CN112505181B

CN112505181B - 一种复方巴戟天健骨颗粒hplc指纹图谱的建立方法

Info

Publication number: CN112505181B
Application number: CN202011368702.7A
Authority: CN
Inventors: 严锦贤; 倪立坚; 李颖; 王和鸣; 宋红梅
Original assignee: Second People's Hospital Of Fujian University Of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Second People's Hospital Of Fujian University Of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2020-11-30
Filing date: 2020-11-30
Publication date: 2022-08-09
Anticipated expiration: 2040-11-30
Also published as: CN112505181A

Abstract

本发明公开了一种复方巴戟天健骨颗粒HPLC指纹图谱的建立方法，其是以丹酚酸B、人参皂苷Rg1、补骨脂素、异补骨脂素、川续断皂苷Ⅵ和淫羊藿苷这6种活性成分为对照品，采用HPLC/DAD、以甲醇‑0.2％磷酸水溶液为流动相，对不同批样品进行检测，最终获得复方巴戟天健骨颗粒的指纹图谱。本发明通过对复方巴戟天健骨颗粒指纹图谱中6个共有峰进行化学成分归属，可实现对复方巴戟天健骨颗粒中丹参、补骨脂、淫羊藿等5味药材是否投料的监测，从而能有效的监控不同批次间复方巴戟天健骨颗粒的质量，为提高复方巴戟天健骨颗粒质量控制标准提供了一种可靠的方法，有利于全面监控产品质量。

Description

一种复方巴戟天健骨颗粒HPLC指纹图谱的建立方法

技术领域

本发明属于中药检测分析领域，具体涉及一种复方巴戟天健骨颗粒的HPLC指纹图谱的建立方法。

背景技术

复方巴戟天健骨颗粒由巴戟天、丹参、骨碎补、补骨脂、淫羊藿等12味中药组成，是王和鸣教授依据五十余年临床验方为基础化裁而来，具有活血化瘀、补益肝肾、壮骨止痛等功效，可治疗髋部疼痛、肌肉萎缩、活动功能障碍、跛行，股骨头坏死等症。

复方巴戟天健骨颗粒现行的质量标准仅包含单一的含量检测项和部分药材的薄层鉴别项，难以反映和控制制剂的整体质量。但中药成分复杂多样，其药效的发挥往往是多种成分共同作用的结果，因此对其成分进行全面测定十分必要。

指纹图谱具有信息量大、专属性、整体性和模糊性强的特点，能充分反映中药化学成分信息，从而对其内在质量进行综合评价和有效控制。目前只有三七、枸杞子的薄层定性鉴别，及淫羊藿苷的含量测定分析，而复方巴戟天健骨颗粒的指纹图谱的研究尚未见报道，无法有效的控制复方巴戟天健骨颗粒的质量。

发明内容

为了解决该技术问题，本发明提供了一种复方巴戟天健骨颗粒HPLC指纹图谱的建立方法，其对复方巴戟天健骨颗粒中含有的丹酚酸B、人参皂苷Rg1、补骨脂素、异补骨脂素、川续断皂苷Ⅵ和淫羊藿苷这6种活性成分进行归属，能够为复方巴戟天健骨颗粒的质量分析控制提供参考。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种复方巴戟天健骨颗粒HPLC指纹图谱的建立方法，其包括以下步骤：

1）对照品溶液的制备：取丹酚酸B、人参皂苷Rg1、补骨脂素、异补骨脂素、川续断皂苷Ⅵ、淫羊藿苷对照品，分别置于容量瓶中，加甲醇溶解并定容，再分别经微孔滤膜过滤后得到相应的对照品溶液；

2）供试品溶液的制备：将10批复方巴戟天健骨颗粒样品粉碎，各取2.5g置于具塞三角瓶中，然后按料液比1:40 g/mL加入50 vol%的甲醇溶液，超声提取30分钟，然后离心，取上清液浓缩至干后，所得残渣加甲醇溶解并转移至5 mL容量瓶中定容，经微孔滤膜过滤得供试品溶液；

