CN108061768A - 一种白芍hplc特征图谱的构建及其检测方法 - Google Patents

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朱德全
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Abstract

本发明公开了一种白芍HPLC特征图谱的构建及其检测方法，本发明针对白芍存在的质量控制问题，分别建立了含硫白芍HPLC特征图谱和无硫白芍HPLC特征图谱，同时采用高效液相色谱‑质谱联用分析方法对含硫白芍与无硫白芍进行成分的分析与指认，采用本发明建立的白芍的HPLC特征图谱鉴别白芍熏硫后产生的芍药苷亚硫酸酯产物来判断白芍药材是否经硫磺熏蒸，其与常规的二氧化硫检测方法相比，该方法简单、灵敏度高、专属性强、重现性好，可以用于白芍熏硫与否的检测，可以较全面、准确快速鉴别白芍的真伪及品质优劣，尤其适合白芍规模化生产的检测和鉴别。

Description

一种白芍HPLC特征图谱的构建及其检测方法
技术领域
本发明属于中药鉴别领域，具体涉及一种白芍HPLC特征图谱的构建及其检测方法。
背景技术
硫磺熏蒸中药材是我国中药材的传统加工方法之一，通过适量的硫磺熏蒸，可以达到防霉、防虫、防潮、延长药材储存时间的目的。但是，大量研究表明，硫熏通常会使中药材的有效成分明显降低，更重要的是硫熏后残留在中药饮片的硫化合物对人体健康有害，甚至在人体内转化为致癌物亚硝胺。
白芍是中药处方中常用的一味养肝补血药，有传统加工方法为芍药根经去皮水煮后硫磺熏制再干燥。目前白芍的产地初加工方法主要采用水煮至透心后晒干，但由于煮后不易晒干、且容易发霉，因此药农普遍采用硫磺熏蒸，尤其在安徽亳州等白芍主产区，约50％的白芍均采用硫磺熏蒸方法，而且至少要熏蒸2～3次，这样处理后白芍不易霉变，晒干后易于储存。有学者通过利用HPLC检测市售的22批白芍饮片，探讨市售白芍饮片低于药典标准的原因，结果显示硫磺熏蒸是导致市售白芍饮片质量改变的原因。在调配时常发现白芍饮片有一股刺激性气味，市场白芍饮片抽检常出现含硫量超标现象。
白芍炮制过程中，因硫磺熏蒸后可使部分芍药苷转变成为新成分芍药苷亚硫酸酯，从而使芍药苷的含量降低。因此，要避免使用硫磺熏蒸，减少有效成分芍药苷的流失。而白芍药材中含硫量的测定方法一般采用2015版中国药典规定的酸碱滴定法，该方法操作较为繁琐，且检测灵敏度相对较低。
因此，非常有必要建立一种快速、灵敏度高的用于白芍的真伪鉴别及熏硫鉴别的检测方法。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种白芍HPLC特征图谱的构建方法，该方法重现性良好，准确可靠，通过所建立的白芍HPLC特征图谱可以实现对白芍是否熏硫及相关伪品全面而有效的鉴别。
本发明是通过以下技术方案实现：
一种白芍HPLC特征图谱的构建方法，包括如下步骤：
(a)混合对照品溶液的制备：取没食子酸、儿茶素、芍药内酯、芍药苷、1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖、苯甲酰芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含没食子酸50μg、儿茶素30μg、芍药内酯100μg、芍药苷160μg、1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖30μg、苯甲酰芍药苷30μg的混合对照品溶液，摇匀，即得；
(b)供试品溶液的制备：取含硫和无硫白芍样品0.4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇50ml，称定重量，超声处理30-45分钟，放冷，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
(c)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈和0.1％磷酸溶液为流动相按下表中的规定进行梯度洗脱；流速：1.0ml/min；柱温为30℃；检测波长为230nm；
(d)含硫白芍对照特征图谱的建立：分别精密吸取混合对照品溶液与含硫供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”，建立含硫白芍对照特征图谱，确定具有7个特征峰，峰1～6分别与参照物峰相对保留时间一致，7个特征峰分别为：峰1为没食子酸、峰2为儿茶素、峰3为芍药内酯、峰4为芍药苷、峰5为1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖、峰6为苯甲酰芍药苷、峰7为芍药苷亚硫酸酯；以峰4芍药苷峰为参照峰，各特征峰的相对保留时间分别为：0.24、0.67、0.87、1.00、1.48、1.85、0.58，其相对保留时间应在规定值的±10％内；且峰7相对峰面积≥0.003。
