CN109692302A - 一种治疗风湿骨痛的内服三七药酒的制备工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种治疗风湿骨痛的内服三七药酒制备工艺，其工艺主要由酶解、凝胶柱过滤、浸泡、渗漉、澄清步骤组成。整个制备过程仅采用不同浓度的白酒作为溶剂，工艺经济环保；药效成分明确，含量稳定，质量可控，其各成分转移率达到90～98％；相关药效实验显示，其对小鼠DNCB诱导的迟发性超敏反应具有显著的抑制作用，可以显著减轻大鼠纽扣肉芽肿、足趾肿胀情况；其安全、无明显毒副作用，适合长期服用。

Description

一种治疗风湿骨痛的内服三七药酒的制备工艺
(一)技术领域：本发明涉及中药技术领域，具体涉及一种用于风湿骨痛的三七药酒的制备工艺。
(二)背景技术：常见的风湿骨病包括骨性关节炎、风湿性关节炎、类风湿性关节炎、肩周炎、颈椎病、腰椎病、痛风、强直性脊柱炎、股骨头坏死、运动型损伤(跌打新老伤)、静脉曲张、无名肿痛、偏瘫、滑膜炎、腱鞘炎、肋膜炎、网球肘等。据世界卫生组织近年的调查统计报告显示，全球患不同程度风湿骨病的患者达全球人口的40％，高达25亿人以上，由于类风湿、痛风导致瘫痪的，全世界占发病人口的1.08％。初步的流行病学调查显示，我国骨性关节炎总的发病率约15％，其中40岁以下人群总发病率为2～3％；40-60岁人群总发病率为25～30％，60岁以上人群发病率者高达65％以上(西方国家发病率更高)。单这一个病症，以中老年为主的全国不同程度患者即达2亿人以上。目前风湿骨痛病的治疗方法，包括中医药辩证疗法、止痛西药治疗(西乐葆、乐松等)、物理治疗、推拿针灸治疗、封闭疗法、手术治疗等，但西乐葆等西药多数为缓解疼痛，治标不治本，长期用药副作用大，手术等风险大，费用高，而且复发风险较大。中医学将风湿病归为“痹证”，其病因主要由于身体虚弱，又感受风寒、湿邪，气血运行不畅所致。中药药效作用温和而持久，毒副作用较少，患者接受长程治疗的耐受性较好；复方中药通过多途径、多环节、多靶点的特点，能够发挥整合调节作用，可以针对风湿病的多个病理环节进行整体治疗；可以改善患者的一般状况，增强体质，延缓病情发展，预防和改善骨质破坏。中国古籍记载大量用于风湿骨痛中药，如《伤寒论》记载风湿相抟，骨节疼烦，掣痛不得屈伸，近之则痛剧，汗出短气，小便不利，恶风不欲去衣，或身微肿者，甘草附子汤主之。《金匮要略》记载治诸肢节疼痛，身体尪羸，脚肿如脱，头眩短气，温温欲吐，桂枝芍药知母汤主之。目前市场上在销售的风湿骨病用药如鸿茅药酒、虎力散、盘龙七、三七药酒等销售额都高达数亿元。
三七药酒为云南特色民族药，具有舒筋活络，散瘀镇痛，祛风除湿，强筋壮骨功效，用于跌打损伤，风湿骨痛，四肢麻木。其质量标准收载于卫生部部颁标准，其处方包括三七、莪术、全蝎、土鳖虫、补骨脂、淫羊藿、四块瓦、叶下花、当归、牛膝、五加皮、制川乌、苏木、大血藤、川芎、血竭、红花、乳香(醋制)、没药(醋制)、延胡索(醋制)、香附(醋制)21味药材；也记载了制法如下：以上二十一味，三七、全蝎、土鳖虫、血竭粉碎成粗粉，其余补骨脂等十七味粉碎成最粗粉，与三七等四味药粉混合，照流浸膏剂与浸膏剂项下的渗漉法(通则0189)，用50度以上白酒作溶剂，密闭浸泡15天后，缓缓渗漉，收集渗漉液8400ml，静置，滤过，即得。三七药酒组方中含有全蝎、土鳖虫、四块瓦、叶下花、制川乌等有毒药材，其质量标准仅对三七药酒的鉴别，并未进行疗效指标等的控制，这些药材通常是通过一定量的毒性成分发挥舒筋活络，散瘀镇痛，祛风除湿，强筋壮骨功效，正如我们熟知的以毒攻毒的秋水仙碱治疗类风湿性关节炎；严格的含量控制是保证药品安全有效的重要措施，活性成分含量不足可能导致临床无效，含量过高可能导致临床上的肝、肾、心脏、神经系统损伤，如此简单的工艺和质量控制标准可能为临床应用埋下安全隐患；另一方面，在生产销售使用中发现，其可能还存在沉淀、口感不佳等诸多问题。因此，对于三七药酒这类复杂组方的中成药生产工艺研究是目前的研究热点，也是亟待解决的问题。
