CN110530995B - 一种用于失眠的药物组合物的质量检测方法 - Google Patents

一种用于失眠的药物组合物的质量检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于失眠的药物组合物的质量检测方法，该检测方法包括对组合物进行指纹图谱检测，所述指纹图谱检测包括色谱条件、供试品溶液制备、对照品溶液制备、混合对照品溶液制备、阴性对照溶液制备、单味药材供试品溶液制备。本发明首次对舒眠胶囊建立了指纹图谱为主的质量检测方法，加强了专属性鉴别和多成分、整体质量检测方法，克服了现有技术中的质量检测方法难以反应产品质量的技术问题。

Description

一种用于失眠的药物组合物的质量检测方法
技术领域
本发明涉及药学领域，具体涉及一种用于失眠的药物组合物的质量检测方法。
背景技术
舒眠胶囊是由酸枣仁(炒)650g、柴胡(酒炒)380g、白芍(炒)380g、僵蚕(炒)300g、合欢花480g、合欢皮480g、蝉蜕300g、灯心草30g组成，其制备方法为：以上八味，加水煎煮二次，第一次1小时，第二次0.5小时，合并煎液，静置8小时，滤过，波液浓缩至50℃时相对密度为1.07，真空或喷雾干燥，干粉喷乙醇转动制粒，烘干，粉碎过60目筛，加入适量硬脂酸镁及微粉硅胶，并加淀粉调整总量为400g，装胶囊，制成1000粒，即得。功能与主治：用于疏肝解郁，宁心安神，用于肝郁伤神所致的失眠症。症见：失眠多梦，精神抑郁或急躁易怒，胸胁苦满或胸膈不畅，口苦目眩，舌边尖略红，苔白或微黄，脉弦。
舒眠胶囊中有效成分主要有芍药内酯苷对照品、芍药苷对照品、槲皮苷对照品、斯皮诺素对照品、槲皮素，现有技术中国家药品监督管理局国家药品标准[WS3-733]-舒眠胶囊质量标准中主要对酸枣仁(炒)、柴胡、合欢花进行定性鉴别，对白芍进行定量检测，由于单纯的指标成分的定性鉴别和定量分析，未对全成分进行检测，因此难以反映产品质量的优劣；为了更好的进行全成分质量检测，进一步摸索良好的检测方法，加强专属性鉴别和多成分、整体质量检测方法，本发明首次对舒眠胶囊建立了指纹图谱检测方法。
发明内容
针对现有技术的问题，本发明的目的是提供一种用于失眠的药物组合物的质量检测方法。
本发明所述的一种用于失眠的药物组合物的质量检测方法，该药物组合物由酸枣仁(炒)650g、柴胡(酒炒)380g、白芍(炒)380g、僵蚕(炒)300g、合欢花480g、合欢皮480g、蝉蜕300g、灯心草30g组成，其制备方法为：以上八味，加水煎煮二次，第一次1小时，第二次0.5小时，合并煎液，静置8小时，滤过，波液浓缩至50℃时相对密度为1.07，真空或喷雾干燥，干粉喷乙醇转动制粒，烘干，粉碎过60目筛，加入适量硬脂酸镁及微粉硅胶，并加淀粉调整总量为400g，装胶囊，制成1000粒，即得，其特征在于，该检测方法包括对组合物进行指纹图谱检测，所述指纹图谱检测包括色谱条件、供试品溶液制备、对照品溶液制备、混合对照品溶液制备、阴性对照溶液制备、单味药材供试品溶液制备。
本发明所述的色谱条件为：色谱柱：CORTECS C18，色谱柱规格为：4.6×150mm，2.7μm，流动相：以乙腈为流动相A、以0.1％磷酸水为流动相B，按规定的流动相梯度洗脱程序进行梯度洗脱，进样量10μL，柱温：30℃，流速：1mL/min，检测波长220～300nm，流动相梯度洗脱程序具体为：
Figure BDA0002193919800000021
优选的，本发明所述的色谱条件为：色谱柱：CORTECS C18，色谱柱规格为：4.6×150mm，2.7μm，流动相：以乙腈为流动相A、以0.1％磷酸水为流动相B，按规定的流动相梯度洗脱程序进行梯度洗脱，进样量10μL，柱温：30℃，流速：1mL/min，检测波长254nm，流动相梯度洗脱程序具体为：
Figure BDA0002193919800000022
本发明所述的供试品溶液制备具体为：取舒眠胶囊内容物1.0g，精密称定，置磨具塞100mL锥形瓶瓶中，加25％～75％甲醇25mL，称重，在功率200W，频率40kHz条件下超声提取30min～90min，取出，放冷，再称重，用25％～75％甲醇补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，滤液过0.22μm微孔滤膜，即得。
优选的，本发明所述的供试品溶液制备具体为：取舒眠胶囊内容物1.0g，精密称定，置磨具塞100mL锥形瓶瓶中，加75％甲醇25mL，称重，在功率200W，频率40kHz条件下超声提取30min，取出，放冷，再称重，用75％甲醇补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，滤液过0.22μm微孔滤膜，即得。
本发明所述的对照品溶液制备具体为：分别取芍药内酯苷对照品、芍药苷对照品、槲皮苷对照品、斯皮诺素对照品、槲皮素对照品适量，精密称定，加甲醇配制成浓度分别为0.944mg/mL、1.024mg/mL、1.020mg/mL、0.945mg/mL、0.928mg/mL对照品溶液。