(e)无硫白芍对照特征图谱的建立：分别精密吸取混合对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”，建立无硫白芍对照特征图谱，确定具有6个特征峰，峰1～6分别与参照物峰相对保留时间一致，6个特征峰分别为：
峰1为没食子酸、峰2为儿茶素、峰3为芍药内酯、峰4为芍药苷、峰5为1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖、峰6为苯甲酰芍药苷；以峰4芍药苷峰为参照峰，各特征峰的相对保留时间分别为：0.25、0.70、0.90、1.0、1.60、2.21，其相对保留时间应在规定值的±10％内，且在相对保留时间为0.58±5％位置出现的色谱峰相对峰面积应＜0.003。
优选的，所述(b)中，含硫白芍样品中二氧化硫的含量大于0小于400mg/kg，符合2015版中国药典规定。
优选的，本发明的白芍UPLC特征图谱的构建方法中还包括步骤(f)色谱峰的指认：通过高效液相色谱-质谱联用分析方法对含硫白芍与无硫白芍进行成分的分析与指认，通过对一级质谱与二级质谱图谱的分析及文献报道，确定含硫白芍中多于无硫白芍的色谱峰7为芍药苷亚硫酸酯。峰7芍药苷亚硫酸酯的存在，是鉴别白芍熏硫与否的标志。
其中，所述高效液相色谱-质谱联用分析方法中，
色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A和0.1％甲酸为流动相B按下表中的规定进行梯度洗脱；流速：0.40ml/min；柱温：30℃；
质谱条件：
MRM多反应监测扫描模式：负离子模式下采集，扫描模式为MRM多反应监测模式，分析物的检测离子对：m/z 543.10/421.01；扫描时间：6.00-9.00min；锥孔电压：20V；碰撞能：40V；
MS全扫描：负离子模式下采集，扫描时间：6.00-9.00min；扫描检测：m/z 300-650；锥孔电压：20V；
二级扫描：负离子模式下采集，扫描时间：6.00-9.00min；检测离子：m/z 507.00；扫描检测：m/z 100-500；锥孔电压：20V；碰撞能：40V。
本发明利用上述建立的含硫白芍对照特征图谱和无硫白芍对照特征图谱，提供了一种白芍的质量检测方法，包括如下步骤：
(a)混合对照品溶液的制备：取没食子酸、儿茶素、芍药内酯、芍药苷、1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖、苯甲酰芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含没食子酸50μg、儿茶素30μg、芍药内酯100μg、芍药苷160μg、1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖30μg、苯甲酰芍药苷30μg的混合对照品溶液，摇匀，即得；
(b)供试品溶液的制备：取白芍样品0.4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇50ml，称定重量，超声处理30-45分钟，放冷，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
(c)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈和0.1％磷酸溶液按下表中的规定进行梯度洗脱；流速：1.0ml/min；柱温为30℃；检测波长为230nm；
(d)鉴别：分别精密吸取混合对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定，即得白芍供试品的特征图谱，将白芍供试品的特征图谱与含硫白芍对照特征图谱和无硫白芍对照特征图谱进行比较，若白芍供试品的特征图谱与所建立的含硫白芍对照特征图谱标准相符，在相对保留时间为0.58±5％位置出现的色谱峰相对峰面积≥0.003，则判断供试品为熏硫白芍样品；若白芍供试品特征图谱与所建立的无硫白芍对照特征图谱标准相符，在相对保留时间为0.58±5％位置的出现的色谱峰相对峰面积＜0.003，则判断供试品为无硫白芍样品；若均不符合，则为白芍伪品。
本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：