虽然已有相关的工艺研究报道，但这些研究大多为单方提取或者多方简单的浸泡、渗漉提取，大多仅考虑三七等活性成分的提取，未涉及多种毒性药材的含量控制问题。如《三七渗漉提取工艺的研究》(谭朝阳等，中国中医药信息杂志，2010.17(4)：51-52)考察了渗漉法中乙醇浓度、乙醇用量以及渗漉速度等对三七提取的影响，结果显示，最佳渗漉提取工作：12倍药材50％乙醇，渗漉速度1-3ml/(min·kg)，三七总皂苷和三七总氨基酸含量分别可达7.801％和1.771％。但该文献采用的乙醇用量达到12倍药材量，药材浸出浓度较低，需要进一步回收乙醇；其渗漉速度缓慢，影响生产效率，不适合大生产；且其仅考察单味药材三七，对于复方制剂中多味药材的提取及含量控制并未涉及。而CN104623607A公开了一种治疗风湿病的中药组合物，它包含下列重量份的物质：三七50-90份、乳香30-60份、没药30-60份、马钱子10-20份、炮山甲20-30份、当归20-60份、川芎20-60份、川乌20-60份、草乌20-60份、土鳖虫30-90份、白芷30-90份、红花30-90份、木通15-30份、蜈蚣30-50份、全蝎10-15份、川断30-90份、乌梢蛇60-90份、地龙30-60份、青风藤30-60份、海风藤30-60份、络石藤30-60份和干姜60-90份，其制备方法为，加入4000毫升无水乙醇，在室温封闭的条件下浸渍7天，过滤，滤液即得。该专利说明书实施例公开了采用无水乙醇浸渍，过滤，滤液即得；其临床给药方法为酒剂纱布蘸取涂抹。该专利重点在于中药组合物的组方，其制备方法为常规工艺，并未对如川乌、土鳖虫、全蝎等毒性药材成分、君药三七等提取影响因素进行分析，可能存在活性成分、毒性成分含量不稳定等问题，不适合内服。
(三)发明内容：本发明的目的在于提供一种治疗风湿骨痛的内服三七药酒制备工艺，其工艺主要由酶解、凝胶柱过滤、浸泡、渗漉、澄清步骤组成，具有经济环保优势，且制得药品临床安全、有效、质量可控。
三七药酒组方及其重量比为三七50份、莪术40份、全蝎10份、土鳖虫30份、补骨脂50份、淫羊藿50份、四块瓦60份、叶下花80份、当归60份、牛膝50份、五加皮60份、制川乌20份、苏木40份、大血藤60份、川芎30份、血竭10份、红花20份、乳香(醋制)30份、没药(醋制)30份、延胡索(醋制)40份、香附(醋制)40份。
其中，三七为君药，活血化瘀而消肿定痛，为治瘀血诸证之佳品，为伤科之要药。入肝经血分，有止血不留瘀，化瘀不伤正。
臣药行气活血，散瘀镇痛：莪术味辛性烈，专攻气中之血，主破积消坚，去积聚癖块，土鳖虫活血散瘀，通经止痛。当归-川芎相须为用：当归甘温质润以补血调经，辛行温通能活血止痛；川芎辛散温通，既能活血化瘀，又能行气止痛，为“血中之气药”。苏木味辛能散，咸入血分，能活血散瘀、消肿止痛。血竭入血分而散瘀止痛，为伤科及其他瘀滞痛证要药。没药与乳香相须为用，治疗跌打损伤瘀滞疼痛。香附“乃气病之总司，女科之主帅也”，辛行苦泄，善于梳理肝气，调经止痛，为妇科调经之要药。延胡索辛散温通，为活血、行气止痛之良药，前人谓其能“行血中之气滞，气中血滞，故能专治一身上下诸痛”。诸药合用为臣，共奏行气活血，散瘀镇痛之功。
祛风除湿，舒筋活络：全蝎主入肝经，性善走窜，既平息肝风，又搜风通络，有良好的息风止痉之效，为治痉挛抽搐之要药。制川乌辛热升散苦燥，“疏利迅速，开通关腠，驱逐寒湿”，善于祛风除湿、温经散寒，有明显的止痛作用，为治风寒痹症之佳品。五加皮辛能散风，苦能燥湿，温能祛寒，且兼补益之功，为强壮性祛风湿药，尤宜于老人及久病体虚者。诸药合用为臣，共奏祛风除湿，舒筋活络之功。
补肾壮阳，强筋壮骨：补骨脂，能暖水脏(肾脏)，阴中生阳，壮火益土之要药也。淫羊藿辛温散寒，长于补肾壮阳，入肝肾强筋骨，又能祛风胜湿。诸药合用为臣，共奏补肾壮阳，强筋壮骨之功。
