CN112858523A - 一种建立区别川赤芍与芍药基源药物的药物制剂的指纹图谱的方法 - Google Patents

一种建立区别川赤芍与芍药基源药物的药物制剂的指纹图谱的方法 Download PDF

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CN112858523A CN202110205166.7A CN202110205166A CN112858523A CN 112858523 A CN112858523 A CN 112858523A CN 202110205166 A CN202110205166 A CN 202110205166A CN 112858523 A CN112858523 A CN 112858523A
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Abstract

本发明涉及一种建立区别川赤芍与芍药基源药物的药物制剂的指纹图谱的方法。该方法，以赤芍(川赤芍)配方颗粒中间体及配方颗粒为检测对象，建立了针对该药物制剂的指纹图谱的方法，获得了较为全面的图谱信息，确认了8个共有特征峰，并指认出1号峰没食子酸、2号峰芍药内脂苷、3号峰芍药苷、6号峰1，2，3，4，6‑五没食子酰葡萄糖、7号峰苯甲酸、8号峰苯甲酰芍药苷，选择3号峰芍药苷作为内参考峰，确定了赤芍(川赤芍)配方颗粒的共有特征峰的相对保留时间，且结合该指纹图谱峰1和峰6的相对峰面积，能够全面地、快速地检测其质量，有利于其全面质量检测和整体质量控制，从而有助于提高该药物使用的安全性和稳定性。同时，该方法具有稳定性高、精密度高、重复性好等优点。并应用该方法区别川赤芍与赤芍基源药物的药物制剂。

Description

一种建立区别川赤芍与芍药基源药物的药物制剂的指纹图谱 的方法
技术领域
本发明属于药物分析领域，具体涉及一种建立区别川赤芍与芍药基源药物的药物制剂的指纹图谱的方法。
背景技术
赤芍为毛茛科植物芍药Paeonia lactiflora Pall.或川赤芍Paeonia veitchiiLynch的干燥根。主要含有苷类、鞣质、黄酮、有机酸等成分，具有清热凉血，散瘀止痛之功效。赤芍配方颗粒是通过对中药赤芍进行提取、浓缩、制粒所得。配方颗粒中间体是通过对中药赤芍进行提取、浓缩、干燥所得。
白芍为毛茛科植物芍药Paeonia lactiflora Pall.的干燥根。夏、秋二季采挖，洗净，除去头尾和细根，置沸水中煮后除去外皮或去皮后再煮，晒干。
《中国药典》2020年版对赤芍的质量控制包括原植物品种、药材性状、理化鉴别、含量测定等项目，文献也对赤芍中化学成分进行阐述，包括含有苷类、鞣质、黄酮、有机酸等成分。然而，一方面，通过上述单一成分的含量测定或鉴别赤芍配方颗粒，不能从整体上检测和控制其质量，且无法区别不同基源的赤芍；另一方面，通过单一成分的含量测定联合其他成分的鉴别赤芍配方颗粒，费时、费力，难以广泛地应用于生产实践。此外，中药配方颗粒趋势是同名不同基源的品种，根据药用价值，建立不同的质量标准体系及区别生产或用药。
因此，建立一种能够全面地、快速地检测赤芍(川赤芍)配方颗粒的方法，对于其全面质量检测和整体质量控制，以及区别川赤芍或芍药基源，尤其是多基源赤芍具有重要意义。
发明内容
为此，本发明提出一种建立区别川赤芍与芍药基源药物的药物制剂的指纹图谱的方法，包括如下步骤：
1)取川赤芍药物制剂或芍药基源药物的药物制剂制备为供试溶液；
2)取供试溶液进行高效液相色谱检测，得供试品溶液的液相色谱图；
色谱条件包括：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A、以0.05％的磷酸溶液为流动相B按照如下程序进行梯度洗脱，按照如下程序进行梯度洗脱：
0-12min，A与B的体积比由5％∶95％变为8％∶92％；
12-18min，A∶B的体积比由8％∶92％变为15％∶85％；
18-35min，A∶B的体积比由15％∶85％变为18％∶82％；
35-40min，A∶B的体积比由18％∶82％变为19％∶81％；
40-50min，A∶B的体积比由19％∶81％变为20％∶80％；
50-55min，A∶B的体积比由20％∶80％变为40％∶60％；
55-60min，A∶B的体积比由40％∶60％变为5％∶95％；
60-65min，A∶B的体积比为5％∶95％；
上述百分数为体积百分数。
可选的，步骤3)中，所用色谱柱为Kromasil C18，规格为：5μm，4.6mm×250mm；前13分钟检测波长为230nm，13分钟后检测波长为225nm；
可选的，柱温为30℃；供试品溶液或对照品溶液的进样量为10μL。
供试溶液的制备方法：包括采用有机溶剂对川赤芍药物制剂或芍药基源药物的药物制剂进行提取、过滤，取滤液的步骤；川赤芍药物制剂或芍药基源药物的药物制剂与有机溶剂比为(0.05-0.5)∶(15-50)；比例关系为g/mL；
可选的，川赤芍药物制剂或芍药基源药物的药物制剂与有机溶剂比为0.1∶25，比例关系为g/mL；
可选的，采用的有机溶剂为体积分数为30％-70％的甲醇水溶液；更可选的，有机溶剂为体积分数为60％的甲醇水溶液；
可选的，提取的方式为振摇提取或超声提取；更可选的，提取的方式为超声提取；
提取时间为30min-60min；更可选的，提取时间为30min。