本发明所述混合对照品溶液制备具体为：分别精密量取对照品溶液制备项下芍药内酯苷、芍药苷、槲皮苷、斯皮诺素、槲皮素对照品溶液适量，加甲醇稀释成浓度分别为94.40μg/mL、102.4μg/mL、9.45μg/mL、10.20μg/mL、9.28μg/mL混合对照品溶液。
本发明所述阴性对照溶液制备具体为：按照舒眠胶囊处方工艺分别制备缺酸枣仁(炒)、缺柴胡(酒炒)、缺白芍(炒)、缺合欢花、缺合欢皮、缺僵蚕、缺蝉蜕、缺灯心草的阴性样品，取样品1.0g，精密称定，置磨口具塞100mL锥形瓶瓶中，加75％甲醇25mL，称重，超声提取30min，取出，放冷，再称重，用75％甲醇补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，滤液过0.22μm微孔滤膜，即得。
本发明所述单味药材供试品溶液制备具体为：按照舒眠囊处方工艺分别制备酸枣仁(炒)、柴胡(酒炒)、白芍(炒)、合欢花、合欢皮、蝉蜕、僵蚕、灯心草的单煎液，分别取各单煎液1.0g，精密称定，置磨口具塞100mL锥形瓶瓶中，加75％甲醇25mL，称重，超声提取30min，取出，放冷，再称重，用75％甲醇补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，滤液过0.22μm微孔滤膜，即得。
本发明所述检测方法包括以下内容：
色谱条件与系统适用性试验色谱柱：CORTECS C18，色谱柱规格为：4.6×150mm，2.7μm，流动相：以乙腈为流动相A、以0.1％磷酸水为流动相B，按规定的流动相梯度洗脱程序进行梯度洗脱，进样量10μL，柱温：30℃，流速：1mL/min，检测波长254nm，流动相梯度洗脱程序具体为：
Figure BDA0002193919800000031
供试品溶液制备取舒眠胶囊内容物1.0g，精密称定，置磨具塞100mL锥形瓶瓶中，加75％甲醇25mL，称重，超声提取30min，取出，放冷，再称重，用75％甲醇补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，滤液过0.22μm微孔滤膜，即得。
对照品溶液制备分别取芍药内酯苷对照品、芍药苷对照品、槲皮苷对照品、斯皮诺素对照品、槲皮素对照品适量，精密称定，加甲醇配制成浓度分别为0.944mg/mL、1.024mg/mL、1.020mg/mL、0.945mg/mL、0.928mg/mL对照品溶液。
混合对照品溶液制备：分别精密量取对照品溶液制备项下的芍药内酯苷、芍药苷、槲皮苷、斯皮诺素、槲皮素对照品溶液适量，加甲醇稀释成浓度分别为94.40μg/mL、102.4μg/mL、9.45μg/mL、10.20μg/mL、9.28μg/mL混合对照品溶液。
阴性对照溶液制备按照舒眠胶囊处方工艺分别制备缺酸枣仁(炒)、缺柴胡(酒炒)、缺白芍(炒)、缺合欢花、缺合欢皮、缺僵蚕、缺蝉蜕、缺灯心草的阴性样品，取样品1.0g，精密称定，置磨口具塞100mL锥形瓶瓶中，加75％甲醇25mL，称重，超声提取30min，取出，放冷，再称重，用75％甲醇补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，滤液过0.22μm微孔滤膜，即得。
单味药材供试品溶液制备按照舒眠囊处方工艺分别制备酸枣仁(炒)、柴胡(酒炒)、白芍(炒)、合欢花、合欢皮、蝉蜕、僵蚕、灯心草的单煎液，分别取各单煎液1.0g，精密称定，置磨口具塞100mL锥形瓶瓶中，加75％甲醇25mL，称重，超声提取30min，取出，放冷，再称重，用75％甲醇补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，滤液过0.22μm微孔滤膜，即得。
本发明指纹图谱是照高效液相色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0512)测定，采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂。
本发明供试品指纹图谱中应呈现与参照物色谱峰保留时间相同的色谱峰，供试品色谱图应与对照指纹图谱基本一致(对照指纹图谱见图8)，有相应的36个共有峰，按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，以共有峰计算相似度，供试品指纹图谱与对照指纹图谱相似度不得低于0.90。
有益效果：
1、本发明与现有技术相比，解决的技术问题：
现有技术的问题：中国家药品监督管理局国家药品标准[WS3-733]-舒眠胶囊质量标准中主要对酸枣仁(炒)、柴胡、合欢花进行定性鉴别，对白芍进行定量检测，由于单纯的指标成分的定性鉴别和定量分析，未对全成分进行检测，因此难以反映产品质量的优劣。