佐药：大血藤活血通经，祛风除湿。四块瓦祛风、除湿、活血、散瘀。叶下花行气活血、续筋接骨、除湿止痛。
使药：牛膝善引气血下注，是以用药欲其下行者，恒以之为引经。活血散瘀力较强，又能补益肝肾，强筋健骨，兼能祛风除湿。可谓一药专使而身具四功。全方以酒制药，酒性升提，与牛膝共司载诸药升降出入气血职责。
全方共计21味药，辛散温通，行中有止，润燥相合，升降有度，攻补兼施。散瘀镇痛而不伤血，祛风散湿而不伤阴，舒筋活络而不伐正，强筋壮骨而不敛邪，诸药组合，殊功至善。
本发明提供三七药酒的制备工艺具体步骤如下：
(1)、将处方量的全蝎、土鳖虫粉碎成粗粉，加入0.8～2倍体积量的30～50度白酒，再加入0.08～0.12％上述两味处方量药材的菠萝蛋白酶，水浴温度50～60℃，浸润酶解3～5h，然后上Superdex peptide柱，用1.0～2.0倍体积量的30～50度白酒洗脱，弃去洗脱液，用2.0～4.0倍体积量的30～50度白酒洗脱，收集洗脱液，备用；
(2)、将处方量的制川乌、四块瓦、叶下花、香附、川芎粉碎成粗粉，投料于渗漉装置中，加入步骤(1)制备的洗脱液，加入50～60度白酒1～2倍体积，常温密封浸泡12～36小时，然后将其余处方量药材粉粹成粗粉，投料于上述渗漉装置中，加入50～60度白酒3～7倍量，密封浸泡10～20天，并保证包材遮光；
(3)、调整渗漉3～5ml/(min·kg)，并不断加入50～60度白酒，收集渗漉液(每个处方8400ml)，静置，采用200目澄清板过滤，收集过滤液即得。
其中，步骤(1)作为溶剂的白酒为1.5倍体积量的40度白酒；作为洗脱溶剂的白酒为3.0倍体积的40度白酒；
步骤(1)菠萝蛋白酶的添加量为0.10％；
本发明提供了一种用于风湿骨病的内服三七药酒新的制备工艺，制成的药酒棕红透亮，可以长时间在常温下放置保存而不产生沉淀，且对风湿骨痛疗效显著，具体有益效果如下：
(1)、全蝎和土鳖虫都是两种有毒动物药材，目前这两个药材用于风湿骨病的报道较为罕见，本发明采用1.5倍40度白酒浸泡全蝎和土鳖虫，利用土鳖中含有的纤溶活性酶和0.10％菠萝蛋白酶分解全蝎中的BmK-βIM、BmP09、NTX、CTX等长链蝎毒蛋白，降低了这些成分对机体的肌肉抑制等作用；另一方面，该过程采用1.5倍体积量的40度白酒浸泡药材，其显著降低了浸泡溶剂的用量，有利于后续直接渗漉制成酒，减少了溶剂回收过程，降低了生产成本；
(2)、将菠萝蛋白酶酶解液上Superdex peptide柱，通过上柱去除未分解的长链蝎毒蛋白等大分子以及杂质，然后用3.0倍40度白酒洗脱，其可以有效富集分子量低于6.5KDa的成分；将制川乌、四块瓦、叶下花、香附、川芎药材用步骤(1)制备的洗脱液密封浸泡，本发明人在长期的试验研究过程中发现，上述五个药材浸泡过程中能降低制川乌、四块瓦、叶下花的毒性，尤其是通过配伍减毒作用，可以显著降低制川乌中的乌头碱含量，检测结果显示，采用上述工艺制备的三七药酒未检出乌头碱成份。大鼠长期毒性试验显示，该工艺制备的三七药酒在1.0g/kg/天的高剂量下无不良反应，大鼠连续灌胃给药6个月安全、无毒副作用。
(3)、本发明提供的制备工艺制得的三七药酒中各主要药效成分如三七皂苷、淫羊藿苷、补骨脂素及异补骨脂素等含量稳定，质量可控，其各成分转移率达到90～98％；动物实验显示，其对小鼠DNCB诱导的迟发性超敏反应具有显著的抑制作用，可以显著减轻大鼠纽扣肉芽肿、足趾肿胀情况。
本发明提供了一种安全、有效、质量可控的三七药酒制备工艺，整个制备过程仅采用不同浓度的白酒作为溶剂，而且其用量少，不需要回收，工艺经济环保，未引入其他溶剂；且所制得的三七药酒的主要药效成分明确，含量稳定，其安全、无明显毒副作用，适合长期用药。
(四)具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
实施例1：