可选的，供试溶液的制备方法包括如下步骤：取待测川赤芍药物制剂或芍药基源药物的药物制剂0.05-0.5重量份，精密称定，精密加入30％～70％甲醇水溶液15-50体积份，称定重量，振摇提取或超声提取30-60分钟，放冷，再称定重量，取30～70％甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，作为供试溶液；
可选的，所述方法还包括对照品溶液的制备和将步骤2)中的供试溶液替换为对照品溶液进行实验的步骤；
对照品溶液的制备方法包括如下步骤：称取没食子酸，加体积百分数为30％～70％甲醇水溶液(60％甲醇水溶液)，摇匀，作为对照品A溶液，每1体积份对照品A溶液中含0.00002重量份没食子酸；
称取芍药内脂苷，加体积百分数为30％～70％甲醇水溶液(60％甲醇水溶液)，摇匀，作为对照品B溶液；每1体积份对照品B溶液中含0.00002重量份的芍药内脂苷；
称取芍药苷，加体积百分数为30％～70％甲醇水溶液(60％甲醇水溶液)，摇匀，作为对照品C溶液；每1体积份照品C溶液中含0.00002重量份芍药苷；
称取1，2，3，4，6-五没食子酰葡萄糖，加体积百分数为30％～70％甲醇水溶液(60％甲醇水溶液)，摇匀，作为对照品D溶液；每1体积份对照品D溶液中含0.00002重量份1，2，3，4，6-五没食子酰葡萄糖；
称取苯甲酸，加体积百分数为30％～70％甲醇水溶液(60％甲醇水溶液)，摇匀，作为对照品E溶液；每1体积份对照品E溶液中含0.00002重量份苯甲酸；
称取苯甲酰芍药苷，加体积百分数为30％～70％甲醇水溶液(60％甲醇水溶液)，摇匀，作为对照品F溶液；每1体积份对照品F溶液中含0.00002重量份的苯甲酰芍药苷；
重量份与体积份的比例关系为g/mL；
可选的，所述药物制剂为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、蜜炼丸剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口服液体制剂或注射制剂。
可选的，所述川赤芍药物制剂或芍药基源药物的药物制剂的制各方法包括如下步骤：
取赤芍，加热回流提取至少1次，每次加入至少7重量倍量的水提取至少25min，过滤，合并滤液，滤液浓缩至60℃时相对密度为1.04～1.12g/mL，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床上可接受的片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、蜜炼丸剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口服液体制剂或注射制剂。
可选的，上述川赤芍药物制剂或芍药基源药物的药物制剂的制备方法包括如下步骤：
取赤芍，加热回流提取2次，每次加入7～12重量倍量的水提取25min～1h，过滤，合并滤液，滤液浓缩至60℃相对密度为1.04～1.12，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床上可接受的片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、蜜炼丸剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口服液体制剂或注射制剂。
可选的，上述川赤芍药物制剂或芍药基源药物的药物制剂制备方法包括如下步骤：
1)取川赤芍或芍药基源药物，加热回流提取2次；第1次加入9重量倍量的水提取30分钟，第2次加入7重量倍量的水提取25分钟，得到提取液；
2)将提取液过滤，合并滤液，滤液浓缩至60℃相对密度为1.04～1.12，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床上可接受的片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、蜜炼丸剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口服液体制剂或注射制剂。
可选的，所述芍药基源药物为白芍或芍药基源的赤芍。
可选的，所述川赤芍药物制剂的指纹图谱包含8个特征峰，依次为1-8号峰，1号峰为没食子酸、2号峰为芍药内脂苷、3号峰为芍药苷、6号峰为1，2，3，4，6-五没食子酰葡萄糖、7号峰为苯甲酸、8号峰为苯甲酰芍药苷，以3号峰为内参考峰，各峰号的相对保留时间依次为：0.22-0.25，0.87-0.96，0.95-1.05，1.05-1.16，1.28-1.41，1.37-1.52，1.43-1.58，2.08-2.30；峰1的相对峰面积不低于0.45，峰6的相对峰面积不低于0.10；
可选的，各峰号的相对保留时间依次为：0.24、0.92、1.00、1.11、1.34、1.44、1.50、2.19；
所述芍药基源药物的药物制剂的指纹图谱与川赤芍药物制剂的指纹图谱相比，缺失峰6，且峰1峰面积与参照峰的比值小于0.45。
上述的方法在如下任一种中的应用：
(I)赤芍的药物制剂的质量检测和/或质量控制；
(II)区别川赤芍药物制剂或芍药基源药物的药物制剂。
可选的，所述芍药基源药物为白芍或芍药基源的赤芍。
本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