本发明解决的技术问题：本发明克服了现有技术中的问题，首次对舒眠胶囊建立了指纹图谱为主的检测方法，能更好的进行全成分质量检测，加强了专属性鉴别和多成分、整体质量检测。
2、本发明有益效果如下：
①本发明对舒眠胶囊建立的指纹图谱为主的检测方法，以槲皮苷为参照峰，36个共有峰相对保留时间RSD均＜1.3％，相对峰面积RSD均＜2.9％(n＝6)，将图谱导入中药指纹图谱相似度评价系统，与生成的对照指纹图谱相比，相似度均大于0.999，说明本发明仪器精密度良好。
②以槲皮苷为参照峰，36个共有峰相对保留时间RSD均＜2.1％，相对峰面积RSD均＜2.9％(n＝7)，将图谱导入中药指纹图谱相似度评价系统，与生成的对照指纹图谱相比，相似度均大于0.999，表明本发明在36h内稳定性良好。
③以槲皮苷为参照峰，36个共有峰相对保留时间RSD均＜2.3％，相对峰面积RSD＜3.7％(n＝6)，将图谱导入中药指纹图谱相似度评价系统，与生成的对照指纹图谱相比，相似度均大于0.999，表明本发明重复性良好。
④利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)建立15批舒眠胶囊指纹图谱的共有模式，以22号峰槲皮苷为参照峰，设S1样品图谱作为参照图谱，采用中位数法，时间窗宽度为0.1，经过多点校正后自动匹配，生成对照指纹图谱，确定了舒眠胶囊指纹图谱36个共有峰。
⑤采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”对15批舒眠胶囊样品的HPLC图谱进行相似度评价，结果显示不同批次舒眠胶囊相似度均大于0.90，表明不同批次舒眠胶囊整体质量差异较小，稳定性较好。
⑥本发明通过提取方式的考察，筛选了最佳提取方式为超声提取，提取方法科学合理。
⑦本发明通过对提取时间的考察，筛选了最佳超声提取时间为30min，提取较完全。
⑧本发明通过对提取溶剂的考察，用75％甲醇作为提取溶剂能提取出制剂中更为丰富全面的成分。
⑨本发明通过对波长的选择试验，确定优选波长为254nm，各指标性成分的峰形较好、基线平稳，色谱峰数目较多，信息量较大。
附图说明
图1提取方式考察叠加图
图2提取时间考察叠加图
图3提取溶剂叠加图
图4波长的考察
图5精密度色谱图叠加图
图6稳定性色谱图叠加图
图7重复性色谱图叠加图
图8药材样品HPLC对照指纹图谱
图9 15批药材样品指纹图谱叠加
图10混合对照品(A)和舒眠胶囊S3(B)的HPLC图-A
图11混合对照品(A)和舒眠胶囊S3(B)的HPLC图-B
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步地具体说明。
实施例1
配方：酸枣仁(炒)650g、柴胡(酒炒)380g、白芍(炒)380g、僵蚕(炒)300g、合欢花480g、合欢皮480g、蝉蜕300g、灯心草30g组成。
制备方法：以上八味，加水煎煮二次，第一次1小时，第二次0.5小时，合并煎液，静置8小时，滤过，波液浓缩至50℃时相对密度为1.07，真空或喷雾干燥，干粉喷乙醇转动制粒，烘干，粉碎过60目筛，加入适量硬脂酸镁及微粉硅胶，并加淀粉调整总量为400g，装胶囊，制成1000粒，即得。
色谱条件与系统适用性试验色谱柱：CORTECS C18，色谱柱规格为：
4.6×150mm，2.7μm，流动相：以乙腈为流动相A、以0.1％磷酸水为流动相B，按规定的流动相梯度洗脱程序进行梯度洗脱，进样量10μL，柱温：30℃，流速：1mL/min，检测波长254nm，流动相梯度洗脱程序具体为：
Figure BDA0002193919800000061
供试品溶液制备取舒眠胶囊内容物1.0g，精密称定，置磨具塞100mL锥形瓶瓶中，加75％甲醇25mL，称重，超声提取30min，取出，放冷，再称重，用75％甲醇补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，滤液过0.22μm微孔滤膜，即得。
对照品溶液制备分别取芍药内酯苷对照品、芍药苷对照品、槲皮苷对照品、斯皮诺素对照品、槲皮素对照品适量，精密称定，加甲醇配制成浓度分别为0.944mg/mL、1.024mg/mL、1.020mg/mL、0.945mg/mL、0.928mg/mL对照品溶液。
混合对照品溶液制备：分别精密量取对照品溶液制备项下的芍药内酯苷、芍药苷、槲皮苷、斯皮诺素、槲皮素对照品溶液适量，加甲醇稀释成浓度分别为94.40μg/mL、102.4μg/mL、9.45μg/mL、10.20μg/mL、9.28μg/mL混合对照品溶液。
阴性对照溶液制备按照舒眠胶囊处方工艺分别制备缺酸枣仁(炒)、缺柴胡(酒炒)、缺白芍(炒)、缺合欢花、缺合欢皮、缺僵蚕、缺蝉蜕、缺灯心草的阴性样品，取样品1.0g，精密称定，置磨口具塞100mL锥形瓶瓶中，加75％甲醇25mL，称重，超声提取30min，取出，放冷，再称重，用75％甲醇补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，滤液过0.22μm微孔滤膜，即得。