(1)、将全蝎10g、土鳖虫30g粉碎成粗粉，加入1.5倍体积量的40度白酒，再加入0.10％上述两味处方量药材的菠萝蛋白酶，水浴温度55℃，浸润酶解4h，然后上Superdexpeptide柱，用1.5倍体积量的40度白酒洗脱，弃去洗脱液，用3.0倍体积量的40度白酒洗脱，收集洗脱液，备用；
(2)、将制川乌20g、四块瓦60g、叶下花80g、香附40g、川芎30g粉碎成粗粉，投料于渗漉装置中，加入(1)制备的洗脱液，加入55度白酒1.5倍量，常温密封浸泡24小时，然后将三七50g、莪术40g、补骨脂50g、淫羊藿50g、当归60g、苏木40g、大血藤60g、血竭10g、红花20g、乳香(醋制)30g、没药(醋制)30g、延胡索(醋制)40g、牛膝50g、五加皮60g粉粹成粗粉，投料于上述渗漉装置中，加入55度白酒5倍量，密封浸泡15天，并保证包材遮光；
(3)、调整渗漉3～5ml/(min·kg)，并不断加入55度白酒，收集渗漉液8400ml，静置(0～4℃)，采用200目澄清板过滤，收集过滤液即得。
实施例2：
(1)、将全蝎10g、土鳖虫30g粉碎成粗粉，加入0.8倍体积量的30度白酒，再加入0.08％上述两味处方量药材的菠萝蛋白酶，水浴温度50℃，浸润酶解5h，然后上Superdexpeptide柱，用2.0倍体积量的30度白酒洗脱，弃去洗脱液，用4.0倍体积量的30度白酒洗脱，收集洗脱液，备用；
(2)、将制川乌20g、四块瓦60g、叶下花80g、香附40g、川芎30g粉碎成粗粉，投料于渗漉装置中，加入(1)制备的洗脱液，加入60度白酒1倍量，常温密封浸泡12小时，然后将三七50g、莪术40g、补骨脂50g、淫羊藿50g、当归60g、苏木40g、大血藤60g、血竭10g、红花20g、乳香(醋制)30g、没药(醋制)30g、延胡索(醋制)40g、牛膝50g、五加皮60g粉粹成粗粉，投料于上述渗漉装置中，加入50度白酒7倍量，密封浸泡20天，并保证包材遮光；
(3)、调整渗漉3～5ml/(min·kg)，并不断加入60度白酒，收集渗漉液，静置(0～4℃)，采用200目澄清板过滤，收集过滤液即得。
实施例3：
(1)、将全蝎10g、土鳖虫30g粉碎成粗粉，加入1.5倍体积量的50度白酒，再加入0.12％上述两味处方量药材的菠萝蛋白酶，水浴温度60℃，浸润酶解3h，然后上Superdexpeptide柱，用1.0倍体积量的50度白酒洗脱，弃去洗脱液，用2.0倍体积量的50度白酒洗脱，收集洗脱液，备用；
(2)、将制川乌20g、四块瓦60g、叶下花80g、香附40g、川芎30g粉碎成粗粉，投料于渗漉装置中，加入(1)制备的洗脱液，加入50度白酒2倍量，常温密封浸泡36小时，然后将三七50g、莪术40g、补骨脂50g、淫羊藿50g、当归60g、苏木40g、大血藤60g、血竭10g、红花20g、乳香(醋制)30g、没药(醋制)30g、延胡索(醋制)40g、牛膝50g、五加皮60g粉粹成粗粉，投料于上述渗漉装置中，加入50度白酒3倍量，密封浸泡10天，并保证包材遮光；
(3)、调整渗漉3～5ml/(min·kg)，并不断加入50度白酒，收集渗漉液，静置(0～4℃)，采用200目澄清板过滤，收集过滤液即得。
实施例4：含量检测方法
三七皂苷含量测定方法
人参皂苷Rg1照高效液相色谱法(中国药典2015年版通则0512)测定。
色谱条件与系统适应性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，水为流动相B；按下表中的规定进行梯度洗脱；流速每分钟为1.5ml；检测波长为203nm，柱温25℃。理论板数按人参皂苷Rg1峰计算应不低于6000。
对照品溶液的制备取人参皂苷Rg1对照品适量，精密称定，加50％乙醇制成每1ml含0.3mg的溶液，即得。