1、本发明提供一种建立区别川赤芍与芍药基源药物的药物制剂的指纹图谱的方法，以赤芍(川赤芍)药物制剂(配方颗粒中间体及配方颗粒)为检测对象，建立了针对该药物制剂的指纹图谱的方法，获得了较为全面的图谱信息，确认了8个共有特征峰，并指认出1号峰没食子酸、2号峰芍药内脂苷、3号峰芍药苷、6号峰1，2，3，4，6-五没食子酰葡萄糖、7号峰苯甲酸、8号峰苯甲酰芍药苷，选择3号峰芍药苷作为指纹图谱中的内参考峰，确定了赤芍(川赤芍)配方颗粒的共有特征峰的相对保留时间和相对峰面积，结合川赤芍药物制剂指纹图谱中多个色谱峰的信息，能够全面地、快速地检测赤芍(川赤芍)配方颗粒的质量，有利于赤芍药物制剂全面质量检测和整体质量控制，从而有助于提高该药物使用的安全性和稳定性。同时，该方法具有稳定性高、精密度高、重复性好等优点。本发明可以快速简便的区别川赤芍药物制剂和芍药基源药物的药物制剂，尤其在不同基源赤芍检测中，运用本发明的构建的指纹图谱能快速简便地的区别赤芍的基源(芍药基源药物的药物制剂指纹图谱与川赤芍药物制剂的指纹图谱相比，缺失峰6，且峰1峰面积与参照峰的比值小于0.45)。
2、本发明的建立区别川赤芍与芍药基源药物的药物制剂的指纹图谱的方法，不仅适用于川赤芍药物制剂也适用于芍药基源药物的药物制剂，能够快速简便的区别川赤芍药物制剂和赤芍(芍药基源)药物制剂。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中：
图1～图3分别是本发明实施例2中梯度1、2、3的色谱图；
图4～图9分别是本发明实施例2中不同流动相的色谱图；
图10～图13是本发明实施例2中不同色谱柱的色谱图；
图14～图16是本发明实施例2中不同流速的色谱图；
图17～图19是本发明实施例2中不同柱温的色谱图；
图20～图23是本发明实施例2中不同进样量的色谱图；
图24～图26是本发明实施例2中不同提取时间的色谱图；
图27～图33是本发明实施例2中不同提取溶剂的色谱图；
图34～图36是本发明实施例2中不同溶剂加入量的色谱图；
图37是本发明实施例2中15批赤芍(川赤芍)配方颗粒中间体和3批赤芍(川赤芍)配方颗粒的特征指纹图谱；
图38是本发明实施例2中赤芍(川赤芍)配方颗粒的对照特征指纹图谱；
图39是本发明实施例2中不同特征峰的对照品定位图；
图40是本发明实施例3中精密度实验结果；
图41是本发明实施例3中中间精密度实验结果；
图42是本发明实施例3中重复性实验结果；
图43～图44是本发明实施例3中专属性实验结果；
图45是本发明实施例3中稳定性实验结果；S1：稳定性0h；S2：稳定性4h；S3：稳定性8h；S4：稳定性12h；S5：稳定性24h；
图46是本发明实施例4中川赤芍或芍药基源药物区别实验结果。
具体实施方式
根据药典记载，稀乙醇的为：取乙醇529ml，加水稀释至1000ml，即得。
实施例1
赤芍(川赤芍)配方颗粒的制备方法为：取川赤芍200kg，加热回流提取2次，第1次加入9重量倍量的水提取30分钟，第2次加入7重量倍量的水提取25分钟，过滤，合并滤液，滤液浓缩至60℃相对密度为1.04～1.12，加入常规辅料，按照常规工艺，制成颗粒剂。
本实施例建立赤芍(川赤芍)配方颗粒的指纹图谱的方法，包括如下步骤：
(1)取待测赤芍(川赤芍)的药物制剂0.10g，精密称定，精密加入60％(v/v)甲醇水溶液25mL，称定重量，超声提取30分钟，冷却，再称定重量，取60％甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，作为供试品溶液；
(2)分别精密称取没食子酸、芍药内脂苷、芍药苷、1，2，3，4，6-五没食子酰葡萄糖、苯甲酸、苯甲酰芍药苷对照品，加60％(v/v)甲醇水溶液制成每1mL含0.00002g没食子酸、芍药内脂苷、芍药苷、1，2，3，4，6-五没食子酰葡萄糖、苯甲酸或苯甲酰芍药苷的溶液，摇匀，作为对照品溶液；
(3)分别精密吸取供试品溶液、对照品溶液0.01mL，注入高效液相色谱仪，按以下色谱条件测定，分别得供试品溶液、对照品溶液的液相色谱。
色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A、以0.05％(v/v)的磷酸溶液为流动相B按照如下程序进行梯度洗脱：0-12min，A∶B为5％∶95％→8％∶92％；12-18min，A∶B为8％∶92％→15％∶85％；18-35min，A∶B为15％∶85％→18％∶82％；35-40min，A∶B为18％∶82％→19％∶81％；40-50min，A∶B为19％∶81％→20％∶80％；50-55min，A∶B为20％∶80％→40％∶60％；55-60min，A∶B为40％∶60％→5％∶95％；60-65min，A∶B为5％∶95％；检测波长为前13分钟为230nm，13分钟后转换为225nm，柱温为30℃，流速为1mL/min；上述百分数为体积百分数。
实施例2
一、仪器与试药
仪器包括：高效液相色谱仪、天平、超声波发生器、超纯水系统；
试药包括：乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯；赤芍(川赤芍)配方颗粒中间体(序号1-15)及赤芍(川赤芍)配方颗粒(序号16-18)由华润三九医药股份有限公司提供，按照实施例1的制备方法制备而成(中间体是指制粒前的干燥样品)。
二、色谱分析条件的确定
