CN105784911B - 伊血安颗粒hplc指纹图谱的建立方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种伊血安颗粒HPLC指纹图谱的建立方法，以原儿茶酸为参照物，采用高效液相色谱进行梯度洗脱获得了壮药滇桂艾纳香药材共有模式的指纹图谱。指纹图谱共有色谱峰21个，它能充分反应伊血安颗粒的化学成分，信息量丰富，方法精密度、重现性和稳定性好，对伊血安颗粒的质量控制和临床疗效具有重要意义。

Description

伊血安颗粒HPLC指纹图谱的建立方法

技术领域

本发明涉及药物检测领域，特别是一种伊血安颗粒HPLC指纹图谱的建立方法。

背景技术

伊血安颗粒是一种治疗妇科血症的中成药，主要成份为益母草、益母草、延胡索、甘草等，具有活血止血、行气止痛等功效。临床上用于产后恶露不绝，人工流产后子宫出血不净，中医辩证属血瘀证者。

随着近年来新技术、新方法的运用，中药复方研究出现了许多新思路，用指纹图谱研究中药复方就为其中之一，指纹图谱对中药复方进行质量控制研究、提供质量控制标准具有重要意义。但目前对伊血安颗粒的指纹图谱建立方法研究还比较少。

授权公告号为CN104458993B的发明专利，公开了一种壮药材滇桂艾纳香HPLC指纹图谱的建立方法，以滇桂艾纳香中的主要成分原儿茶酸和原儿茶醛为参照物，采用高效液相色谱仪检测获得了壮药滇桂艾纳香药材共有模式的指纹图谱，指纹图谱共有色谱峰13个，该方法能快速、准确地鉴别滇桂艾纳香的真伪优劣，为控制药材质量和鉴别药材优劣提供了有力的理论依据。但上述发明仅是针对伊血安颗粒的其中一种原料药建立了指纹图谱，伊血安颗粒包含多种原料药，为提高伊血安颗粒中药复方的质量控制水平，极有必要建议一种伊血安颗粒的指纹图谱。

发明内容

本发明提供了一种伊血安颗粒HPLC指纹图谱的建立方法，显示了伊血安颗粒中各成分的组分与比例，为伊血安颗粒的质量控制提供了重要参考。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种伊血安颗粒HPLC指纹图谱的建立方法，包括以下步骤：

(1)对照品溶液的准备：原儿茶酸标准品，加入甲醇定容，制得参照物溶液。

(2)供试品溶液的准备：取伊血安颗粒，加水溶解，加稀盐酸调节pH，搅匀，静置，滤过，加水饱和正丁醇萃取3～6次，分取出正丁醇提取液，合并正丁醇提取液，静置，分取获得正丁醇液，回收正丁醇，残渣加甲醇溶解，离心，取上清液，得供试品溶液。

(3)高效液相色谱仪的色谱条件：

流动相：甲醇-0.1％冰乙酸；

梯度洗脱程序：时间梯度

0min→11min→16min→29min→30min→35min→45min→55min→70min→95min；对应的梯度洗脱液按以下体积比由流动相A甲醇和流动相B0.1％冰乙酸组成，流动相A的体积百分数梯度5％→16％→17％→30％→34％→34％→35％→45％→45％→70％，流动相B的体积百分数梯度95％→84％→83％→70％→66％→66％→65％→55％→55％→30％；

紫外检测波长：256nm；

流速：1.0mL·min^-1；

柱温：25℃。

(4)测定：吸取供试品溶液注入高效液相色谱仪，按照步骤(3)的色谱条件测定，得到指纹图谱。

优选的，所述步骤(2)的具体操作方法为：称取伊血安颗粒3～8g，加水50mL溶解，加稀盐酸0.2～0.4mL，搅匀，静置15～30min，滤过，加水饱和正丁醇萃取5～6次，每次15～20mL，分取正丁醇提取液，合并，静置1～1.5h，分取获得正丁醇液，回收正丁醇，残渣加甲醇4～6mL，离心，取上清液，得供试品溶液。更优选的，称取伊血安颗粒5g，加水50mL溶解，加稀盐酸0.3mL，搅匀，静置20min，滤过，加水饱和正丁醇萃取5次，每次15mL，分取正丁醇提取液，合并，静置1h，分取获得正丁醇液，回收正丁醇，残渣加甲醇5mL，离心，取上清液，得供试品溶液。