供试品溶液的制备精密量取本品10ml，加在D900大孔阴离子脱色树脂层析柱(d＝1.2～1.5cm，V＝20cm3)，加50％乙醇60ml洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至干，残渣加水15ml，加二氯甲烷振摇提取2次，每次15ml，弃去二氯甲烷液，水液减压浓缩至干，加50％乙醇溶解并转移至10ml量瓶中，加50％乙醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
测得实施例1制备的三七药酒每1ml含三七以人参皂苷Rg1(C42H72O14)计为0.20mg。
淫羊藿苷含量测定方法
淫羊藿苷照高效液相色谱法(中国药典2015年版通则0512)测定。
色谱条件与系统适应性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，水为流动相B；按下表中的规定进行梯度洗脱；流速每分钟为1.0ml；检测波长为270nm，柱温25℃。理论板数按淫羊藿苷峰计算应不低于1500。
对照品溶液的制备取淫羊藿苷对照品适量，精密称定，加50％乙醇制成每1ml含0.1mg的溶液，即得。
供试品溶液的制备精密量取本品10ml，加在D900大孔阴离子脱色树脂层析柱(d＝1.2～1.5cm，V＝20cm3)，加50％乙醇60ml洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至干，残渣加乙酸乙酯25ml，超声提取30分钟，滤过，残渣加乙酸乙酯25ml，继续超声30分钟，合并提取液，浓缩至干，残渣加50％乙醇溶解并转移至10ml量瓶中，稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注人液相色谱仪，测定，即得。
测得实施例1制备的三七药酒每1ml含淫羊藿以淫羊藿苷(C33H40O15)32.22计为μg。
补骨脂素、异补骨脂素的含量测定方法
补骨脂素、异补骨脂素照高效液相色谱法(中国药典2015年版通则0512)测定。
色谱条件与系统适应性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A，水为流动相B；按下表中的规定进行梯度洗脱；流速每分钟为1.0ml；检测波长为245nm，柱温25℃。理论板数按补骨脂素峰计算应不低于2000。
对照品溶液的制备取补骨脂素、异补骨脂素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml各含20μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备精密量取本品10ml，加在D900大孔阴离子脱色树脂层析柱(d＝1.2～1.5cm，V＝20cm3)，加50％乙醇60ml洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至干，残渣加二氯甲烷25ml，超声提取30分钟，滤过，残渣加二氯甲烷25ml，继续超声30分钟，合并提取液，浓缩至干，加50％乙醇溶解并转移至10ml量瓶中，加50％乙醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注人液相色谱仪，测定，即得。
测得实施例1制备的三七药酒每1ml含补骨脂以补骨脂素(C11H6O3)和异补骨脂素(C11H6O3)计为60.54μg。
SDS-PAGE长链蝎毒蛋白的检查
样品处理及加样：精密取全蝎、土鳖虫提取液适量，冻干，再取适量标准分子蛋白质，加5X SDS-PAGE加样缓冲液稀释5倍，混匀，煮沸2-5min，取出冷却，将样品加5X SDS-PAGE加样缓冲液转移至Eppendorf管中混合，盖上盖子，在100℃沸水浴中加热2-5min，离心(15000xg)15min。用微量注射器取蛋白Marker、样品溶液各5μl缓慢加至样品孔底部。