(1)检测波长的选择
除前13分钟检测波长外，其他条件与实施例1相同，将前13分钟检测波长作为变量，具体为210nm、225nm、230nm、254nm、270nm、280nm或230nm，根据不同波长的下的色谱图，以色谱峰数量和峰高作为指标，确定前13分钟为230nm，13分钟后转换为225nm作为检测波长。
(2)梯度的选择
除梯度洗脱程序外，其他条件与实施例1相同，将梯度洗脱程序作为变量，不同的梯度洗脱程序如表1～3所示，表1～3梯度洗脱程序得到的色谱图如图1～3所示。由图1～3可知，梯度3洗脱呈现的图谱，色谱信息较丰富，分离度较好，基线较平稳，故确定了流动相梯度为梯度3做后续的条件筛选，以期达到更好地分离效果。
表1梯度1的梯度洗脱程序
Figure BDA0002949197920000071
注：上述百分比均为体积百分数。
表2梯度2的梯度洗脱程序
Figure BDA0002949197920000072
Figure BDA0002949197920000081
注：上述百分比均为体积百分数。
表3梯度3的梯度洗脱程序
Figure BDA0002949197920000082
注：上述百分比均为体积百分数。
(3)流动相成分的选择
除流动相外，其他条件与实施例1相同，将流动相作为变量，选择流动相分别为乙腈(流动相A)-水(流动相B)、乙腈(流动相A)-0.1％(v/v)磷酸溶液(流动相B)、乙腈(流动相A)-0.02％(v/v)磷酸溶液(流动相B)、乙腈(流动相A)-0.05％(v/v)磷酸溶液(流动相B)、乙腈(流动相A)-0.1％(v/v)甲酸溶液(流动相B)、乙腈(流动相A)-1％(v/v)乙酸溶液(流动相B)的赤芍(川赤芍)配方颗粒分离效果，上述几种流动相的色谱图依次见图4～9。由图4～9可知，与其他流动相比，乙腈(流动相A)-0.05％(v/v)磷酸溶液(流动相B)更适合于赤芍(川赤芍)配方颗粒所有成分的分离。
(4)不同色谱柱的考察
除色谱柱外，其他条件与实施例1相同，将色谱柱作为变量。取同一份赤芍(川赤芍)配方颗粒样品的供试品溶液，考察了实验室中现有的色谱柱：(1)Thermo C18，5μm，4.6mm×250mm；(2)Agilent ZORBAX SB-C18，5μm，4.6mm×250mm；(3)Waters
Figure BDA0002949197920000083
C18，5μm，4.6mm×250mm；(4)Kromasil C18，5μm，4.6mm×250mm。上述(1)-(4)色谱柱得到的色谱图依次见图10～13。由图10～13可知，Kromasil C18，5μm，4.6mm×250mm对赤芍(川赤芍)配方颗粒的分离效果较好。
(5)不同流速的考察
其他条件与实施例1相同，将流速作为变量，分别以0.9mL/min、1.0mL/min，1.1mL/min流速测定，上述不同流速的色谱图依次见图14～16。由图14～16可知，流速为1.0mL/min流速的色谱效果较好。
(6)不同柱温的选择
其他条件与实施例1相同，将柱温作为变量，取同一份赤芍(川赤芍)配方颗粒样品的供试品溶液，考察不同柱温25℃、30℃、35℃对本品的分离效果，上述不同柱温的色谱图依次见图17～19，系统适应性参数如表4所示。由图17～19和表4可知，柱温为30℃的色谱图，其各成分分离效果较好，结合芍药苷的色谱峰系统适应性参数以及色谱峰的个数，故选择柱温为30℃。
表4柱温为30℃的色谱峰系统适应性参数
Figure BDA0002949197920000091
(7)进样量考察
其他条件与实施例1相同，将进样量作为变量，进样量为5μL、10μL、15μL、20μL的色谱图如图20～23所示，系统适应性参数如表5所示。由图20～23和表5可知，进样量为10μL的色谱图的效果较好。
表5不同进样量的色谱峰的系统适应性参数
Figure BDA0002949197920000092
Figure BDA0002949197920000101
(8)最终色谱条件
色谱柱：Kromasil C18色谱柱(250mm，4.6mm，5μm)；以乙腈(流动相A)-0.05％磷酸溶液(流动相B)为流动相，梯度洗脱如表3所示；流速：1.0mL/min；柱温为30℃；检测波长为前13分钟为225nm，13分钟后转换为230nm，理论板数按芍药苷峰计算应不低于3000，进样量：10μL。
三、供试品溶液的制备
(1)提取时间的选择
赤芍(川赤芍)配方颗粒的制备方法为实施例1中的方法，其他条件不变，将提取时间作为变量，提取时间为30min、45min、60min的色谱图如图24～26所示，系统适应性参数如表6所示。由图24～26和表6所示，不同的超声时间的溶解效果及色谱图无明显差异，故选择提取时间为30min。
表6不同提取时间下赤芍(川赤芍)配方颗粒色谱图参数
Figure BDA0002949197920000102
Figure BDA0002949197920000111
(2)提取溶剂的选择
赤芍(赤芍(川赤芍))配方颗粒的制备方法为实施例1中的方法，其他条件不变，将提取溶剂作为变量，提取溶剂为甲醇、乙醇、30％(v/v)甲醇、50％(v/v)甲醇、60％(v/v)甲醇、70％(v/v)甲醇、稀乙醇色谱图依次对应图27～33所示，主要特征峰的系统适应性参数如表7(7-1、7-2)所示。由图27～33和表7可知，提取溶剂为60％甲醇时，所得色谱图的峰型较好，系统适应性参数相对较优。