3）样品的测定：分别精密吸取各对照品溶液和供试品溶液，经HPLC/DAD检测，获得对照品和供试品的色谱图；

4）指纹图谱的建立：将所得供试品的色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》进行评价，获得相应的指纹图谱，并利用对照品的色谱图对其特征成分进行归属。

步骤3）中所述HPLC检测的色谱条件为：Acclaim C18色谱柱，规格为4.6 mm×250mm、5μm，进样量20μL，检测波长为210nm，柱温30℃；以甲醇-0.2 vol%磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，流动相流速为0.8 mL/min；其洗脱程序为0-5min，甲醇体积维持在10%；5-20min，甲醇体积由10%提升到22%；20-50min，甲醇体积由22%提升到42%，50-90min，甲醇体积由42%提升到100%，90-95min，甲醇的体积维持在100%，95-96min，甲醇体积由100%降低到10%，96-100min，甲醇体积维持在10%。

本发明提供了一种复方巴戟天健骨颗粒的液相指纹图谱的建立方法，其采用50%甲醇溶液对复方巴戟天健骨颗粒样品进行超声提取，然后经HPLC/DAD进行测定，以甲醇-0.2 vol%磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，最终获得复方巴戟天健骨颗粒的指纹图谱信息，其可为复方巴戟天健骨颗粒的质量监测和评价奠定基础。

本发明具有如下优点：

（1）本发明对指纹图谱中6个共有峰（丹酚酸B、人参皂苷Rg1、补骨脂素、异补骨脂素、川续断皂苷Ⅵ、淫羊藿苷）进行化学成分归属，可以实现对复方巴戟天健骨颗粒中所用5味药材（丹参、三七、补骨脂、续断、淫羊藿）的是否投料进行监测。

（2）本发明方法具有精密度高、重现性好等特点，能有效的监测不同批次间复方巴戟天健骨颗粒的质量，有利于实现对产品质量的全面监测。

附图说明

图1为复方巴戟天健骨颗粒及各对照品高效液相色谱图（丹酚酸B、人参皂苷Rg1、补骨脂素；异补骨脂素、川续断皂苷Ⅵ、淫羊藿苷）

图2为复方巴戟天健骨颗粒与丹参阴性颗粒色谱图的对比图；

图3为复方巴戟天健骨颗粒与三七阴性颗粒色谱图的对比图；

图4为复方巴戟天健骨颗粒与补骨脂阴性颗粒色谱图的对比图；

图5为复方巴戟天健骨颗粒与续断阴性颗粒色谱图的对比图；

图6为复方巴戟天健骨颗粒与淫羊藿阴性颗粒色谱图的对比图。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。

1 仪器与材料

1.1 仪器 DIONEX U-3000高效液相色谱仪(含DGP-3600SD双梯度泵、WPS-3000SL自动进样器、TCC-3000RS柱温箱、DAD-3000二极管阵列检测器、Chromeleon 7.1色谱工作站，美国热电)；十万分之一分析天平（型号：AE240S，梅特勒-托利多）；普通分析天平（型号：YP502N，上海精密科学仪器有限公司）。

1.2 材料对照品丹酚酸B（批号：P20J10F93457，绿叶生物）、人参皂苷Rg1（批号：G30N10Y104330，绿叶生物）、补骨脂素（批号：PS000181，成都普思）、异补骨脂素（批号：PS010298，成都普思）、川续断皂苷Ⅵ（批号：111685-201707，中国食品药品检定研究院）、淫羊藿苷（批号：T05D9B76755，绿叶生物）；甲醇（分析纯，西陇化工）。

色谱纯试剂：甲醇（德国Merck公司、批号1880707710），乙腈（美国Fisher公司、批号167265），磷酸（美国Fisher公司、批号170534）。水为超纯水（电阻率为18.25Ω）。