进一步的，所述指纹图谱共有色谱峰21个，其平均保留时间分别为：1号峰3.234min、2号峰5.962min、3号峰11.023min、4号峰15.353min、5号峰16.521min、6号峰24.498min、7号峰27.158min、8号峰30.877min、9号峰32.29min、10号峰34.752min、11号峰36.182min、12号峰37.968min、13号峰38.708min、14号峰56.509min、15号峰58.989min、16号峰59.670min、17号峰66.895min、18号峰68.358min、19号峰69.319min、20号峰85.217min、21号峰91.016min。更进一步的，所述伊血安颗粒的组分包括滇桂艾纳香、益母草、延胡索和甘草，其中1号峰～21号峰来源于滇桂艾纳香，9号峰来源于益母草，10、11号峰来源于延胡索，6、14、15、16号峰来源于甘草。

优选的，所述步骤(3)中，色谱柱为Phenomenex Gemini C18柱(4.6mm×250mm，5μm)。

优选的，所述步骤(3)中，保护柱为Phenomenex C18(4×3.0mm)。

优选的，所述步骤(3)中，理论塔板数以原儿茶酸峰计，不低于5000。

优选的，所述对照品溶液是浓度为0.081mg·mL^-1的原儿茶酸标准品溶液。

本发明中稀盐酸是质量分数为9.5％～10.5％的盐酸。

以上所述的技术方案，以原儿茶酸为参照物，通过高效液相色谱仪，采用甲醇-0.1％冰乙酸为流动相进行梯度洗脱，获得了指纹图谱，指纹图谱中共有色谱峰21个，其中21个共有峰来源于滇桂艾纳香，1个共有峰来源于益母草，2个共有峰来源于延胡索，4个共有峰来源于甘草，能充分反应伊血安颗粒中四种原料药的化学成分，可用于整体评价四种原料药的质量和鉴别四种原料药的优劣，为控制伊血安颗粒的质量提供了有力的理论依据。本方法样品前处理快捷简便，色谱分析时间短，精密度、重现性和稳定性好，对伊血安颗粒的质量控制和临床疗效具有重要意义。

附图说明

图1是实施例1中采用Welchrom C18柱(4.6mm×250mm，5μm)得到的色谱图；

图2是实施例1中采用Hypersil C18柱(4.6mm×250mm，5μm)得到的色谱图；

图3是实施例1中采用Phenomenex Gemini C18柱(4.6mm×250mm，5μm)得到的色谱图；

图4是实施例1中采用甲醇-水为流动相得到的色谱图；

图5是实施例1中采用乙腈-水为流动相得到的色谱图；

图6是实施例1中采用甲醇-0.1％磷酸为流动相得到的色谱图；

图7是实施例1中采用甲醇-0.05％冰乙酸为流动相得到的色谱图；

图8是实施例1中采用甲醇-0.1％冰乙酸为流动相得到的色谱图；

图9是实施例1中采用乙腈-0.1％冰乙酸为流动相得到的色谱图；

图10是实施例1中波长为230nm得到的色谱图；

图11是实施例1中波长为256nm得到的色谱图；

图12是实施例1中波长为280nm(0～20min)-279nm(20～30min)得到的色谱图；

图13是实施例1中波长为320nm得到的色谱图；

图14是实施例1中波长为360nm得到的色谱图；

图15是实施例1中柱温为20℃得到的色谱图；

图16是实施例1中柱温为25℃得到的色谱图；

图17是实施例1中柱温为30℃得到的色谱图；

图18是实施例1中柱温为35℃得到的色谱图；

图19是实施例1中流速为0.8mL·min^-1得到的色谱图；

图20是实施例1中流速为1.0mL·min^-1得到的色谱图；

图21是实施例1中流速为1.2mL·min^-1得到的色谱图；

图22是实施例2中以水为提取溶剂提取后检测得到的色谱图；

图23是实施例2中以甲醇为提取溶剂提取后检测得到的色谱图；

图24是实施例2中以乙醇为提取溶剂提取后检测得到的色谱图；

图25是实施例2中以水饱和正丁醇为萃取溶剂提取后检测得到的色谱图；

图26是实施例2中以氯仿为萃取溶剂提取后检测得到的色谱图；

图27是实施例2中以乙醚为萃取溶剂提取后检测得到的色谱图；

图28是实施例2中以乙酸乙酯为萃取溶剂提取后检测得到的色谱图；

图29是实施例3中伊血安颗粒的指纹图谱；

图30是实施例3中参照物的色谱图；

图31是实施例3中滇桂艾纳香药材色谱图；

图32是实施例3中益母草药材色谱图；

图33是实施例3中延胡索药材色谱图；

图34是实施例3中甘草药材色谱图；

图35是实施例5中10个批号的伊血安颗粒的匹配图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围不限于以下实施例：