表7-1不同提取溶剂的色谱图的系统适应性参数
Figure BDA0002949197920000112
表7-2不同提取溶剂的色谱图的系统适应性参数
Figure BDA0002949197920000113
Figure BDA0002949197920000121
(3)提取溶剂加入量的选择
赤芍(川赤芍)配方颗粒的制备方法为实施例1中的方法，其他条件不变，根据确定的提取溶剂，考察60％(v/v)甲醇的不同加入量：15mL、25mL、50mL，以色谱峰的个数和芍药苷的分离效果和系统适应性参数作为考察指标，上述不同提取溶剂的加入量依次对应色谱图34～36，系统适应性参数如表8所示。由图34～36和表8可知，加入不同体积的提取溶剂对赤芍(川赤芍)配方颗粒的提取效果相近，色谱分离效果无明显差异。因此选择25mL的60％甲醇的色谱图的效果较好。
表8不同提取溶剂量的色谱峰的系统适应性参数
Figure BDA0002949197920000122
Figure BDA0002949197920000131
(3)最终提取方案
供试品溶液的制备方法为：取本品粉末约0.10g，置具塞锥形瓶中，加入60％甲醇25mL，超声处理(功率250W，频率53kHz)30分钟，取出，放冷，滤过，取续滤液，即得。
四、赤芍(川赤芍)配方颗粒特征指纹图谱的建立
参照中药配方颗粒质量标准指导原则及2020版《中国药典》，并进行方法学考察。
根据实施例1和本实施例，确定赤芍(川赤芍)配方颗粒中间体HPLC特征指纹图谱按如下方法建立：
(1)供试品溶液的制备：取赤芍(川赤芍)配方颗粒中间体粉末0.10g，置具塞锥形瓶中，加入60％甲醇25mL，超声处理(功率250W，频率53kHz)30分钟，取出，放冷，滤过，取续滤液，即得；参照物溶液的制备：取没食子酸、芍药内脂苷、芍药苷、1，2，3，4，6-五没食子酰葡萄糖、苯甲酸、苯甲酰芍药苷对照品适量，精密称定，加60％甲醇制成每1mL分别含对照品20μg的对照品溶液，即得(10℃以下保存)。
(2)高效液相HPLC色谱分析条件：色谱柱：Kromasil 100-5C18色谱柱(250mm，4.6mm，5μm)；以乙腈(流动相A)-0.05％磷酸溶液(流动相B)为流动相，梯度洗脱如表3所示；流速：1.0mL/min；柱温为30℃；检测波长为前13分钟为230nm，13分钟后转换为225nm，理论板数按芍药苷峰计算应不低于3000，进样量：10μL。按上述方法进行赤芍(川赤芍)配方颗粒中间体特征指纹图谱的共有模式的建立。并应用到赤芍(川赤芍)配方颗粒的特征图谱测定，并对配方颗粒的方法学进行验证。
取15个批次(S1-S15)的赤芍(川赤芍)配方颗粒中间体及3批(S16-S18)赤芍(川赤芍)配方颗粒样品作为供试品溶液，通过高效液相色谱得到赤芍(川赤芍)配方颗粒及其中间体特征指纹图谱，图37为15批赤芍(川赤芍)配方颗粒中间体和3批赤芍(川赤芍)配方颗粒的特征指纹图谱(S1～S18依次为批号S1：1904002Y S2：1903001Y S3：1904003Y S4：1904004Y S5：1904005Y S6：1904006Y S7：1904007Y S8：1904008Y S9：1904009Y S10：1904010Y S11：1904011Y S12：1904012Y S13：1904013Y S14：1904014Y S15：1904015Y、S16：1906001Y、S17：1906002Y、S18：1906003Y)，图38为赤芍(川赤芍)配方颗粒对照特征指纹图谱。
由图37～38可知，赤芍(川赤芍)配方颗粒HPLC特征指纹图谱共有色谱峰8个，其中6个峰(峰1、2、3、6、7、8)为已知成分峰；选取3号峰芍药苷为内参考峰(S峰)，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5％范围之内，规定值分别为：0.24(1号峰，没食子酸)、0.92(2号峰，芍药内脂苷)、1.00(3号峰，芍药苷)、1.11(4号峰)、1.34(5号峰)、1.44(6号峰，1，2，3，4，6-五没食子酰葡萄糖)、1.50(7号峰，苯甲酸)、2.19(8号峰，苯甲酰芍药苷)。计算峰1、6与S峰的相对峰面积，其相对峰面积应在规定值范围内，规定值范围：不低于0.45(峰1)、不低于0.10(峰6)。所得结果如表9～12所示，不同特征峰的对照品定位见图39所示，其中S1：赤芍(川赤芍)配方颗粒；S2：没食子酸；S3：芍药内脂苷；S4：芍药苷；S5：1，2，3，4，6-五没食子酰葡萄糖；S6：苯甲酸；S7：苯甲酰芍药苷。
表9赤芍(川赤芍)配方颗粒共有模式相对保留时间
Figure BDA0002949197920000141
Figure BDA0002949197920000151
表11 15批赤芍(川赤芍)配方颗粒中间体及3批赤芍(川赤芍)配方颗粒特征指纹图谱测定结果
Figure BDA0002949197920000152
表12 15批赤芍(川赤芍)配方颗粒中间体及3批赤芍(川赤芍)配方颗粒特征指纹图谱测定结果
Figure BDA0002949197920000161
实施例3赤芍(川赤芍)配方颗粒特征图谱的方法学验证
3.1精密度
3.1.1精密度实验