2 实验方法和结果

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品溶液的制备：准确称取淫羊藿苷、丹酚酸B、川续断皂苷Ⅵ、人参皂苷Rg1、补骨脂素和异补骨脂素对照品，分别置于容量瓶中，加适量甲醇溶解并定容后，经0.45μm微孔滤膜过滤，分别得到丹酚酸B、淫羊藿苷、川续断皂苷Ⅵ、人参皂苷Rg1、补骨脂素和异补骨脂素的对照品溶液，其浓度分别为200μg/mL、100μg/mL、150μg/mL、447μg/mL、40μg/mL、80μg/mL。

2.1.2 供试品溶液的制备：取复方巴戟天健骨颗粒5 g，研细，取约2.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中；精密加入50vol%甲醇溶液100 mL，密塞；超声（功率200 W，频率40kHz）处理30 min，静置放冷；离心（2000g/min）15min，收集上清液，用适量50vol%甲醇溶液洗涤沉淀后离心，合并上清液；上清液减压浓缩至干，所得残渣加适量甲醇溶解，并用甲醇定容至5ml容量瓶，经0.45 μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。

试验过程中，分别选取正丁醇、50%甲醇、乙酸乙酯、石油醚为提取溶剂，经相同条件超声提取后，减压回收溶剂，残渣用甲醇溶解后过滤，经HPLC进样测定，以总色谱峰的数量为指标，确定50%甲醇较其它三种溶剂的色谱峰数量增加15~30个，具有较明显的优势，故将50%甲醇作为最佳提取溶剂。

2.2 色谱条件

2.2.1 色谱柱：以总色谱峰的数量和分离度为指标，分别考察Hypersil BDS C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、SinoChrom ODS-BP色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Acclaim C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）3种规格的色谱柱，确定出最佳的色谱柱为Acclaim C18。

2.2.2 检测波长：试验过程中，分别在210nm、246nm、160nm、283nm波长下记录色谱图，比较色谱峰数目、峰形、峰强度以及分离效果等情况，发现当采用210nm检测波长时，色谱峰的数量和高度均优于采用246nm、260nm和283nm波长进行检测，故采用210nm为最佳检测波长。

2.2.3 流动相：采用不同比例的混合流动相进行HPLC检测，比较其色谱峰数目、色谱峰分离度和峰高等情况。

洗脱方案1：乙腈（A）-水（B），梯度洗脱：0~35 min A，19%；35~55 min，19%→29% A；55~70 min，29%→36%A；70~100 min，36%→40% A。

洗脱方案2：乙醇（A）-水（B），梯度洗脱：0~5 min A，10%；5~20 min，10%→30% A；20~50 min，30→45 % A；50~70 min，45%→70% A；70~90 min，70%→100% A；90~95 min，100%A；95~96 min，100%→10% A；96~100 min，10% A。

洗脱方案3：甲醇（A）-乙腈（B）-水（C），梯度洗脱：0~5 min，10%A，5%B；5~20 min，10%→30% A，5%B；20~50 min，30%A，5%→19%B；50~70 min，30% A，19→29 % B；70~80 min，30%→45%A，29%→0B；80~95 min，45%→70% A；95~100 min，70%→10% A。

洗脱方案4：甲醇（A）-0.2% 磷酸水溶液（B），梯度洗脱：0~5 min，10% A；5~20 min，10%→22% A；20~50 min，22→42 % A；50~90 min，42%→100% A；90~95 min，100% A；95~96min，100%→10% A；96~100 min，10% A。

结果显示，以甲醇-0.2 vol %磷酸水溶液为流动相获得的色谱图能明显分离6个标志性组分，优于采用其它流动相获得的的色谱图，故采用甲醇-0.2 vol %磷酸水溶液为适宜流动相。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验取同一批的复方巴戟天健骨颗粒样品，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，按2.2 项下色谱条件进行高效液相测定，连续进样6次，记录色谱图；利用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2004 A版）软件评价得到的色谱图。结果显示，相似度在0.984~1.000之间，表明仪器的精密度良好。

2.3.2 重复性试验取同一批的复方巴戟天健骨颗粒样品，按2.1.2项下方法，平行制备6份供试品溶液，按2.2项下色谱条件进行高效液相测定，记录色谱图；利用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2004 A版）软件评价得到的色谱图。结果显示，相似度在0.986~0.999之间，表明方法重复性良好。