本发明针对白芍存在的质量控制问题，分别建立了含硫白芍HPLC特征图谱和无硫白芍HPLC特征图谱，同时采用高效液相色谱-质谱联用分析方法对含硫白芍与无硫白芍进行成分的分析与指认。因白芍在硫磺熏蒸情况下，二氧化硫、水与白芍中芍药苷发生酯化反应，生成了芍药苷亚硫酸酯，该过程反应灵敏，是白芍熏硫与否的标志。因此，采用本发明建立的白芍的HPLC特征图谱鉴别白芍熏硫后产生的芍药苷亚硫酸酯产物来判断白芍药材是否经硫磺熏蒸，其与常规的二氧化硫检测方法相比，该方法简单、灵敏度高、专属性强、重现性好，可以用于白芍熏硫与否的检测，可以较全面、准确快速鉴别白芍的真伪及品质优劣，尤其适合白芍规模化生产的检测和鉴别。
附图说明
图1混合对照品溶液特征图谱；1-6号峰分别为：没食子酸、儿茶素、芍药内酯、芍药苷、1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖和苯甲酰芍药苷。
图2无硫白芍药材对照特征图谱；其中从左到右分别标示了其共有特征峰1-6号峰。
图3含硫白芍药材对照特征图谱；其中从左到右分别标示了其共有特征峰1-7号峰。
图4 25批无硫的白芍药材特征图谱；其中从左到右分别标示了其共有特征峰1-6号峰。
图5 10批含硫的白芍药材特征图谱；其中从左到右分别标示了其共有特征峰1-7号峰。
图6含硫与无硫白芍对照特征图谱比较图；其中从左到右分别标示了其共有特征峰1-7号峰。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明，以下实施例为本发明具体的实施方式，但本发明的实施方式并不受下述实施例的限制。
实施例1：一种白芍HPLC特征图谱的构建方法
1、仪器与试药
Waters高效液相色谱仪(沃特斯公司，Waters e2695)，Agilent高效液相色谱仪(安捷伦公司，1260Infinity)，万分之一天平(梅特勒-托利多公司，ME204E)，百万分之一天平(梅特勒-托利多公司，XP26)；
乙醇(AR)、甲醇(AR)，液相用乙腈、甲醇、磷酸为HPLC色谱级，水为超纯水；
没食子酸(中国食品药品检定研究院，批号：110831-201204，纯度：89.9％)；儿茶素(中国食品药品检定研究院，批号：110877-201604，纯度：99.2％)；芍药内酯苷(成都普非德生物技术有限公司，批号：151109。纯度：98％)；芍药苷(中国食品药品检定研究院，批号：110736-201640，纯度：95.2％)；1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖(成都曼思特生物科技有限公司，批号：MUST-16061211，纯度：98.5％)；苯甲酰芍药苷(成都曼思特生物科技有限公司，批号：MUST-16061803，纯度：99.28％)；
2、色谱条件与供试品溶液的制备
2.1色谱条件：Merck RP-18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，Intersustain C18
(4.6mm×250mm，5μm)，Techway C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；以乙腈和0.1％磷酸溶液为流动相按下表1中的规定进行梯度洗脱；流速：1.0ml/min；柱温为30℃；检测波长为230nm；进样量10μl。
表1梯度洗脱
2.2混合对照品溶液的制备：取没食子酸、儿茶素、芍药内酯、芍药苷、1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖、苯甲酰芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含没食子酸50μg、儿茶素30μg、芍药内酯100μg、芍药苷160μg、1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖30μg、苯甲酰芍药苷30μg的混合对照品溶液，摇匀，即得。
2.3供试品溶液的制备：取白芍样品0.4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇50ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.4测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，即得。
3、供试品溶液制备方法考察
3.1提取溶剂考察
取白芍药材(G161002)约0.4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入甲醇、水、50％甲醇、75％甲醇、50％乙醇、75％乙醇、乙醇50ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，分别用甲醇、水、50％甲醇、75％甲醇、50％乙醇、75％乙醇、乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