单味药材供试品溶液制备按照舒眠囊处方工艺分别制备酸枣仁(炒)、柴胡(酒炒)、白芍(炒)、合欢花、合欢皮、蝉蜕、僵蚕、灯心草的单煎液，分别取各单煎液1.0g，精密称定，置磨口具塞100mL锥形瓶瓶中，加75％甲醇25mL，称重，超声提取30min，取出，放冷，再称重，用75％甲醇补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，滤液过0.22μm微孔滤膜，即得。
实施例2
配方：酸枣仁(炒)650g、柴胡(酒炒)380g、白芍(炒)380g、僵蚕(炒)300g、合欢花480g、合欢皮480g、蝉蜕300g、灯心草30g组成。
制备方法：以上八味，加水煎煮二次，第一次1小时，第二次0.5小时，合并煎液，静置8小时，滤过，波液浓缩至50℃时相对密度为1.07，真空或喷雾干燥，干粉喷乙醇转动制粒，烘干，粉碎过60目筛，加入适量硬脂酸镁及微粉硅胶，并加淀粉调整总量为400g，装胶囊，制成1000粒，即得。
色谱条件与系统适用性试验色谱柱：CORTECS C18，色谱柱规格为：
4.6×150mm，2.7μm，流动相：以乙腈为流动相A、以0.1％磷酸水为流动相B，按规定的流动相梯度洗脱程序进行梯度洗脱，进样量10μL，柱温：30℃，流速：1mL/min，检测波长220nm，流动相梯度洗脱程序具体为：
Figure BDA0002193919800000071
供试品溶液制备取舒眠胶囊内容物1.0g，精密称定，置磨具塞100mL锥形瓶瓶中，加25％甲醇25mL，称重，超声提取30min，取出，放冷，再称重，用25％甲醇补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，滤液过0.22μm微孔滤膜，即得。
对照品溶液制备分别取芍药内酯苷对照品、芍药苷对照品、槲皮苷对照品、斯皮诺素对照品、槲皮素对照品适量，精密称定，加甲醇配制成浓度分别为0.944mg/mL、1.024mg/mL、1.020mg/mL、0.945mg/mL、0.928mg/mL对照品溶液。
混合对照品溶液制备：分别精密量取对照品溶液制备项下的芍药内酯苷、芍药苷、槲皮苷、斯皮诺素、槲皮素对照品溶液适量，加甲醇稀释成浓度分别为94.40μg/mL、102.4μg/mL、9.45μg/mL、10.20μg/mL、9.28μg/mL混合对照品溶液。
阴性对照溶液制备按照舒眠胶囊处方工艺分别制备缺酸枣仁(炒)、缺柴胡(酒炒)、缺白芍(炒)、缺合欢花、缺合欢皮、缺僵蚕、缺蝉蜕、缺灯心草的阴性样品，取样品1.0g，精密称定，置磨口具塞100mL锥形瓶瓶中，加75％甲醇25mL，称重，超声提取30min，取出，放冷，再称重，用75％甲醇补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，滤液过0.22μm微孔滤膜，即得。
单味药材供试品溶液制备按照舒眠囊处方工艺分别制备酸枣仁(炒)、柴胡(酒炒)、白芍(炒)、合欢花、合欢皮、蝉蜕、僵蚕、灯心草的单煎液，分别取各单煎液1.0g，精密称定，置磨口具塞100mL锥形瓶瓶中，加75％甲醇25mL，称重，超声提取30min，取出，放冷，再称重，用75％甲醇补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，滤液过0.22μm微孔滤膜，即得。
实施例3
配方：酸枣仁(炒)650g、柴胡(酒炒)380g、白芍(炒)380g、僵蚕(炒)300g、合欢花480g、合欢皮480g、蝉蜕300g、灯心草30g组成。
制备方法：以上八味，加水煎煮二次，第一次1小时，第二次0.5小时，合并煎液，静置8小时，滤过，波液浓缩至50℃时相对密度为1.07，真空或喷雾干燥，干粉喷乙醇转动制粒，烘干，粉碎过60目筛，加入适量硬脂酸镁及微粉硅胶，并加淀粉调整总量为400g，装胶囊，制成1000粒，即得。
色谱条件与系统适用性试验色谱柱：CORTECS C18，色谱柱规格为：
4.6×150mm，2.7μm，流动相：以乙腈为流动相A、以0.1％磷酸水为流动相B，按规定的流动相梯度洗脱程序进行梯度洗脱，进样量10μL，柱温：30℃，流速：1mL/min，检测波长270nm，流动相梯度洗脱程序具体为：
Figure BDA0002193919800000081
Figure BDA0002193919800000091
供试品溶液制备取舒眠胶囊内容物1.0g，精密称定，置磨具塞100mL锥形瓶瓶中，加50％甲醇25mL，称重，超声提取60min，取出，放冷，再称重，用25％～75％甲醇补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，滤液过0.22μm微孔滤膜，即得。
