柱温度色谱图与对照指纹图谱相似度结果
Figure BDA0003276720150000153
流速
考察该方法对流速的耐用性。将流速分别设置为0.8mL/min、1.0mL/min、1.2mL/min测定白芍总苷原料药供试品溶液，色谱图见图10，使用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版》进行分析检验，结果(表17)显示相似度均大于0.99，表明该方法对流速有较好的耐用性。
表17不同流速色谱图与对照指纹图谱相似度结果
Figure BDA0003276720150000161
流动相添加剂浓度
考察该方法对流动相添加剂浓度的耐用性。分别用0.05％H3PO4、0.1％H3PO4、0.2％H3PO4流动相作为A相测定白芍总苷原料药供试品溶液，色谱图见图11，使用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版》进行分析检验，结果(表18)显示相似度均大于0.99，表明该方法对流动相pH有较好的耐用性。
表18不同流动相添加剂浓度色谱图与对照指纹图谱相似度结果
Figure BDA0003276720150000162
流动相梯度
考察该方法对流动相梯度的耐用性。分别用表19中的梯度测定白芍总苷原料药供试品溶液，色谱图见图12，使用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版》进行分析检验，结果(表20)显示相似度均大于0.99，表明该方法对流动相梯度有较好的耐用性。
表19流动相梯度耐用性考察使用梯度
Figure BDA0003276720150000163
表20不同流动相梯度色谱图与对照指纹图谱相似度结果
Figure BDA0003276720150000171
不同色谱柱
考察该方法对不同键合相C18色谱柱和不同批次Extend-C18色谱柱的耐用性。分别用不同色谱柱测定白芍总苷原料药供试品溶液，色谱图见图13和图14，使用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版》进行分析检验，结果(表21和表22)显示相似度均大于0.99，表明该方法对流动相梯度有较好的耐用性。
表21不同键合相C18色谱柱出峰图与对照指纹图谱相似度结果
Figure BDA0003276720150000172
表22不同批次Extend-C18色谱柱色谱图与对照指纹图谱相似度结果
Figure BDA0003276720150000173
方法验证小结
本发明指纹图谱测定方法的专属性、精密度(仪器精密度、重复性、中间精密度)、供试品溶液稳定性和方法耐用性验证结果均符合接受标准，该方法可以用于本发明制备方法制备的白芍总苷指纹图谱样品检测。
本发明与现有技术相比技术效果
(1)本发明指纹图谱检测方法，可以同时用做的含量检测方法
(2)本发明与现有技术相比具有分离度高、峰对称性好等优势，可以更好的对采用特定制备方法制备的白芍总苷进行质量控制。
附图说明
图1：本发明指纹图谱检测方法筛选过程中的不同波长色谱图；
图2：本发明指纹图谱检测方法筛选过程中的不同色谱柱分析样品色谱图(图中峰1为芍药内酯苷、2为芍药苷、3为1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖；
图3：本发明指纹图谱检测方法筛选过程中的不同流动相体系色谱图；
图4：本发明指纹图谱检测方法筛选过程中的不同流动相添加剂色谱图(图中峰1为芍药内酯苷、2为芍药苷、3为1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖)；
图5：本发明指纹图谱检测方法筛选过程中的不同流动相添加剂浓度色谱图(图中峰1为芍药内酯苷、2为芍药苷、3为1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖)；
图6：本发明指纹图谱检测方法筛选过程中的不同柱温色谱图(图中峰1为芍药内酯苷、2为芍药苷、3为1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖)；
图7：本发明指纹图谱检测方法筛选过程中的不同流速对应色谱图(图中峰1为芍药内酯苷、2为芍药苷、3为1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖)；
图8：本发明指纹图谱检测方法的专属性考察色谱图；
图9：本发明指纹图谱检测方法的色谱柱温度耐用性考察色谱图；
图10：本发明指纹图谱检测方法的流速耐用性考察色谱图；
图11：本发明指纹图谱检测方法的流动相添加剂浓度耐用性考察色谱图；
图12：本发明指纹图谱检测方法的流动相梯度耐用性考察色谱图；
图13：本发明指纹图谱检测方法的不同键合相C18色谱柱耐用性考察色谱图；
图14：本发明指纹图谱检测方法的不同批次Extend-C18耐用性考察色谱柱；
图15：本发明标准指纹图谱；
图16：本发明31批次白芍总苷的色谱图。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
实施例1白芍总苷的制备方法
1)提取：取白芍饮片1000g，用75±1％乙醇提取3次，乙醇加入倍量分别为白芍饮片重量的4倍、3倍、3倍，时间各为1.5小时、1.5小时、1小时，提取温度控制在80±5℃进行提取，三次提取，过滤进入浓缩工序，药渣抽干；