电泳：将电机插头于是当的电极相接，置入冷柜中，将电压调至200V，电流10mA，待样品进入分离凝胶后，将电压调至300V，电流调至30mA，当溴甲酚蓝染料的前沿迁移至距凝胶的底部1cm时，停止电泳。从电泳槽中取出凝胶玻璃板，轻轻撬开，除去弄塑胶，用去离子水清洗凝胶，取出胶上的电极缓冲液。
染色和脱色：戴上手套将凝胶移入一个盛有少量考马斯亮蓝的大培养皿中，盖上盖子，在摇床上慢振荡染色(频率：40～60Hz，时间2-3h)，弃去染液，将凝胶在水中漂洗数次，加入脱色液，过夜脱色。
结果显示，实施例1制备的三七药酒样品分子量小于6.5kDa。
双酯型乌头碱含量测定方法
双酯型乌头碱照高效液相色谱法(中国药典2015年版通则0512)测定。
色谱条件与系统适应性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-四氢呋喃(25:15)为流动相A，0.1mol/L醋酸铵(每1000ml加冰醋酸0.5ml)为流动相B；按下表中的规定进行梯度洗脱；流速每分钟为1.0ml；检测波长为225nm，柱温25℃。理论板数按乌头碱峰计算应不低于2000。
对照品溶液的制备取乌头碱对照品适量，精密称定，加流动相A-流动相B(15:85)制成每1ml含50mg的溶液，即得。
供试品溶液的制备精密量取本品50～100ml，加在D900大孔阴离子脱色树脂层析柱(d＝1.2～1.5cm，V＝20cm3)，加50％乙醇60ml洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至干，残渣精密加流动相A-流动相B(15:85)2ml，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注人液相色谱仪，测定，即得。
结果显示实施例1制备的三七药酒未检出乌头碱(C34H47NO11)。
实施例5：风湿骨病动物实验
实验材料：
KM小鼠18～22g，
SD大鼠，体重180～220g，
本发明所用三七药酒为实施例1所制备(人参皂苷Rg1含量0.20mg/ml，淫羊藿苷含量32.22μg/ml，补骨脂素及异补骨脂素含量60.54μg/ml，未检出乌头碱，蝎毒多肽分子量小于6.5kDa)；
阳性药为云南希陶绿色药业股份有限公司提供的三七药酒(根据实施例4检测，人参皂苷Rg1含量0.15mg/ml，淫羊藿苷含量30.61μg/ml，补骨脂素及异补骨脂素含量62.76μg/ml，乌头碱含量为1.25μg/ml，蝎毒多肽分子量小于20.1kDa)。
给药前，将本品置40～50℃减压浓缩至相应的浓度。
(1)小鼠溶血素实验
取KM小鼠50只，雌雄各半，体重18～22g，随机分为5组，即正常对照组，阳性药组，三七药酒低、中、高剂量组，每组10只。各给药组小鼠分别灌胃灌胃给予相应药物，正常对照组灌胃给予等浓度白酒，灌胃容积均为10ml/kg，每日一次，共10d。给药第3天，对每只小鼠用20％绵羊红细胞(SRBC)腹腔注射0.2ml致敏，末次灌胃给药后24h，从小鼠眼眶取血0.5ml，常规分离血清。于96孔微量血凝板上将血清做倍比稀释，每孔50μl，再于每孔加入50μl1％SRBC，混匀，至37℃烘箱中3h，观察红细胞凝集程度，计算各组小鼠血清抗体积数。
再取KM小鼠60只，操作同上，在致敏后的第4天和第6天每只小鼠腹腔注射环磷酰胺(CTX)30mg/kg(正常对照组小鼠除外)。计算各组小鼠的血清抗体积数。
抗体积数＝(S1+2S2+3S3+……+nSn)，式中1,2,3，……，n代表倍比稀释的指数，S表示凝集程度的级别，抗体积数越大表示血清中抗体水平越高。
0级为红细胞全部下沉，集中在孔底形成圆点状，四周液体清晰；
Ⅰ级为红细胞大部分下沉在孔底成圆点状，四周有少量聚集的红细胞；
Ⅱ级为凝集的红细胞在孔底形成薄层，中心可以明显见到1个疏松的红点；
Ⅲ级为凝集的红细胞均匀地铺散在孔底形成一薄层，中心隐约可见1个小红点；