对照品溶液制备分别取芍药内酯苷对照品、芍药苷对照品、槲皮苷对照品、斯皮诺素对照品、槲皮素对照品适量，精密称定，加甲醇配制成浓度分别为0.944mg/mL、1.024mg/mL、1.020mg/mL、0.945mg/mL、0.928mg/mL对照品溶液。
混合对照品溶液制备：分别精密量取对照品溶液制备项下的芍药内酯苷、芍药苷、槲皮苷、斯皮诺素、槲皮素对照品溶液适量，加甲醇稀释成浓度分别为94.40μg/mL、102.4μg/mL、9.45μg/mL、10.20μg/mL、9.28μg/mL混合对照品溶液。
阴性对照溶液制备按照舒眠胶囊处方工艺分别制备缺酸枣仁(炒)、缺柴胡(酒炒)、缺白芍(炒)、缺合欢花、缺合欢皮、缺僵蚕、缺蝉蜕、缺灯心草的阴性样品，取样品1.0g，精密称定，置磨口具塞100mL锥形瓶瓶中，加75％甲醇25mL，称重，超声提取30min，取出，放冷，再称重，用75％甲醇补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，滤液过0.22μm微孔滤膜，即得。
单味药材供试品溶液制备按照舒眠囊处方工艺分别制备酸枣仁(炒)、柴胡(酒炒)、白芍(炒)、合欢花、合欢皮、蝉蜕、僵蚕、灯心草的单煎液，分别取各单煎液1.0g，精密称定，置磨口具塞100mL锥形瓶瓶中，加75％甲醇25mL，称重，超声提取30min，取出，放冷，再称重，用75％甲醇补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，滤液过0.22μm微孔滤膜，即得。
实施例4
配方：酸枣仁(炒)650g、柴胡(酒炒)380g、白芍(炒)380g、僵蚕(炒)300g、合欢花480g、合欢皮480g、蝉蜕300g、灯心草30g组成。
制备方法：以上八味，加水煎煮二次，第一次1小时，第二次0.5小时，合并煎液，静置8小时，滤过，波液浓缩至50℃时相对密度为1.07，真空或喷雾干燥，干粉喷乙醇转动制粒，烘干，粉碎过60目筛，加入适量硬脂酸镁及微粉硅胶，并加淀粉调整总量为400g，装胶囊，制成1000粒，即得。
色谱条件与系统适用性试验色谱柱：CORTECS C18，色谱柱规格为：
4.6×150mm，2.7μm，流动相：以乙腈为流动相A、以0.1％磷酸水为流动相B，按规定的流动相梯度洗脱程序进行梯度洗脱，进样量10μL，柱温：30℃，流速：1mL/min，检测波长300nm，流动相梯度洗脱程序具体为：
Figure BDA0002193919800000101
供试品溶液制备取舒眠胶囊内容物1.0g，精密称定，置磨具塞100mL锥形瓶瓶中，加75％甲醇25mL，称重，超声提取90min，取出，放冷，再称重，用75％甲醇补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，滤液过0.22μm微孔滤膜，即得。
对照品溶液制备分别取芍药内酯苷对照品、芍药苷对照品、槲皮苷对照品、斯皮诺素对照品、槲皮素对照品适量，精密称定，加甲醇配制成浓度分别为0.944mg/mL、1.024mg/mL、1.020mg/mL、0.945mg/mL、0.928mg/mL对照品溶液。
混合对照品溶液制备：分别精密量取对照品溶液制备项下的芍药内酯苷、芍药苷、槲皮苷、斯皮诺素、槲皮素对照品溶液适量，加甲醇稀释成浓度分别为94.40μg/mL、102.4μg/mL、9.45μg/mL、10.20μg/mL、9.28μg/mL混合对照品溶液。
阴性对照溶液制备按照舒眠胶囊处方工艺分别制备缺酸枣仁(炒)、缺柴胡(酒炒)、缺白芍(炒)、缺合欢花、缺合欢皮、缺僵蚕、缺蝉蜕、缺灯心草的阴性样品，取样品1.0g，精密称定，置磨口具塞100mL锥形瓶瓶中，加75％甲醇25mL，称重，超声提取30min，取出，放冷，再称重，用75％甲醇补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，滤液过0.22μm微孔滤膜，即得。
单味药材供试品溶液制备按照舒眠囊处方工艺分别制备酸枣仁(炒)、柴胡(酒炒)、白芍(炒)、合欢花、合欢皮、蝉蜕、僵蚕、灯心草的单煎液，分别取各单煎液1.0g，精密称定，置磨口具塞100mL锥形瓶瓶中，加75％甲醇25mL，称重，超声提取30min，取出，放冷，再称重，用75％甲醇补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，滤液过0.22μm微孔滤膜，即得。
为了进一步验证本发明的有效性及科学性，本发明团队进行了以下试验：
1实验仪器与材料
1.1试剂与耗材