以下实施例的实验材料、仪器和试剂准备如下：

实验材料：原儿茶酸标准品(中国药品生物制品检定所，供含量测定用，批号：110809-200503)。

仪器：安捷伦Agilent1260高效液相色谱仪，含在线真空脱气机器(G-1311C)、四元梯度泵(G-1311C)、标准自动进样器(G-1329B)、智能化柱温箱(G-1316A)、可变波长检测器(G-1314B)、Agilent1260Infinity色谱工作站(美国安捷伦科技有限公司)；SB3200T超声波清洗仪(上海必能信超声有限公司)；Millipore Simplicity-185超纯水仪(美国密里博公司)；LG16-W高速微量离心机(北京医用离心机厂)；BT224S电子分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)。

试剂：甲醇、乙腈(色谱纯，美国Fisher Scientific公司)；冰乙酸(HPLC，天津市科密欧化学试剂有限公司)；水为超纯水；其它试剂均为分析纯。

实施例1色谱条件的优化

供试品溶液的准备方法：称取伊血安颗粒5g，加水50mL溶解，加稀盐酸0.3mL，搅匀，静置20min，滤过，加水饱和正丁醇萃取5次，每次15mL，分取正丁醇提取液，合并，静置1h，分取获得正丁醇液，回收正丁醇，残渣加甲醇5mL，离心，取上清液，得供试品溶液。

1-1色谱柱的选择

高效液相色谱仪的其他测定条件相同，考察了Welchrom C18柱(4.6mm×250mm，5μm)、Hypersil C18柱(4.6mm×250mm，5μm)和Phenomenex Gemini C18柱(4.6mm×250mm，5μm)三种色谱柱，所得到的色谱图分为如图1、图2、图3所示，由图3可以看出，PhenomenexGemini C18柱(4.6mm×250mm，5μm)分离度最好，峰形对称和尖锐，基线较平稳。

1-2流动相的选择

高效液相色谱仪的其他测定条件相同，考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1％磷酸、甲醇-0.05％冰乙酸、甲醇-0.1％冰乙酸、乙腈-0.1％冰乙酸为流动相进行梯度洗脱，所得到的色谱图分别如图4、图5、图6、图7、图8、图9所示，经比较可以看出，以甲醇-0.1％冰乙酸系统为流动相的色谱图吸收峰分离较好，基线较平稳。

1-3检测波长的选择

高效液相色谱仪的其他测定条件相同，考察了230nm、256nm、280nm、320nm、360nm吸收波长下的色谱图，色谱图分别如图10、图11、图12、图13和图14所示，经比较可以看出，在256nm处色谱图显示有较多的峰信息，且信号较好，所得色谱图中各峰形较好、基线平稳。

1-4柱温的选择

高效液相色谱仪的其他测定条件相同，考察了20℃、25℃、30℃、35℃不同的柱温，色谱图分别如图15、图16、图17和图18所示，经比较可以看出，25℃时各峰分离效果最好。

1-5流速的选择

高效液相色谱仪的其他测定条件相同，考察了0.8mL·min^-1、1.0mL·min^-1、1.2mL·min^-1不同流速，色谱图分别如图19、图20和图21所示，经比较可以看出，流速为1.0mL·min^-1时各峰分离效果最好。

实施例2样品前处理方法的优化

高效液相色谱仪的色谱条件：色谱柱采用Phenomenex Gemini C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；保护柱采用Phenomenex C18(4×3.0mm)；流动相：甲醇-0.1％冰乙酸；梯度洗脱程序：时间梯度

0min→11min→16min→29min→30min→35min→45min→55min→70min→95min；对应的梯度洗脱液按以下体积比由流动相A甲醇和流动相B0.1％冰乙酸组成，流动相A的体积百分数梯度5％→16％→17％→30％→34％→34％→35％→45％→45％→70％，流动相B的体积百分数梯度95％→84％→83％→70％→66％→66％→65％→55％→55％→30％；；检测波长：256nm；流速：1.0mL·min-1；柱温：25℃；进样量：5μL。