2.3.3 稳定性试验取同一批的复方巴戟天健骨颗粒样品，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，按2.2 项下色谱条件进行高效液相测定，分别在0、3、6、9、18、24 h进样测定，记录色谱图；利用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2004 A 版）软件评价得到的色谱图。结果显示，相似度在0.976~1.000，表明供试品溶液24 h内稳定。

2.4 指纹图谱的建立

取10批复方巴戟天健骨颗粒样品，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，按2.2项下色谱条件依次进样测定，记录样品色谱图。将所得10批复方巴戟天健骨颗粒的HPLC图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2004 A 版）软件，以1号样品的指纹图谱作为参照谱，时间窗设为0.5 min，利用中位数法，经多点校正自动匹配后生成如图1的复方巴戟天健骨颗粒对照指纹图谱。

2.5 指纹图谱的化学成分归属分析

分别取各对照品溶液（丹酚酸B、人参皂苷Rg1、补骨脂素、异补骨脂素、川续断皂苷Ⅵ、淫羊藿苷），按2.2项下色谱条件依次进样测定，记录对照品色谱图，然后将各对照品色谱峰与复方巴戟天健骨颗粒指纹图谱进行比对。结果如图1所示。

如图1所示，对复方巴戟天健骨颗粒指纹图谱中的6个共有峰进行化学成分归属分析，确认这6个色谱峰分别为丹酚酸B、人参皂苷Rg1、补骨脂素、异补骨脂素、川续断皂苷Ⅵ、淫羊藿苷。这6个化学成分可能分别来源于丹参、三七、补骨脂、续断和淫羊藿这5味药材。

2.6 阴性对照实验

按照复方巴戟天健骨颗粒的制备工艺，制备分别用于对照的不含丹参、三七、补骨脂、续断和淫羊藿的阴性颗粒。取各阴性颗粒，按2.1.2项下方法制备阴性对照供试品溶液，按2.2 项下色谱条件依次进样测定，记录阴性对照品供试品的色谱图，然后将各色谱峰与复方巴戟天健骨颗粒指纹图谱进行比对。结果如图2所示。

如图2所示，与复方巴戟天健骨颗粒指纹谱图相比，丹参阴性颗粒的色谱图缺少了丹酚酸B的色谱峰，因此可以确认复方巴戟天健骨颗粒指纹谱图中的丹酚酸B成分来源于丹参药材，利用丹酚酸B色谱峰可以用于复方巴戟天健骨颗粒中丹参的鉴别。同理，如图3~图6所示，人参皂苷Rg1的色谱峰可以用于复方巴戟天健骨颗粒中三七的鉴别；补骨脂素和异补骨脂素的色谱峰可以用于复方巴戟天健骨颗粒中补骨脂的鉴别；川续断皂苷Ⅵ的色谱峰可以用于复方巴戟天健骨颗粒中续断的鉴别；淫羊藿苷的色谱峰可以用于复方巴戟天健骨颗粒中淫羊藿的鉴别。因此，可利用复方巴戟天健骨颗粒指纹图谱对这5味药材是否投料进行监测。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims

1.一种复方巴戟天健骨颗粒HPLC指纹图谱的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：

4）指纹图谱的建立：将所得供试品的色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》进行评价，获得相应的指纹图谱，并利用对照品的色谱图对其特征成分进行归属；

所述HPLC检测的色谱条件为：Acclaim C18色谱柱，规格为4.6 mm×250mm、5μm，进样量20μL，检测波长为210nm，柱温30℃；以甲醇-0.2 vol%磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，流动相流速为0.8 mL/min；其洗脱程序为0-5min，甲醇体积维持在10%；5-20min，甲醇体积由10%提升到22%；20-50min，甲醇体积由22%提升到42%，50-90min，甲醇体积由42%提升到100%，90-95min，甲醇的体积维持在100%，95-96min，甲醇体积由100%降低到10%，96-100min，甲醇体积维持在10%。