15批次舒眠胶囊(批号：20160721，20160722，20160801，20171201，20171006，20171108，20171002，20170504，20170601，20170910，20170702，20170305，20170404，20170205，20170103)，分别表示为S1-S15，均由贵州大隆药业有限责任公司提供；芍药内酯苷对照品(批号：wkq18050205，纯度：≥98％)、芍药苷对照品(批号：wkq18032104，纯度：≥98％)、槲皮苷对照品(批号：wkq18041101，纯度：≥98％)、斯皮诺素对照品(批号：wkq18060104，纯度：≥98％)、槲皮素对照品(批号：wkq18030806，纯度：≥98％)，均购于四川省维克奇生物科技有限公司；乙腈色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为超纯水。
1.2仪器
UltiMate 3000型高效液相色谱仪(美国赛默飞世尔科技公司，包括系统控制器，输液泵，脱气组件，低压梯度组件，自动进样器，柱温箱，温控样品室，UV-DAD检测器，Chromeleon色谱数据工作站)；Mettler AE-240电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；KQ5200E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；超纯水机(四川沃特尔科技发展有限公司)。
2方法与结果
2.1色谱条件
色谱柱：CORTECS C18(4.6×150mm，2.7μm)，流动相：乙腈(A)、0.1％磷酸水(B)，梯度洗脱：0-17min，5％-10％乙腈，17-30min，10％-15％乙腈，30-45min，15％-20％乙腈，45-50min，20％-20％乙腈，50-65min，20％-30％乙腈，65-90min，30％-52％乙腈，90-95min，52％-95％乙腈。进样量10μL，柱温：
30℃，流速：1mL/min，检测波长254nm。
2.2供试品前处理优选
2.2.1提取方式的考察
取批号为20170801(S3)的舒眠胶囊内容物1.0g，共2份，精密称定，置于100mL具塞锥形瓶，分别加入甲醇25mL作为提取溶剂，称重，分别采用超声处理(功率200W，频率40kHz)2h、加热回流2h的方法，取出，放冷，再称重，用甲醇补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，滤液过0.22μm微孔滤膜，即得。结果如图1所示，结果表明2种提取方法提取效果无显著性差异，超声法提取简便易行，故优选超声提取。
2.2.2提取时间的考察
取批号为20170801(S3)的舒眠胶囊内容物1.0g，共3份，精密称定，置于100mL具塞锥形瓶，分别加入甲醇25mL作为提取溶剂，称重，分别采用超声处理(功率200W，频率40kHz)30min、60min和90min，取出，放冷，再称重，用甲醇补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，滤液过0.22μm微孔滤膜，即得。结果如图2所示，结果表明超声提取30min后，制剂中成分已提取较完全，故提取时间优选为30min。
2.2.3提取溶剂的考察
取批号为20170801(S3)的舒眠胶囊内容物1.0g，共8份，精密称定，置于100mL具塞锥形瓶，分别加入甲醇、75％甲醇、50％甲醇、25％甲醇、乙醇、75％乙醇、50％乙醇、25％乙醇、水各25mL作为提取溶剂，称重，超声处理(功率200W，频率40kHz)30min，取出，放冷，再称重，用相应提取溶剂补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，滤液过0.22μm微孔滤膜，即得。结果如图3所示，结果表明用75％甲醇作为提取溶剂能提取出制剂中更为丰富全面的成分，故本试验采用75％甲醇作为优选提取溶剂。
最终确定样品的制备方法为：取舒眠胶囊内容物1.0g，精密称定，置磨具塞100mL锥形瓶瓶中，加75％甲醇25mL，称重，超声提取30min，取出，放冷，再称重，用75％甲醇补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，滤液过0.22μm微孔滤膜，即得。
2.3HPLC特征指纹图谱条件的优化
2.3.1波长的选择
舒眠胶囊处方中含有8味药材，成分复杂，本实验采用了DAD检测器对样品进行了紫外全波长扫描，并提取了220nm、254nm、270nm、300nm处色谱图，分析发现，在254nm波长条件下，各指标性成分的峰形较好、基线平稳，色谱峰数目较多，信息量较大，故而优先选择254nm作为舒眠胶囊特征指纹图谱的检测波长。见图4。
2.3.2色谱柱的选择
本实验主要考察了VenusilXBP(L)、C18(4.6×250mm，5μm)、ACE Excel C18(4.6×250mm，5μm)、CORTECS C18(4.6×150mm，2.7μm)等色谱柱对舒眠胶囊中分析物的分离能力，优选采用CORTECS C18柱。
2.3.3流动相的选择