2-1提取溶剂的选择

称取伊血安颗粒5g，选用水、甲醇和乙醇三种提取溶剂，采用相同的提取方法对伊血安颗粒进行提取，提取完成经同样的萃取、浓缩、溶解处理后，通过高效液相色谱仪进行检测，所得到的色谱图分别如图22、图23、图24所示，经比较可以看出，以水为提取溶剂时，显示有较多的峰信息，样品的有效物质完全溶解，峰分离度好。

2-2萃取溶剂的选择

称取伊血安颗粒5g，以水为提取溶剂获得提取液后，选用水饱和正丁醇、氯仿、乙醚、乙酸乙酯为萃取溶剂进行萃取，萃取方法相同，萃取完成经同样的浓缩、溶解处理后，通过高效液相色谱仪进行检测，所得到的色谱图分别如图25、图26、图27和图28所示，经比较可以看出，氯仿萃取的样品，峰信息很少，乙醚萃取的样品，峰信息较少且峰面积较小，乙酸乙酯与水饱和正丁醇萃取所得图谱较为相似，但峰面积较小，且乙酸乙酯萃取时较易乳化，故水饱和正丁醇萃取效果最佳。

2-3萃取次数的选择

称取伊血安颗粒5g，以水为提取溶剂，以水饱和正丁醇为萃取溶剂萃取，分别考察了萃取3次、4次、5次、6次，其他萃取方法相同，萃取完成经同样的浓缩、溶解处理后，通过高效液相色谱仪进行检测，实验表明萃取5次与萃取6次的原儿茶酸在峰面积上无较大差异；由此表明，萃取5次已基本可以把伊血安颗粒水溶性成分完全萃取，故萃取以5次为宜。

2-4萃取量的选择

称取伊血安颗粒5g，以水为提取溶剂，以水饱和正丁醇为萃取溶剂萃取5次，其他萃取方法相同，考察萃取量分别为10mL、15mL、20mL的萃取效果，萃取完成经同样的浓缩、溶解处理后，通过高效液相色谱仪进行检测，实验表明萃取量为15mL与萃取量为20mL的原儿茶酸在峰面积上无较大差异。由此表明，萃取量为15mL已基本可以把伊血安颗粒水溶性成分完全萃取。

实施例3伊血安颗粒HPLC指纹图谱的建立

3-1参照物溶液的准备：称取原儿茶酸标准品0.81mg置10mL容量瓶中，加甲醇适量使溶解并定容至刻度，摇匀，即得浓度为0.081mg·mL-1的原儿茶酸标准品溶液

3-2供试品溶液的准备：称取伊血安颗粒5g，加水50mL溶解，加稀盐酸0.3mL，搅匀，静置20min，滤过，加水饱和正丁醇萃取5次，每次15mL，分取正丁醇提取液，合并，静置1h，分取获得正丁醇液，回收正丁醇，残渣加甲醇5mL，离心，取上清液，得供试品溶液。

3-3高效液相色谱仪的色谱条件：

色谱柱：Phenomenex Gemini C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；

保护柱：Phenomenex C18(4×3.0mm)；

流动相：甲醇-0.1％冰乙酸；

梯度洗脱程序：时间梯度

0min→11min→16min→29min→30min→35min→45min→55min→70min→95min；对应的梯度洗脱液按以下体积比由流动相A甲醇和流动相B0.1％冰乙酸组成，流动相A的体积百分数梯度5％→16％→17％→30％→34％→34％→35％→45％→45％→70％，流动相B的体积百分数梯度95％→84％→83％→70％→66％→66％→65％→55％→55％→30％；

紫外检测波长：256nm；

流速：1.0mL·min^-1；

柱温：25℃。

3-4供试品溶液的测定：吸取供试品溶液注入高效液相色谱仪，按照步骤3-3的色谱条件测定，得到指纹图谱，如图29所示。借助《中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版》软件，对指纹图谱的相关参数进行自动匹配，标定伊血安颗粒的21个指纹共有峰，其平均保留时间分别为：1号峰3.234min、2号峰5.962min、3号峰11.023min、4号峰15.353min、5号峰16.521min、6号峰24.498min、7号峰27.158min、8号峰30.877min、9号峰32.29min、10号峰34.752min、11号峰36.182min、12号峰37.968min、13号峰38.708min、14号峰56.509min、15号峰58.989min、16号峰59.670min、17号峰66.895min、18号峰68.358min、19号峰69.319min、20号峰85.217min、21号峰91.016min。