实验结果：通过对比7种提取溶剂的图谱可发现：水与50％甲醇对1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖的提取效果较差，色谱峰丢失；75％乙醇与乙醇对没食子酸的峰型影响较大，峰型不佳；75％甲醇、甲醇、稀乙醇为提取溶剂时峰型较好，稀乙醇毒性较低，故选取稀乙醇作为提取溶剂。
3.2提取时间考察
取白芍药材(G161002)约0.4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇50ml，称定重量，分别超声处理15分钟、30分钟、45分钟，放冷，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
实验结果：通过对比不同超声时间的白芍药材特征图谱，可发现随超声时间的增加，各成分提取率略有增加，超声30分钟与超声45分钟时，峰面积差异较小，为方便实验故选取超声时间为30分钟。
3.3提取方式考察
取白芍药材(G161002)约0.4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇50ml，称定重量，分别超声处理30分钟和加热回流30分钟，放冷，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
实验结果：通过对比超声与加热回流两种提取方式的白芍药材特征图谱，可发现提取方式对药材特征图谱的影响较小，超声提取效果略优于加热回流提取，且超声方式较为方便，故选择超声提取作为提取方式。
4、色谱条件的确定
4.1最佳吸收波长的确定
通过对比220nm，230nm，254nm 3种检测波长色谱图，可发现选取220nm作为检测波长时，没食子酸峰型不佳；选取254nm作为检测波长时，基线不平稳；选取230作为检测波长时，各特征峰响应值较大，基线平稳，故选取230nm作为检测波长。
4.2流动相的考察
本次实验选取乙腈-0.5％冰醋酸、乙腈-0.1％甲酸、乙腈-0.1％磷酸溶液、乙腈-0.2％磷酸四种流动相进行比较。
通过对比4种不同流动相的色谱图，可发现选取乙腈-0.5％冰醋酸、乙腈-0.1％甲酸作为流动相时，基线不平。选取乙腈-0.1％磷酸溶液作为流动相时，峰的信息较好，分离效果和响应值优于其他流动相，故选取乙腈-0.1％磷酸溶液作为流动相。
5、方法学考察
5.1仪器精密度考察
取白芍供试品溶液(G161002)，按照上述色谱条件重复进样6次，以芍药苷峰为参照峰，计算相对保留时间与相对峰面积，实验结果见表2、3。实验结果表明，各色谱峰相对保留时间与相对峰面积的RSD<2％，该仪器精密度良好。
表2精密度考察结果(相对峰面积)
表3精密度考察结果(相对保留时间)
5.2稳定性考察
取供试品溶液(G161002)，按照上述色谱条件，分别在0，2，4，8，12，24小时进样，以芍药苷峰为参照峰，计算相对保留时间与相对峰面积，结果见表4、5。实验结果表明，24小时内各色谱峰相对保留时间与相对峰面积的RSD<3％，该供试品溶液在24小时内稳定。
表4稳定性考察结果(相对峰面积)
表5稳定性考察结果(相对保留时间)
5.3重复性考察
取同一批样品(G161002)约0.4g，精密称定，平行6份，制备供试品溶液，以芍药苷峰为参照峰，计算相对保留时间与相对峰面积，实验结果见表6、7。结果表明，除1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖相对峰面积RSD较大，其余各指标RSD在0.04％～1.91％范围内。
表6重复性考察结果(相对保留时间)
表7重复性考察结果(相对峰面积)
6、耐用性实验
6.1不同色谱柱的考察
取白芍供试品溶液(G161002)，分别选择常用色谱柱Merck RP-18、IntersustainC18、techway C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，按上述色谱条件，进样测定，比较不同色谱柱的分离效果。实验结果见表8、表9。
表8不同色谱柱耐用性考察结果(相对保留时间)
表9不同色谱柱耐用性考察结果(相对峰面积)
实验结果显示不同色谱柱时各色谱峰相对保留时间RSD在1.02％～4.24％范围内，相对峰面积RSD在0.44％～6.29％范围内，表明该分析方法不同色谱柱耐用性较好。色谱柱小的变动能满足系统适应性要求。
6.2不同柱温的考察
取同一供试品(G161002)溶液，采用同一色谱柱和液相色谱仪，分别在不同柱温(30℃、35℃、40℃)下，按上述色谱条件，进样测定，实验结果见表10、表11。