本实验主要考察了乙腈-水、乙腈-0.1％甲酸水、乙腈-0.1％磷酸水、甲醇-水等作为流动相对舒眠胶囊中分析物的分离能力，优选以乙腈-0.1％磷酸水作为流动相，采用梯度洗脱。
2.4溶液的制备
2.4.1对照品溶液制备
分别取芍药内酯苷对照品、芍药苷对照品、槲皮苷对照品、斯皮诺素对照品、槲皮素对照品适量，精密称定，加甲醇配制成浓度分别为0.944mg/mL、1.024mg/mL、1.020mg/mL、0.945mg/mL、0.928mg/mL对照品溶液。
2.4.2混合对照品溶液制备
分别精密量取2.4.1项下芍药内酯苷、芍药苷、槲皮苷、斯皮诺素、槲皮素对照品溶液适量，加甲醇稀释成浓度分别为94.40μg/mL、102.4μg/mL、9.45μg/mL、10.20μg/mL、9.28μg/mL混合对照品溶液。
2.4.3供试品溶液制备
取舒眠胶囊内容物1.0g，精密称定，置磨口具塞100mL锥形瓶瓶中，加75％甲醇25mL，称重，超声提取30min，取出，放冷，再称重，用75％甲醇补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，滤液过0.22μm微孔滤膜，即得。
2.4.4阴性对照溶液制备
按照舒眠囊处方工艺分别制备缺酸枣仁(炒)、缺柴胡(酒炒)、缺白芍(炒)、缺合欢花、缺合欢皮、缺僵蚕、缺蝉蜕、缺灯心草的阴性样品，依照2.4.3项下的方法制备阴性对照溶液。
2.4.5单味药材供试品溶液制备
按照舒眠囊处方工艺分别制备酸枣仁(炒)、柴胡(酒炒)、白芍(炒)、合欢花、合欢皮、蝉蜕、僵蚕、灯心草的单煎液，依照2.4.3项下的方法制备单味药材供试品溶液。
2.5方法学考察
2.5.1精密度试验
取舒眠胶囊S3内容物1.0g，精密称定，按“2.4.3”项下制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，连续进样测定6次，记录槲皮苷等36个主要色谱峰保留时间和峰面积。结果显示，以槲皮苷为参照峰，36个共有峰相对保留时间RSD均＜1.3％，相对峰面积RSD均＜2.9％(n＝6)，将图谱导入中药指纹图谱相似度评价系统，与生成的对照指纹图谱相比，相似度均大于0.999，说明仪器精密度良好。如图5所示，详见表1、表2。
表1精密度试验共有峰相对保留时间
Figure BDA0002193919800000141
表2精密度试验共有峰相对峰面积
Figure BDA0002193919800000151
2.5.2稳定性试验
取舒眠胶囊S3内容物1.0g，精密称定，按“2.4.3”项下制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，分别在0、2、4、8、12、24、36h进样，记录槲皮苷等36个主要色谱峰保留时间和峰面积。结果显示，以槲皮苷为参照峰，36个共有峰相对保留时间RSD均＜2.1％，相对峰面积RSD均＜2.9％(n＝7)，将图谱导入中药指纹图谱相似度评价系统，与生成的对照指纹图谱相比，相似度均大于0.999，表明供试品溶液在36h内稳定性良好。如图6所示，结果见表3、表4。
表3稳定性试验共有峰相对保留时间
Figure BDA0002193919800000161
表4稳定性试验共有峰相对峰面积
Figure BDA0002193919800000171
2.5.3重复性试验
取舒眠胶囊S3内容物1.0g，精密称定，按“2.4.3”项下平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，记录槲皮苷等36个主要色谱峰保留时间和峰面积。结果显示，以槲皮苷为参照峰，36个共有峰相对保留时间RSD均＜2.3％，相对峰面积RSD＜3.7％(n＝6)，将图谱导入中药指纹图谱相似度评价系统，与生成的对照指纹图谱相比，相似度均大于0.999，表明该方法的重复性良好。如图7所示，结果见表5、表6。
表5重复性试验共有峰相对保留时间
Figure BDA0002193919800000181
表6重复性试验共有峰相对峰面积
Figure BDA0002193919800000191
2.6样品测定
分别取各批次舒眠胶囊样品1.0g，精密称定，按“2.4.3”项下供试品溶液制备方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件检测。将所得图谱导入中药指纹图谱相似度评价系统，进行相似度计算。
2.7结果
2.7.1指纹图谱的建立及共有峰的选择
利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)建立15批舒眠胶囊指纹图谱的共有模式，以22号峰槲皮苷为参照峰，设S1样品图谱作为参照图谱，采用中位数法，时间窗宽度为0.1，经过多点校正后自动匹配，生成对照指纹图谱，确定了舒眠胶囊指纹图谱36个共有峰。对照指纹图谱见图8，15批次舒眠胶囊叠加指纹图谱如图9所示。