Ⅳ级为凝集的红细胞均匀地铺散在孔底形成一薄层，凝块有时呈卷折状。
表1三七药酒对小鼠血清溶血素的影响(X±s，n＝10)
注：与正常对照组相比，△P＜0.05，▲P＜0.01。
对于免疫正常的小鼠，各剂量三七药酒均可降低小鼠血清抗体积数，其中中、高剂量组小鼠血清抗体积数显著低于正常对照组(P＜0.05或P＜0.01)，其表现出来一定体液免疫抑制作用。但是，当预先腹腔注射CTX导致小鼠免疫功能低下时，各剂量组的三七药酒又具有一定的升高血清溶血素作用，其中中、高剂量组小鼠血清抗体显著高于正常对照组(P＜0.01)，表明其对免疫低下小鼠具有一定的体液免疫增强作用。
(2)小鼠迟发性超敏(DTH)反应试验
取KM小鼠50只，体重18～22g，雌雄各半，随机分为5组，即模型组，阳性药组，三七药酒低、中、高剂量组，每组10只。各组分别用7％的二硝基氯苯(DNCB)丙酮溶液0.02ml/只背部皮下注射致敏。各组分别按20ml/kg每日灌胃给相应受试药物1次，连续10天。末次灌胃给药后30min，小鼠右耳涂以1％DNCB麻油溶液0.3ml激发。24h后处死动物，剪下左右两耳，用打孔器(直径9mm)分别在同一部位取下元二片，电子天平称重，计算小鼠耳廓肿胀度(小鼠右耳廓重与左耳廓重的差值)，并计算肿胀百分率(肿胀度/左耳重)。再取KM小鼠50只，操作同上，在致敏期间并不给药，仅在激发后1h和13h灌胃给药2次，计算小鼠耳廓肿胀度，并计算肿胀百分率。
表2三七药酒对小鼠迟发性超敏反应的影响(X±s，n＝10)
注：与模型组相比，△P＜0.05，▲P＜0.01；与阳性药组相比，□P＜0.05，■P＜0.01
致敏后给药，三七药酒对DNCB诱导的迟发性超敏反应具有显著的抑制作用，与模型组相比具有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)，在激发后给药，三七药酒各剂量组能够在一定程度上对抗由DNCB诱导的迟发性超敏反应。
(3)大鼠纽扣肉芽肿试验
取雄性SD大鼠50只，体重180～220g，随机分为5组，即模型组，阳性药组，三七药酒低、中、高剂量组，每组10只，以4％戊巴比妥(40mg/kg)麻醉，仰卧位固定大鼠，腹部去毛，用碘酒和酒精消毒后，腹部正中切开，向两侧腹股沟处，缝合切口。切口常规消毒，整个手术过程注意无菌操作。除模型组外，其余各组大鼠分别灌胃给予受试药物，每日1次，共10天。于末次给药后24h，处死大鼠，取出肉芽组织，称取肉芽组织的湿重；然后将肉芽组织放入80℃烘箱中烘24h，取出，称取肉芽组织干重。比较各组间差异，并计算抑制率。
抑制率(％)＝(对照组肉芽干重-给药组肉芽干重)/对照组肉芽干重*100％
三七药酒中、高剂量组均可降低肉芽组织干重，与模型组相比具有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。
表3三七药酒对纽扣肉芽肿的影响(X±s，n＝10)
注：与模型组相比，△P＜0.05，▲P＜0.01
(4)足趾肿胀试验
取雄性SD大鼠50只，体重180～220g，随机分为5组，即模型组、阳性药组、三七药酒低、中、高剂量组，每组10只。除模型组外，其余各组大鼠分别灌胃给予相应受试药物，每日1次，共5天。末次给药1h后，将大鼠后肢拉直，用26号针头自足趾中部皮下向上注入一部分致炎剂(0.1％角叉菜胶0.1ml)，然后调转针头项下注射完，分别于注射致炎剂前及注射后1，2，4，6h时用测厚仪测定大鼠足趾的厚度，比较各组间的差异。
三七药酒对角叉菜胶诱发的大鼠足趾肿胀具有较强的抑制作用。
表4三七药酒对足趾肿胀的影响(mm，X±s，n＝10)
注：与模型组相比，△P＜0.05，▲P＜0.01；与阳性药组相比，□P＜0.05，■＜0.01
实施例6：长期毒性