表10不同柱温耐用性考察结果(相对保留时间)
表11不同柱温耐用性考察结果(相对峰面积)
结果显示：不同柱温时，各色谱峰相对保留时间RSD在0.5％～4.33％范围内，相对峰面积RSD在2.3％～16.19％范围内，其中芍药内酯苷相对峰面积受温度影响较大，故柱温须设定为30℃。
6.3不同流速的考察
取白芍药材备供试品溶液(G161002)，分别用不同流速(0.9ml/min、1.0ml/min、1.1ml/min)，按上述色谱条件，进样测定，结果见表12～13。
表12不同流速耐用性考察结果(相对保留时间)
表13不同流速耐用性考察结果(相对峰面积)
结果显示不同流速时各色谱峰相对峰面积RSD在1.54％～3.76％范围内，相对保留时间RSD在0.1％～4.25％范围内，表明该分析方法不同流速耐用性较好。
7、无硫白芍特征图谱的测定
7.1样品测定
取无硫白芍药材样品25批，25批白芍药材采自全国五大主产区，经广东一方制药有限公司质量中心鉴定，均符合中国药典2015版一部规定，样品信息如下表14所示，按照上述制备方法和色谱条件测定样品特征图谱，测定结果见表15、表16，图谱见图4所示。
表14 25批白芍药材的产地信息表
表15 25批无硫白芍药材特征图谱(相对保留时间)
表16 25批无硫白芍配方颗粒特征图谱(相对峰面积)
结果：25批样品中特征峰的保留时间RSD均小于3.0％，符合标准规定；但各特征峰的相对峰面积差异较大，RSD值在31.78～77.90％之间，说明不同产地样品所含各成分的相对峰面积比例差异较大，各特征峰的峰面积一定程度上反应不同样品的质量情况。
7.2无硫白芍对照特征图谱的建立
将25批无硫白芍药材特征图谱采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》，通过匹配，生成对照图谱，建立无硫白芍药材对照特征图谱，如图5所示。
确定无硫白芍药材的对照特征图谱中应有6个特征峰，6个特征峰分别与参照物峰相对保留时间一致，分别为：没食子酸(峰1)、儿茶素(峰2)、芍药内酯(峰3)、芍药苷(峰4)、1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖(峰5)、苯甲酰芍药苷(峰6)；以峰4芍药苷峰为参照峰，各特征峰的相对保留时间分别为：0.25、0.70、0.90、1.0、1.60、2.21，其相对保留时间应在规定值的±10％内。
8、含硫白芍特征图谱的测定
8.1样品测定
取含硫白芍药材样品10批，(自制，二氧化硫含量为24～375mg/kg范围，均符合2015版中国药典规定)，按照上述制备方法和色谱条件测定样品特征图谱，测定结果见表17、表18，图谱如图5所示。
表17 10批含硫白芍特征图谱(相对保留时间)
表18 10批含硫白芍特征图谱(相对峰面积)
结果：10批熏硫的白芍样品中7个特征峰的保留时间RSD均小于3.0％，符合标准规定；但各特征峰的相对峰面积差异较大，说明不同产地样品所含各成分的相对峰面积比例差异较大，各特征峰的峰面积一定程度上反应不同样品的质量情况；其中与无硫白芍差异的7号峰的相对峰面积均≥0.005。
8.2含硫白芍对照特征图谱的建立
将10批含硫白芍药材特征图谱使用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》，通过匹配，生成对照图谱，建立含硫白芍药材对照特征图谱。
确定含硫白芍药材的特征图谱中应有7个特征峰，峰1～6分别与参照物峰相对保留时间一致，7个特征峰分别为：没食子酸(峰1)、儿茶素(峰2)、芍药内酯(峰3)、芍药苷(峰4)、1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖(峰5)、苯甲酰芍药苷(峰6)、芍药苷亚硫酸酯(峰7)；以峰5芍药苷峰为参照峰，各特征峰的相对保留时间分别为：0.24、0.67、0.87、1.00、1.48、1.85、0.58，其相对保留时间应在规定值的±10％内。
9、含硫白芍与无硫白芍的比较
比较含硫白芍与无硫白芍的对照特征图谱差异，根据11批二氧化硫限量符合2015版药典标准要求的含硫白芍，考察7号峰及相对峰面积的大小，结果见表19和20，对照图谱如图6所示。
表19 25批无硫白芍7号峰相对峰面积
表20 10批含硫白芍7号峰相对峰面积
结果：含硫白芍在相对保留时间为0.58(±5％)位置，具有明显的7号峰，25批无硫白芍7号峰相对峰面积范围为0.000～0.001，10批含硫白芍(二氧化硫含量为24～375mg/kg)药材7号峰相对峰面积范围为0.005～0.170，因此，规定含硫白芍7号峰相对峰面积≥0.003，无硫白芍7号峰相对峰面积应＜0.003。
10、色谱峰的指认
10.1仪器与试药