2)浓缩：减压浓缩，浓缩温度控制在50～60℃，真空度控制在-0.06～-0.09Mpa，浓缩至50～65℃相对密度为1.15～1.25，并且控制回收乙醇的浓度小于5％，交付萃取工序；
3)萃取：
a，碱化：浓缩液中加入饱和NaHC03溶液将pH值调至5.9-6.1；
b，乙酸乙酯除杂：在上述药液中，加入乙酸乙酯萃取，萃取用量0.6:1(V/V)，搅拌时间约2～3分钟，静置至分层，具体时间视分离情况而定，取出乙酸乙酯层另置，下层母液同上法再萃取一次，合并乙酸乙酯除杂液，回收乙酸乙酯，浓缩液弃去；
c，萃取：上述药液用正丁醇：乙酸乙酯＝3:7(V/V)的混合液在反应罐中萃取，第一次萃取用量1.2:1(V/V)，搅拌2分钟、静置1.5小时以上分层，第二次及第三次萃取用量为0.6:1(V/V)，搅拌2分钟、静置1.5小时以上分层，分离得到的正丁醇乙酸乙酯萃取液合并；
4)浓缩：减压回收正丁醇乙酸乙酯萃取液，加水后加热浓缩至50℃～65℃相对密度为1.13～1.20，浓缩温度控制在40℃～60℃，真空度控制在-0.05～-0.09Mpa，得到浓缩液的量为生药量的15％(M/M)；
5)干燥：将萃取浓缩液进行喷雾干燥，得到药粉576g。
实施例2实际研究过程中的标准指纹图谱的制备
白芍总苷标准指纹图谱的制备方法如下：
1)参照物溶液的制备取芍药苷对照品、芍药内酯苷对照品、没食子酸对照品、儿茶素对照品、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含芍药苷200μg、芍药内酯苷40μg、没食子酸8μg、儿茶素10μg、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖20μg的混合溶液，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2)供试品溶液的制备：取30批量以上的按照本发明方法制备的合格的白芍总苷粉末，每一批约25mg，精密称定，置25mL量瓶中，加甲醇适量，超声处理(300W，40kHz)使溶解，取出，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
3)测定法分别精密吸取空白溶液、参照物溶液和供试品溶液各5μL，注入液相色谱仪，测定，分别记录色谱图。
4)对上述30批量以上的每一批次的色谱图，采用计算机模拟矫正，经过计算和输出，得到本发明标准指纹图谱(见图15)，该图谱作为标准对照指纹图谱被用于生产过程中得到的任何一个批次的产品的指纹图谱的比较。
其中，所述色谱条件如下：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以0.05％磷酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为1.0mL/min；检测波长为230nm；柱温为20℃。理论板数按芍药苷峰计算应不低于8000。
Figure BDA0003276720150000201
其中，所属多批次检测合格的白芍总苷粉末为至少10批次，优选30批次，50批次。
实施例3
采集按实施例1方法制备的31批次白芍总苷，按照实施例2色谱条件进行测定色谱图(见16)。采用软件计算各批次白芍总苷的相似度，计算各供试品之间以及各供试品与标准指纹图谱的相似度，结果相似度均大于0.99(见表23)，整体上具有较好的相似度，符合指纹图谱技术要求。
表23白芍总苷31批相似度评价结果
Figure BDA0003276720150000211

Claims (10)

1.一种白芍总苷指纹图谱检测方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：
1)供试品溶液的配制：
取白芍总苷，加入甲醇，混合均匀，滤过，取续滤液；
2)检测：
吸取供试品溶液，注入液相色谱仪，得到色谱图；
3)对比分析：
将步骤2)所得色谱图和白芍总苷标准指纹图谱通过指纹相似性软件对比，符合率80％以上为合格；
其中，所述液相色谱仪的色谱条件如下：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；以磷酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：
1)供试品溶液的制备：取白芍总苷20～30mg，精密称定，置20～30mL量瓶中，加甲醇适量，超声处理使溶解，取出，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
2)检测：精密吸取供试品溶液2～10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图；
3)比对分析：将步骤2)所得色谱图和白芍总苷标准指纹图谱进行比对，相似度在90％以上的供试品为合格；
其中，所述色谱条件如下：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；以0.05％～0.2％磷酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为0.8mL/min～1.2mL/min；检测波长为230nm；柱温为15℃～25℃，理论板数按芍药苷峰计算应不低于8000；