3-5参照物溶液的测定；精密吸取5μL参照物溶液注入高效液相色谱仪，按照步骤3-3的色谱条件测定，得参照物的图谱，如图30所示，原儿茶酸色谱峰与供试品指纹图谱中5号峰的保留时间一致，作为参照峰。

3-6指纹共有峰的标定

分别按3-2制作滇桂艾纳香、益母草、延胡索和甘草药材的供试品溶液，按3-3色谱条件进样分析，根据各色谱峰保留时间和紫外吸收光谱特征对共有峰进行认定，结合图31所示，1号峰～21号峰来源于滇桂艾纳香，结合图32所示，9号峰来源于益母草，结合图33所示，10、11号峰来源于延胡索，结合图34所示，6、14、15、16号峰来源于甘草。

实施例4本发明方法的方法学考察

4-1参照物溶液的准备：称取原儿茶酸标准品0.81mg置10mL容量瓶中，加甲醇适量使溶解并定容至刻度，摇匀，即得浓度为0.081mg·mL-1的原儿茶酸标准品溶液

4-2供试品溶液的准备：称取伊血安颗粒5g，加水50mL溶解，加稀盐酸0.3mL，搅匀，静置20min，滤过，加水饱和正丁醇萃取5次，每次15mL，分取正丁醇提取液，合并，静置1h，分取获得正丁醇液，回收正丁醇，残渣加甲醇5mL，离心，取上清液，得供试品溶液。

4-3高效液相色谱仪的色谱条件：

色谱柱：Phenomenex Gemini C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；

保护柱：Phenomenex C18(4×3.0mm)；

流动相：甲醇-0.1％冰乙酸；

梯度洗脱程序：时间梯度

0min→11min→16min→29min→30min→35min→45min→55min→70min→95min；对应的梯度洗脱液按以下体积比由流动相A甲醇和流动相B0.1％冰乙酸组成，流动相A的体积百分数梯度5％→16％→17％→30％→34％→34％→35％→45％→45％→70％，流动相B的体积百分数梯度95％→84％→83％→70％→66％→66％→65％→55％→55％→30％；

紫外检测波长：256nm；

流速：1.0mL·min^-1；

柱温：25℃。

4-4精密度实验

取伊血安颗粒(批号120303)，按4-2的供试品溶液的准备制备同一供试品溶液，按4-3的色谱条件测定，连续进样6次，记录色谱图，考察仪器的精密度。结果见表1、表2，结果表明各色谱峰的相对保留时间RSD值在0.02％～1.13％之间，各色谱峰相对峰面积RSD值在1.02％～2.92％之间，表明仪器的精密度良好。

表1伊血安颗粒指纹图谱精密度实验-相对保留时间

表2伊血安颗粒指纹图谱精密度实验-相对峰面积

4-5重复性实验

取6份伊血安颗粒(批号120303)，按4-2的供试品溶液的准备制备同一供试品溶液，按4-3的色谱条件测定，记录色谱图，考察试验方法的重复性。结果见表3、表4，6份样品中各色谱峰的相对保留时间RSD值在1.03％～1.64％之间，各色谱峰相对峰面积RSD值在1.04％～3.09％之间，表明实验方法的重复性良好。

表3伊血安颗粒指纹图谱重复性实验-相对保留时间

表4伊血安颗粒指纹图谱重复性实验-相对峰面积

4-6稳定性实验

取伊血安颗粒(批号120303)，按4-2的供试品溶液的准备制备同一供试品溶液，按4-3的色谱条件测定，分别在0、2、4、8、16、24h进行检测，考察供试品溶液的稳定性。结果见表5、表6，各色谱峰的相对保留时间RSD值在0.07％～1.76％之间，各色谱峰的相对峰面积RSD值在1.45％～3.11％之间，表明供试品溶液24h内稳定性良好。

表5伊血安颗粒指纹图谱稳定性实验-相对保留时间

表6伊血安颗粒指纹图谱稳定性实验-相对峰面积

实施例5 10批次伊血安颗粒指纹图谱的采集

取10个批号的伊血安颗粒，按实施例4中4-2的供试品溶液的准备制备同一供试品溶液，按4-3的色谱条件测定，记录10个批号伊血安颗粒HPLC色谱图，以《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》规定，建立伊血安颗粒指纹图谱，10个批号的伊血安颗粒的匹配图见图31。

相似度评价：采用中国药典委员会推荐的中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件2004A版，对HPLC图谱进行综合评价，相似度评价结果见表7。