仪器：Waters液质联用仪(液相部分ACQUITY UPLC H-Class Core System、质谱部分Waters Xevo TQD MS)，万分之一天平(梅特勒-托利多公司，ME204E)，百万分之一天平(梅特勒-托利多公司，XP26)；
试剂：乙醇(AR)、甲醇(AR)，甲酸为质谱级，液相用乙腈、甲醇、为质谱级，水为超纯水；
试药：白芍饮片(1批，广东一方制药有限公司)；熏硫白芍饮片(批号：GS1608001)。10.2色谱条件
色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18(1.7μm 2.1×50mm)；进样量：2μl；流动相：以乙腈为流动相A，0.1％甲酸为流动相B按如下表进行梯度洗脱；流速：0.40ml/min；柱温：30℃；
10.3质谱条件：
MRM多反应监测扫描模式：负离子模式下采集，扫描模式为MRM多反应监测模式，分析物的检测离子对：m/z 543.10/421.01；扫描时间：6.00-9.00min；锥孔电压：20V；碰撞能：40V；
MS全扫描：负离子模式下采集，扫描时间：6.00-9.00min；扫描检测：m/z 300-650；锥孔电压：20V；
二级扫描：负离子模式下采集，扫描时间：6.00-9.00min；检测离子：m/z 507.00；扫描检测：m/z 100-500；锥孔电压：20V；碰撞能：40V。
10.4测定结果
通过高效液相色谱-质谱联用分析方法对含硫白芍与无硫白芍进行成分的分析与指认，通过对一级质谱与二级质谱图谱的分析及文献报道，确定含熏白芍中多于无硫白芍的色谱峰为芍药苷亚硫酸酯。
实施例2：一种白芍的质量检测方法
包括如下步骤：
供试品溶液的制备：取待测白芍样品(批号：G160915)0.4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇50ml，称定重量，超声处理20-40分钟，放冷，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
鉴别：精密吸取供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，测定，即得待测白芍的特征图谱，所述色谱条件同“2.1色谱条件”项。
将待测白芍的特征图谱与含硫白芍对照特征图谱和无硫白芍对照特征图谱进行比较，若待测白芍的特征图谱与所建立的含硫白芍对照特征图谱标准相符，在相对保留时间为0.58±5％位置出现的色谱峰相对峰面积≥0.003，则判断待测样品为熏硫白芍样品；若待测白芍的特征图谱与所建立的无硫白芍对照特征图谱标准相符，在相对保留时间为0.58±5％位置的出现的色谱峰相对峰面积＜0.003，则判断待测样品为无硫白芍样品；若均不符合，则为白芍伪品。

Claims (5)

1.一种白芍HPLC特征图谱的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)混合对照品溶液的制备：取没食子酸、儿茶素、芍药内酯、芍药苷、1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖、苯甲酰芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含没食子酸50μg、儿茶素30μg、芍药内酯100μg、芍药苷160μg、1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖30μg、苯甲酰芍药苷30μg的混合对照品溶液，摇匀，即得；
(b) 供试品溶液的制备：分别取含硫和无硫白芍样品0.4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇50ml，称定重量，超声处理30-45分钟，放冷，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
(c) 色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈和0.1%磷酸溶液为流动相按下表中的规定进行梯度洗脱；流速：1.0ml/min；柱温为30℃；检测波长为230nm；
（d）含硫白芍对照特征图谱的建立：分别精密吸取混合对照品溶液与含硫供试品溶液各10µl，注入高效液相色谱仪，测定，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”，建立含硫白芍对照特征图谱，确定具有7个特征峰，峰1~6分别与参照物峰相对保留时间一致，7个特征峰分别为：峰1为没食子酸、峰2为儿茶素、峰3为芍药内酯、峰4为芍药苷、峰5为1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖、峰6为苯甲酰芍药苷、峰7为芍药苷亚硫酸酯；以峰4芍药苷峰为参照峰，各特征峰的相对保留时间分别为：0.24、0.67、0.87、1.00、1.48、1.85、0.58，其相对保留时间应在规定值的±10%内；且峰7相对峰面积≥0.003；