Figure FDA0003276720140000011
Figure FDA0003276720140000021
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：
1)供试品溶液的制备：取白芍总苷粉末25mg，精密称定，置25mL量瓶中，加甲醇适量，超声处理使溶解，取出，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
2)检测：精密吸取供试品溶液5μL，注入液相色谱仪，记录色谱图；
3)比对分析：将步骤2)所得色谱图和白芍总苷标准指纹图谱进行比对，相似度在90％以上的供试品为合格；
其中，所述色谱条件如下：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；以0.05％磷酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为1.0mL/min；检测波长为230nm；柱温为20℃，理论板数按芍药苷峰计算应不低于8000；
Figure FDA0003276720140000022
4.根据权利要求2或3所述的检测方法，其特征在于所述超声处理在300W，40kHz下进行。
5.根据权利要求2或3所述的检测方法，其特征在于所述十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，其柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm。
6.根据权利要求2或3所述的检测方法，其特征在于所述十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱选自Extend-C18、Eclipse Plus C18或ZORBAX SB-C18，优选Extend-C18。
7.一种白芍总苷标准指纹图谱的制备方法，其特征在于所述方法步骤如下：
1)参照物溶液的制备取芍药苷对照品、芍药内酯苷对照品、没食子酸对照品、儿茶素对照品、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含芍药苷200μg、芍药内酯苷40μg、没食子酸8μg、儿茶素10μg、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖20μg的混合溶液，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
2)供试品溶液的制备：取10批量以上的按照本发明方法制备的合格的白芍总苷，每一批25mg，精密称定，置25mL量瓶中，加甲醇适量，超声处理使溶解，取出，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
3)测定法分别精密吸取空白溶液、参照物溶液和供试品溶液各5μL，注入液相色谱仪，测定，分别记录色谱图；
4)对上述10批量以上的每一批次的色谱图，采用计算机模拟矫正，经过计算和输出，得到本发明标准指纹图谱，该图谱作为标准对照指纹图谱被用于生产过程中得到的任何一个批次的产品的指纹图谱的比较；
其中，所述色谱条件如下：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；以0.05％～0.2％磷酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为0.8mL/min～1.2mL/min；检测波长为230nm；柱温为15℃～25℃，理论板数按芍药苷峰计算应不低于8000；
Figure FDA0003276720140000031
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于所述色谱条件如下：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；以0.05％磷酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为1.0mL/min；检测波长为230nm；柱温为20℃，理论板数按芍药苷峰计算应不低于8000；
Figure FDA0003276720140000032
Figure FDA0003276720140000041
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于所述十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，其柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm。
10.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于所述十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱选自Extend-C18、Eclipse Plus C18或ZORBAX SB-C18，优选Extend-C18。
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