取同一份供试品溶液(批号1906001Y)，按按实施例2中步骤四方法，重复进样6次，测定8个共有峰的相对保留时间，结果如表13～14所示，精密度实验的色谱图如图40所示，图40中S1：精密度1；S2：精密度2；S3：精密度3；S4：精密度4S5：精密度5S6：精密度6。由表14～15和图40可知，各特征峰与参照物S峰(3号峰)的相对保留时间的RSD分别为0.08％、0.01％、0％、0.04％、0.04％、0.07％、0.03％、0.02％，峰1和峰6的相对峰面积的RSD分别为0.13％、0.12％，这表明精密度较好。
表13精密度实验结果
Figure BDA0002949197920000171
表14精密度实验相对峰面积结果
Figure BDA0002949197920000172
3.1.2中间精密度(不同人员考察)
取同一批号供试品(批号1906001Y)6份，按按实施例2中步骤四方法分别测定8个共有峰的相对保留时间，结果如表15～16所示，中间精密度实验的色谱图如图41所示。由表6～17和图41可知，结果各特征峰与参照物S峰(3号峰)的相对保留时间的RSD分别为0.12％、0.01％、0％、0.05％、0.04％、0.07％、0.03％、0.05％，峰1和峰6的相对峰面积的RSD分别为1.02％、71.43％，表明本方法重复性较好。
表15中间精密度(不同人员考察)相对保留时间试验结果
Figure BDA0002949197920000173
Figure BDA0002949197920000181
表16重复性相对峰面积试验结果
Figure BDA0002949197920000182
3.1.3重复性实验
取同一批号供试品(批号1906001Y)6份，按实施例2中步骤四方法分别测定8个共有峰的相对保留时间，结果如表17～18所示，重复性实验的色谱图如图42所示。由表17～18和图42可知，结果各特征峰与参照物S峰(3号峰)的相对保留时间的RSD分别为0.09％、0.01％、0％、0.03％、0.04％、0.05％、0.03％、0.06％，峰1和峰6的相对峰面积的RSD分别为1.21％、65.30％，表明本方法重复性较好。
表17重复性实验结果(n＝6)
Figure BDA0002949197920000183
表18重复性实验的相对峰面积结果(n＝6)
Figure BDA0002949197920000184
Figure BDA0002949197920000191
3.2专属性实验
供试品采用提取溶剂为60％甲醇，精密吸取供试品溶液、阴性对照溶液(60％甲醇)各10μL，分别注入高效液相色谱仪，按实施例2中步骤四方法，结果如图43-44所示。由图43-44可知，空白溶剂在相应保留时间处无色谱峰，无干扰，符合要求。
3.3稳定性实验
取同一批号供试品(批号1903001Y)，按实施例2中步骤四方法操作，分别在0、4、8、12、24小时进样，测定8个共有峰的相对保留时间，结果如表19～20所示，稳定性实验的色谱图如图45所示，图45中S1：稳定性0h；S2：稳定性4h；S3：稳定性8h；S4：稳定性12h；S5：稳定性24h。由表19～20和图45所示，各特征峰与参照物S峰(3号峰)的相对保留时间的RSD分别为0.44％、0.03％、0％、0.13％、0.13％、0.13％、0.11％、0.15％，峰1和峰6的相对峰面积的RSD分别为1.07％、15.16％，这表明供试品溶液在24小时内稳定，符合测定要求。
表19稳定性实验结果
Figure BDA0002949197920000192
表20稳定性实验的相对峰面积结果
Figure BDA0002949197920000201
实施例4川赤芍基源与芍药基源药物的药物制剂的区别
根据实施例1-3建立的赤芍(川赤芍)配方颗粒指纹图谱检测方法，应用到芍药基源药物制剂及川赤芍基源药物制剂的鉴别上，其中芍药基源药物制剂包括白芍药物制剂(图46中S1)和赤芍(芍药)药物制剂(图46中S2)，白芍和赤芍(芍药)基源一致，只是加工方法有区别。白芍药物制剂的制备方法为将实施例1中的川赤芍替换为白芍；赤芍(芍药)药物制剂的制备方法为将实施例1中川赤芍替换为赤芍(芍药)。并与赤芍(川赤芍)对照药材(图46中S3)、赤芍(川赤芍)饮片(图46中S4)、赤芍(川赤芍)配方颗粒中间体(图46中S5)进行检测比较。结果如表21～22所示，不同基源区别图谱如图46所示。由表21～22和图46所示，基源为芍药的白芍和赤芍，色谱图中缺失峰6，且峰6为已知成分(1，2，3，4，6-五没食子酰葡萄糖)。基源为川赤芍的赤芍，峰1(没食子酸)的含量较高，其峰面积与参照峰(芍药苷，峰3)的比值大于0.45，赤芍(芍药)、白芍中的峰1(没食子酸)峰面积与参照峰(芍药苷，峰3)的比值小于0.45。
综合结果及实施例2的多批赤芍(川赤芍)配方颗粒中间体及其配方颗粒的结果，可知峰6为赤芍(川赤芍)与芍药基源区别的特有成分，且峰1相对峰3的峰面积占比，也是可显著的区别不同基源的赤芍。可见，建立的赤芍(川赤芍)配方颗粒指纹图谱检测方法适用于多基源赤芍的区别。此外，根据项目组前期研究成果，赤芍(芍药)从饮片到成品颗粒的特征图谱色谱峰传递性良好。同理可见该方法适用于多基源赤芍药物制剂的区别。
表21多基源赤芍特征图谱相对保留时间结果
Figure BDA0002949197920000202
Figure BDA0002949197920000211
表22多基源赤芍特征图谱相对峰面积结果
Figure BDA0002949197920000212