（e）无硫白芍对照特征图谱的建立：分别精密吸取混合对照品溶液与无硫供试品溶液各10µl，注入高效液相色谱仪，测定，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”，建立无硫白芍对照特征图谱，确定具有6个特征峰，峰1~6分别与参照物峰相对保留时间一致，6个特征峰分别为：峰1为没食子酸、峰2为儿茶素、峰3为芍药内酯、峰4为芍药苷、峰5为1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖、峰6为苯甲酰芍药苷；以峰4芍药苷峰为参照峰，各特征峰的相对保留时间分别为：0.25、0.70、0.90、1.0、1.60、2.21，其相对保留时间应在规定值的±10%内，且在相对保留时间为0.58±5%位置出现的色谱峰相对峰面积应＜0.003。
2.根据权利要求1所述的一种白芍UPLC特征图谱的构建方法，其特征在于，所述（b）中，含硫白芍样品中二氧化硫的含量大于0小于400mg/kg。
3.根据权利要求1所述的一种白芍HPLC特征图谱的构建方法，其特征在于，还包括步骤（f）色谱峰的指认：通过高效液相色谱-质谱联用分析方法对含硫白芍与无硫白芍进行成分的分析与指认，通过对一级质谱与二级质谱图谱的分析及文献报道，确定含硫白芍中多于无硫白芍的色谱峰为芍药苷亚硫酸酯。
4.根据权利要求3所述的一种白芍HPLC特征图谱的构建方法，其特征在于，所述高效液相色谱-质谱联用分析方法中，
色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A和0.1%甲酸为流动相B按下表中的规定进行梯度洗脱；流速：0.40 ml/min；柱温：30℃；
质谱条件：
MRM 多反应监测扫描模式：负离子模式下采集，扫描模式为MRM多反应监测模式，分析物的检测离子对：m/z 543.10/421.01；扫描时间： 6.00-9.00min；锥孔电压：20V；碰撞能：40V；
MS全扫描：负离子模式下采集，扫描时间：6.00-9.00min；扫描检测：m/z 300- 650；锥孔电压：20V；
二级扫描：负离子模式下采集，扫描时间：6.00-9.00min；检测离子：m/z 507.00；扫描检
测：m/z 100 - 500；锥孔电压：20V；碰撞能：40V。
5.一种白芍的质量检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)混合对照品溶液的制备：取没食子酸、儿茶素、芍药内酯、芍药苷、1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖、苯甲酰芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含没食子酸50μg、儿茶素30μg、芍药内酯100μg、芍药苷160μg、1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖30μg、苯甲酰芍药苷30μg的混合对照品溶液，摇匀，即得；
(b) 供试品溶液的制备：取白芍样品0.4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇50ml，称定重量，超声处理30-45分钟，放冷，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
(c) 色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈和0.1%磷酸溶液按下表中的规定进行梯度洗脱；流速：1.0ml/min；柱温为30℃；检测波长为230nm；
（d）鉴别：分别精密吸取混合对照品溶液与供试品溶液各10µl，注入高效液相色谱仪，测定，即得白芍供试品的特征图谱，将白芍供试品的特征图谱与含硫白芍对照特征图谱和无硫白芍对照特征图谱进行比较，若白芍供试品的特征图谱与所建立的含硫白芍对照特征图谱标准相符，在相对保留时间为0.58±5%位置出现的色谱峰相对峰面积≥0.003，则判断供试品为熏硫白芍样品；若白芍供试品特征图谱与所建立的无硫白芍对照特征图谱标准相符，在相对保留时间为0.58±5%位置的出现的色谱峰相对峰面积＜0.003，则判断供试品为无硫白芍样品；若均不符合，则为白芍伪品。
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