实验材料：SD大鼠80～100g，本发明所用三七药酒为实施例1所制备，人参皂苷Rg1含量0.20mg/ml，淫羊藿苷含量32.22μg/ml，补骨脂素及异补骨脂素含量60.54μg/ml，未检出乌头碱，蝎毒多肽分子量小于6.5kDa。阳性药(为云南希陶绿色药业股份有限公司提供的三七药酒，根据实施例4检测结果，人参皂苷Rg1含量0.15mg/ml，淫羊藿苷含量30.61μg/ml，补骨脂素及异补骨脂素含量62.76μg/ml，乌头碱含量为1.25μg/ml，蝎毒多肽分子量小于20.1kDa。
给药前，将本品至40～50℃减压浓缩至相应的浓度。
取大鼠150只，随即分为5组，每组大鼠30只，雌雄各半，空白对照组灌胃给等浓度白酒10ml/kg/天，三七药酒低、中、高剂量组分别灌胃给予按生药量计算含药0.1g/kg/天，0.6g/kg/天，1.0g/kg/天。每天观察期行为表现，粪便性状及其他症状体征。每周测体重一次，根据体重变化调整药量。
给药3个月、6个月及停药4周后，每次、每批大鼠麻醉(戊巴比妥钠80～100mg/kg)10只，雌雄各半，腹部主动脉取血，放血致死。进行血常规检查，包括红细胞计数(RBC)、白细胞计数(WBC)、血小板计数(PLT)、血红蛋白(Hgb)，血生化检查，包括碱性磷酸酶(ALP)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)，解剖取出心、肝、脾、肺、肾，并进行病理学检查。
三七药酒各剂量组给药大鼠3个月、6个月及恢复期后，各组生命体征及血液学、主要脏器和足趾均无病理改变，说明三七药酒各剂量均不影响大鼠骨髓造血功能，对肝肾功能均无损害。未发现明显毒性靶器官。本实验表明，三七药酒在1.0g/kg/天的高剂量下无不良反应，大鼠连续服用6个月安全，可以为临床试验提供参考依据。
表5给药3个月后SD大鼠血液生化指标结果
注：与对照组相比，△P＜0.05，▲P＜0.01.
表6给药6个月后SD大鼠血液生化指标结果
注：与对照组相比，△P＜0.05，▲P＜0.01.
表7恢复期后SD大鼠血液生化指标结果
注：与对照组相比，△P＜0.05，▲P＜0.01。

Claims (3)

1.一种用于风湿骨病的内服三七药酒的制备工艺，所述三七药酒的处方组成及重量比为三七50份、莪术40份、全蝎10份、土鳖虫30份、补骨脂50份、淫羊藿50份、四块瓦60份、叶下花80份、当归60份、牛膝50份、五加皮60份、制川乌20份、苏木40份、大血藤60份、川芎30份、血竭10份、红花20份、乳香(醋制)30份、没药(醋制)30份、延胡索(醋制)40份、香附(醋制)40份，其特征在于，由以下步骤组成：
(1)、将处方量的全蝎、土鳖虫粉碎成粗粉，加入0.8～2倍体积量的30～50度白酒，再加入0.08～0.12％上述两味处方量药材的菠萝蛋白酶，水浴温度50～60℃，浸润酶解3～5h，然后上Superdex peptide柱，用1～2倍体积量的30～50度白酒洗脱，弃去洗脱液，用2～4倍体积量的30～50度白酒洗脱，收集洗脱液，备用；
(2)、将处方量的制川乌、四块瓦、叶下花、香附、川芎粉碎成粗粉，投料于渗漉装置中，加入步骤(1)制备的洗脱液，加入50～60度白酒1～2倍体积，常温密封浸泡12～36小时，然后将其余处方量药材粉粹成粗粉，投料于上述渗漉装置中，加入50～60度白酒3～7倍量，密封浸泡10～20天，并保证包材遮光；
(3)、调整渗漉3～5ml/(min·kg)，并不断加入50～60度白酒，收集渗漉液(每个处方8400ml)，静置，采用200目澄清板过滤，收集过滤液即得。
2.根据权利要求1所述的一种用于风湿骨病的内服三七药酒的制备工艺，其特征在于，步骤(1)作为溶剂的白酒为1.5倍体积量的40度白酒；作为洗脱溶剂的白酒为3倍体积的40度白酒。
3.根据权利要求1所述的一种用于风湿骨病的内服三七药酒的制备工艺，其特征在于，步骤(1)菠萝蛋白酶的添加量为0.10％。
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