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种建立区别川赤芍与芍药基源药物的药物制剂指纹图谱的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)取川赤芍药物制剂或芍药基源药物的药物制剂制备为供试溶液；
2)取供试溶液进行高效液相色谱检测，得供试品溶液的液相色谱图；
色谱条件包括：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A、以0.05％的磷酸溶液为流动相B按照如下程序进行梯度洗脱：
0-12min，A与B的体积比由5％：95％变为8％：92％；
12-18min，A：B的体积比由8％：92％变为15％：85％；
18-35min，A：B的体积比由15％：85％变为18％：82％；
35-40min，A：B的体积比由18％：82％变为19％：81％；
40-50min，A：B的体积比由19％：81％变为20％：80％；
50-55min，A：B的体积比由20％：80％变为40％：60％；
55-60min，A：B的体积比由40％：60％变为5％：95％；
60-65min，A：B的体积比为5％：95％；
上述百分数为体积百分数。
2.根据权利要求1所述川赤芍与芍药基源药物的药物制剂指纹图谱的方法，其特征在于，
步骤3)中，所用色谱柱为Kromasil C18，规格为：5μm，4.6mm×250mm；前13分钟检测波长为230nm，13分钟后检测波长为225nm。
3.根据权利要求1或2所述的川赤芍与芍药基源药物的药物制剂指纹图谱的方法，其特征在于，供试溶液的制备方法：包括采用有机溶剂对川赤芍药物制剂或芍药基源药物的药物制剂进行提取、过滤，取滤液的步骤；川赤芍药物制剂或芍药基源药物的药物制剂与有机溶剂比为(0.05-0.5)∶(15-50)；比例关系为g/mL；
可选的，川赤芍药物制剂或芍药基源药物的药物制剂与有机溶剂比为0.1∶25，比例关系为g/mL；
可选的，采用的有机溶剂为体积分数为30％-70％的甲醇水溶液；更可选的，有机溶剂为体积分数为60％的甲醇水溶液；
可选的，提取的方式为振摇提取或超声提取；更可选的，提取的方式为超声提取；
提取时间为30min-60min；更可选的，提取时间为30min。
4.根据权利要求1-3任一所述川赤芍与芍药基源药物的药物制剂指纹图谱的方法，其特征在于，所述方法还包括对照品溶液的制备和将步骤2)中的供试溶液替换为对照品溶液进行实验，获得对照品溶液的液相色谱图；
对照品溶液的制备方法包括如下步骤：称取没食子酸，加体积百分数为30％～70％甲醇水溶液，摇匀，作为对照品A溶液，每1体积份对照品A溶液中含0.00002重量份没食子酸；
称取芍药内脂苷，加体积百分数为30％～70％甲醇水溶液，摇匀，作为对照品B溶液；每1体积份对照品B溶液中含0.00002重量份的芍药内脂苷；
称取芍药苷，加体积百分数为30％～70％甲醇水溶液，摇匀，作为对照品C溶液；每1体积份照品C溶液中含0.00002重量份芍药苷；
称取1，2，3，4，6-五没食子酰葡萄糖，加体积百分数为30％～70％甲醇水溶液，摇匀，作为对照品D溶液；每1体积份对照品D溶液中含0.00002重量份1，2，3，4，6-五没食子酰葡萄糖；
称取苯甲酸，加体积百分数为30％～70％甲醇水溶液，摇匀，作为对照品E溶液；每1体积份对照品E溶液中含0.00002重量份苯甲酸；
称取苯甲酰芍药苷，加体积百分数为30％～70％甲醇水溶液，摇匀，作为对照品F溶液；每1体积份对照品F溶液中含0.00002重量份的苯甲酰芍药苷；
重量份与体积份的比例关系为g/mL。
5.根据权利要求1-4任一所述川赤芍与芍药基源药物的药物制剂指纹图谱的方法，其特征在于，所述药物制剂为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、蜜炼丸剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口服液体制剂或注射制剂。
6.根据权利要求1-5任一项所述川赤芍与芍药基源药物的药物制剂指纹图谱的方法，其特征在于，所述川赤芍或芍药基源药物的药物制剂的制备方法包括如下步骤：
取川赤芍或芍药基源药物，加热回流提取至少1次，每次加入至少7重量倍量的水提取至少25min，过滤，合并滤液，滤液浓缩至60℃时相对密度为1.04～1.12g/mL，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床上可接受的片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、蜜炼丸剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口服液体制剂或注射制剂；
可选的，取赤芍，加热回流提取2次，每次加入7～12重量倍量的水提取25min～1h，过滤，合并滤液，滤液浓缩至60℃相对密度为1.04～1.12，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床上可接受的片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、蜜炼丸剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口服液体制剂或注射制剂；