2.7.2指纹图谱共有峰归属
通过单味药材的HPLC图谱与共有模式图谱比较，对保留时间一致且紫外光谱信息相同的色谱峰进行分析，同时采用阴性对照进行比对，确认指纹图谱共有峰的药材归属。通过对比分析，36个共有峰中，30个色谱峰得到归属，其中峰7、13、14、23来自酸枣仁药材，峰26、28、29、30、31、32、33、34、35、36来自药材柴胡，峰5、9、11、12、15、21、27来自白芍药材，峰10、16、17、18、20、22、24、25来自合欢花药材，峰8为白芍、合欢皮所共有，表明制剂与药材之间存在良好的相关性。
2.7.3指纹图谱共有峰指认
利用对照品对各峰的成分进行指认，通过对照品色图谱与共有模式图谱比较，根据各峰保留时间定位和化学成分的紫外光谱图信息对比，共指认了5个共有峰，即9号峰为芍药内酯苷、11号峰为芍药苷、14号峰为斯皮诺素、22号峰为槲皮苷、25号峰为槲皮素，其中22号槲皮苷分离度较好、峰面积较大，峰形稳定，且为所有样品共有，故选择其为参照峰。混合对照品溶液和代表性样品(S3)HPLC图详见图10、图11。
2.7.4指纹图谱相似度评价
采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”对15批舒眠胶囊样品的HPLC图谱进行相似度评价，结果显示不同批次舒眠胶囊相似度均大于0.90，表明不同批次舒眠胶囊整体质量差异较小，稳定性较好，详见表7。
表7 15批样品指纹图谱相似度评价结果
Figure BDA0002193919800000201
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (1)

1.一种用于失眠的药物组合物的质量检测方法，该药物组合物由炒酸枣仁650g、酒炒柴胡380g、炒白芍380g、炒僵蚕300g、合欢花480g、合欢皮480g、蝉蜕300g、灯心草30g组成，其制备方法为：以上八味，加水煎煮二次，第一次1小时，第二次0.5小时，合并煎液，静置8小时，滤过，滤液浓缩至50℃时相对密度为1.07，真空或喷雾干燥，干粉喷乙醇转动制粒，烘干，粉碎过60目筛，加入适量硬脂酸镁及微粉硅胶，并加淀粉调整总量为400g，装胶囊，制成1000粒，即得，其特征在于，该质量检测方法包括对组合物进行指纹图谱检测，所述指纹图谱检测包括色谱条件、供试品溶液制备、对照品溶液制备、混合对照品溶液制备、阴性对照溶液制备、单味药材供试品溶液制备；
色谱条件与系统适用性试验色谱柱：CORTECS C18，色谱柱规格为：4.6×150mm，2.7μm，流动相：以乙腈为流动相A、以0.1％磷酸水为流动相B，按规定的流动相梯度洗脱程序进行梯度洗脱，进样量10μL，柱温：30℃，流速：1mL/min，检测波长254nm，流动相梯度洗脱程序具体为：
Figure FDA0003493369060000011
供试品溶液制备取舒眠胶囊内容物1.0g，精密称定，置磨具塞100mL锥形瓶瓶中，加75％甲醇25mL，称重，超声提取30min，取出，放冷，再称重，用75％甲醇补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，滤液过0.22μm微孔滤膜，即得；
对照品溶液制备分别取芍药内酯苷对照品、芍药苷对照品、槲皮苷对照品、斯皮诺素对照品、槲皮素对照品适量，精密称定，加甲醇配制成浓度分别为0.944mg/mL、1.024mg/mL、1.020mg/mL、0.945mg/mL、0.928mg/mL对照品溶液；
混合对照品溶液制备：分别精密量取对照品溶液制备项下的芍药内酯苷、芍药苷、槲皮苷、斯皮诺素、槲皮素对照品溶液适量，加甲醇稀释成浓度分别为94.40μg/mL、102.4μg/mL、9.45μg/mL、10.20μg/mL、9.28μg/mL混合对照品溶液；
阴性对照溶液制备按照舒眠胶囊处方工艺分别制备缺炒酸枣仁、缺酒炒柴胡、缺炒白芍、缺合欢花、缺合欢皮、缺僵蚕、缺蝉蜕、缺灯心草的阴性样品，取样品1.0g，精密称定，置磨口具塞100mL锥形瓶瓶中，加75％甲醇25mL，称重，超声提取30min，取出，放冷，再称重，用75％甲醇补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，滤液过0.22μm微孔滤膜，即得；
单味药材供试品溶液制备按照舒眠囊处方工艺分别制备炒酸枣仁、酒炒柴胡、炒白芍、合欢花、合欢皮、蝉蜕、僵蚕、灯心草的单煎液，分别取各单煎液1.0g，精密称定，置磨口具塞100mL锥形瓶瓶中，加75％甲醇25mL，称重，超声提取30min，取出，放冷，再称重，用75％甲醇补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，滤液过0.22μm微孔滤膜，即得。
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