表7伊血安颗粒HPLC指纹图谱相似度计算结果

按实施例3中3-5的方法确定参照峰(S)，以参照峰的保留时间和峰面积作为1，分别计算指纹共有峰的相对保留时间和相对峰面积见表8、表9。

表8 10个批号伊血安颗粒色谱图共有峰相对保留时间

表9 10个批号伊血安颗粒色谱图共有峰相对峰面积

实验数据显示，供试品共有峰相对峰面积RSD％值普遍偏高，且10批伊血安颗粒HPLC指纹图谱的相似度都只大于0.82，未达到《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》规定中大于0.9的要求。可能是原料药材受到了地域、气候、环境、采收时间、储藏等的影响或是产品制剂工艺不稳定等原因造成各组分含量比例差异。应进一步研究其影响因素，规范化种植，保持药材质量稳定，加强生产工艺中产品质量控制，才能有效地保证制剂的质量稳定。

Claims (5)

1.一种伊血安颗粒HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）对照品溶液的准备：原儿茶酸标准品，加入甲醇定容，制得参照物溶液；

（2）供试品溶液的准备：取伊血安颗粒，加水溶解，加稀盐酸调节pH，搅匀，静置，滤过，加水饱和正丁醇萃取3~6次，分取出正丁醇提取液，合并正丁醇提取液，静置，分取获得正丁醇液，回收正丁醇，残渣加甲醇溶解，离心，取上清液，得供试品溶液；

（3）高效液相色谱仪的色谱条件：

色谱柱：Phenomenex Gemini C18柱，4.6mm×250mm，5μm；

保护柱：Phenomenex C18，4×3.0mm；

流动相：甲醇-0.1%冰乙酸；

梯度洗脱程序：时间梯度0min→11min→16min→29min→30min→35min→45min→55min→70min→95min；对应的梯度洗脱液按以下体积比由流动相A甲醇和流动相B0.1％冰乙酸组成，流动相A的体积百分数梯度5％→16％→17％→30％→34％→34％→35％→45％→45％→70％，流动相B的体积百分数梯度95％→84％→83％→70％→66％→66％→65％→55％→55％→30％；

紫外检测波长：256nm；

流速：1.0mL·min^-1；

柱温：25℃；

（4）测定：吸取供试品溶液注入高效液相色谱仪，按照步骤（3）的色谱条件测定，得到指纹图谱；

所述指纹图谱共有色谱峰21个，其平均保留时间分别为：

1号峰3.234min、2号峰5.962min、3号峰11.023min、4号峰15.353min、5号峰16.521min、6号峰24.498min、7号峰27.158min、8号峰30.877min、9号峰32.29min、10号峰34.752min、11号峰36.182min、12号峰37.968min、13号峰38.708min、14号峰56.509min、15号峰58.989min、16号峰59.670min、17号峰66.895min、18号峰68.358min、19号峰69.319min、20号峰85.217min、21号峰91.016min；

所述伊血安颗粒的组分包括滇桂艾纳香、益母草、延胡索和甘草，其中1号峰~21号峰来源于滇桂艾纳香，9号峰来源于益母草，10、11号峰来源于延胡索，6、14、15、16号峰来源于甘草。

2.根据权利要求1所述的伊血安颗粒HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于：

所述步骤（2）的具体操作方法为：称取伊血安颗粒3~8g，加水50mL溶解，加稀盐酸0.2~0.4mL，搅匀，静置15~30min，滤过，加水饱和正丁醇萃取5~6次，每次15~20mL，分取正丁醇提取液，合并，静置1~1.5h，分取获得正丁醇液，回收正丁醇，残渣加甲醇4~6mL，离心，取上清液，得供试品溶液。

3.根据权利要求1所述的伊血安颗粒HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于：

所述步骤（3）中，理论塔板数以原儿茶酸峰计，不低于5000。

4.根据权利要求2所述的伊血安颗粒HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于：

称取伊血安颗粒5g，加水50mL溶解，加稀盐酸0.3mL，搅匀，静置20min，滤过，加水饱和正丁醇萃取5次，每次15mL，分取正丁醇提取液，合并，静置1h，分取获得正丁醇液，回收正丁醇，残渣加甲醇5mL，离心，取上清液，得供试品溶液。

5.根据权利要求1所述的伊血安颗粒HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于：

所述对照品溶液是浓度为0.081mg·mL^-1的原儿茶酸标准品溶液。