可选的，所述川赤芍药物制剂或芍药基源药物的药物制剂制备方法包括如下步骤：
1)取川赤芍药物或芍药基源药物，加热回流提取2次；第1次加入9重量倍量的水提取30分钟，第2次加入7重量倍量的水提取25分钟，得到提取液；
2)将提取液过滤，合并滤液，滤液浓缩至60℃相对密度为1.04～1.12，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床上可接受的片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、蜜炼丸剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口服液体制剂或注射制剂。
7.权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于，所述芍药基源药物为白芍或芍药基源的赤芍。
8.根据权利要求1-7任一项所述建立区别川赤芍与芍药基源药物的药物制剂指纹图谱的方法，其特征在于，所述川赤芍药物制剂的指纹图谱包含8个共有特征峰，依次为1-8号峰，1号峰为没食子酸、2号峰为芍药内脂苷、3号峰为芍药苷、6号峰为1，2，3，4，6-五没食子酰葡萄糖、7号峰为苯甲酸、8号峰为苯甲酰芍药苷，以3号峰为内参考峰，各峰号的相对保留时间依次为：0.22-0.25，0.87-0.96，0.95-1.05，1.05-1.16，1.28-1.41，1.37-1.52，1.43-1.58，2.08-2.30；峰1的相对峰面积不低于0.45，峰6的相对峰面积不低于0.10；
可选的，各峰号的相对保留时间依次为：0.24、0.92、1.00、1.11、1.34、1.44、1.50、2.19；
所述芍药基源药物的药物制剂的指纹图谱与川赤芍药物制剂的指纹图谱相比，缺失峰6，且峰1峰面积与内参考峰的比值小于0.45。
9.权利要求1-8任一项所述的方法在如下任一种中的应用：
(I)赤芍的药物制剂的质量检测和/或质量控制；
(II)区别川赤芍药物制剂或芍药基源药物的药物制剂。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述芍药基源药物为白芍或芍药基源的赤芍。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011174899A (ja) * 2010-02-26 2011-09-08 Naraken Chusho Kigyo Sien Center 芍薬の品質鑑定方法
CN107843677A (zh) * 2017-12-06 2018-03-27 广州卡马生物科技有限公司 赤芍对照提取物及其制备方法和应用
CN108061768A (zh) * 2017-12-14 2018-05-22 广东方制药有限公司 一种白芍hplc特征图谱的构建及其检测方法
CN109490437A (zh) * 2018-11-12 2019-03-19 南京海昌中药集团有限公司 白芍的指纹图谱检测方法
CN109632991A (zh) * 2018-12-21 2019-04-16 广东方制药有限公司 一种利用hplc特征图谱检测鉴别白芍与酒白芍的方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011174899A (ja) * 2010-02-26 2011-09-08 Naraken Chusho Kigyo Sien Center 芍薬の品質鑑定方法
CN107843677A (zh) * 2017-12-06 2018-03-27 广州卡马生物科技有限公司 赤芍对照提取物及其制备方法和应用
CN108061768A (zh) * 2017-12-14 2018-05-22 广东方制药有限公司 一种白芍hplc特征图谱的构建及其检测方法
CN109490437A (zh) * 2018-11-12 2019-03-19 南京海昌中药集团有限公司 白芍的指纹图谱检测方法
CN109632991A (zh) * 2018-12-21 2019-04-16 广东方制药有限公司 一种利用hplc特征图谱检测鉴别白芍与酒白芍的方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SHUNJUN XU等: "Species differentiation and quality assessment of Radix Paeoniae Rubra (Chi-shao) by means of high-performance liquid chromatographic fingerprint", 《JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A》 *
向楚兵等: "赤芍二基源药材的HPLC指纹图谱鉴别及质量评价", 《中国实验方剂学杂志》 *
谭沛等: "基于多基原及系统聚类分析研究赤芍标准汤剂的指纹图谱", 《中国医院药学杂志》 *
赵园园等: "基于HPLC指纹图谱的亳白芍不同炮制品标准汤剂7个成分含量测定", 《天然产物研究与开发》 *
陆顺瑶等: "应用赤芍对照提取物对赤芍样品的指纹图谱分析", 《中药新药与临床药理》 *

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