CN103800389B - 一种Sarcodon leucopus中降糖活性成分及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明的目的是提供一种Sarcodon？leucopus中降糖活性成分及其制备方法与应用。该方法包括如下步骤：1）将Sarcodon？leucopus子实体干燥粉碎，加入有机溶剂，20-25℃浸泡3-5h，过滤取滤液；2）重复步骤1）4-6次，合并滤液，于36-40℃减压浓缩，真空干燥获得有机溶剂提取物；3）用20%乙醇溶解有机溶剂提取物，得到样品溶液；4）将所述样品溶液进行大孔吸附树脂层析，先用20%乙醇洗脱6个柱保留体积，再用85%乙醇洗脱6个柱保留体积；收集合并85%乙醇的洗脱液，获得降糖有效部位。实验证明，本发明所提供的降糖活性成分具有很强的抑制α-葡萄糖苷酶的活性，且可明显降低Ⅱ型糖尿病模型大鼠的血糖值；由于来源于食用真菌，具有一定的安全基础。本发明具有潜在巨大的社会效益和经济效益。

Description

一种Sarcodon leucopus中降糖活性成分及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种Sarcodonleucopus中降糖活性成分及其制备方法与应用。

背景技术

糖尿病是人体内胰岛素缺乏或者相对缺乏而引起的一种临床常见病，同时会导致一系列并发性疾病的发生，尤其是导致眼、心、血管、肾、神经损害或器官功能衰竭，比如心血管疾病、高血压等。世界卫生组织(WHO)将糖尿病主要分为两种：I型糖尿病(或称胰岛素依赖型，IDDM)和II型糖尿病(或称非胰岛素依赖型，NIDDM)。其中II型糖尿病占了大多数，我国糖尿病患者已达2000万以上，其中90％以上为II型糖尿病，并且出现多发性、年轻化的特点，严重威胁国民健康。

α-葡萄糖苷酶在小肠内将蔗糖等寡糖水解形成葡萄糖，葡萄糖经小肠吸收进入血液，是餐后血糖升高的主要原因。餐后高血糖过高可引起机体对胰岛素的敏感性降低从而加剧II型糖尿病患者病情。因而α-葡萄糖苷酶抑制剂将显著提高对糖尿病的控制。目前市场上使用的α-葡萄糖苷酶抑制剂类药物主要为阿卡波糖、伏格列波糖、米格列醇等，但是值得注意的是，目前使用的这些抑制剂都带来了不同程度上的毒副作用，如胃肠道副作用、荨麻疹、肝功能障碍、心脏系统风险等。因此，积极发展更安全、更强效的α-葡萄糖苷酶抑制剂是必要和紧迫的。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种制备Sarcodonlecucopus中降血糖活性成分的方法。

本发明所提供的制备Sarcodonlecucopus中降血糖活性成分的方法，具体可包括如下步骤：

（1）将Sarcodonleucopus子实体干燥粉碎后，加入有机溶剂，配比为0.1-1g（干重）的所述子实体：10ml所述有机溶剂，20-25℃（如20℃或25℃）浸泡提取3-5h，过滤后取滤液；

（2）重复步骤（1）4-6次，每次所述有机溶剂均加入到前一次过滤所得滤渣中，合并每次过滤所得滤液，于36-40℃（如36-38℃或38-40℃，具体如36℃、38℃或40℃）减压浓缩，真空干燥获得有机溶剂提取物；

（3）用体积分数为20%的乙醇水溶液溶解步骤（2）所得的有机溶剂提取物，得到样品溶液；所述有机溶剂提取物和所述体积分数为20%的乙醇水溶液的配比为1g-1.5g：50mL；

（4）将步骤（3）所得样品溶液上样到装有大孔吸附树脂的树脂柱中，先用体积分数为20%的乙醇水溶液洗脱6个柱保留体积，再用体积分数为85%的乙醇水溶液洗脱6个柱保留体积，所述吸附和所述洗脱的流速均为1.5-2.5个（具体如1.5个）柱保留体积每小时；收集合并用体积分数为85%的乙醇水溶液洗脱所得的洗脱液，于36-40℃（如38℃）减压浓缩，真空干燥，获得Sarcodonleucopus的降血糖活性成分。

在所述方法的步骤（4）中，所述将步骤（3）所得样品溶液上样到装有大孔吸附树脂的树脂柱中，需反复吸附4-6次。

在所述方法的步骤（4）中，在上样吸附后还包括用蒸馏水洗涤的步骤。所述洗涤的流速为1.5-2.5个（如1.5个）柱保留体积每小时，体积为1000毫升。

上述所获得的Sarcodonleucopus的降血糖活性成分经高效液相色谱分析后表明主要含有如下式（1）、式（2）、式（3）所示的化合物及其衍生物。

本发明的另一个目的是提供一种制备Sarcodonleucopus降血糖有机溶剂提取物的方法。

本发明所提供的制备Sarcodonleucopus降血糖有机溶剂提取物的方法，具体可包括如下步骤：

（1）将Sarcodonleucopus子实体干燥粉碎后，加入有机溶剂，配比为0.1-1g（干重）的所述子实体：10ml所述有机溶剂，20-25℃（如20℃或25℃）浸泡提取3-5h，过滤后取滤液；

（2）重复步骤（1）4-6次，每次所述有机溶剂均加入到前一次过滤所得滤渣中，合并每次过滤所得滤液，于36-40℃（如36-38℃或38-40℃，具体如36℃、38℃或40℃）减压浓缩，真空干燥获得Sarcodonleucopus降血糖有机溶剂提取物。

在以上两种方法的步骤（1）中，所述子实体和所述有机溶剂的配比具体可为1g干重的所述子实体：10ml所述有机溶剂。所述浸泡提取的过程中包括搅拌的步骤。

在以上两种方法中，所述有机溶剂均可为如下中的任一种：

（a1）单一溶剂：乙醇、甲醇、乙酸乙酯、正丁醇或丙酮。

（a2）混合溶剂1：由（a1）的单一溶剂中的两种或多种混合而成的溶剂；

（a3）混合溶剂2：由（a1）的单一溶剂与水任意比例混合而成的溶剂，或由（a2）的混合溶剂1与水任意比例混合而成的溶剂。

具体而言，在本发明中，所述有机溶剂可为如下中任一种：

（b1）无水乙醇；

（b2）体积比为1:1的甲醇和水的混合液；

（b3）体积比为4:1的乙醇和水的混合液；

（b4）体积比为1:1的丙酮和正丁醇的混合液；

（b5）乙酸乙酯。

其中，以无水乙醇的提取效果最佳。

在制备Sarcodonleucopus降血糖活性成分的方法中，所述大孔吸附树脂可为非极性大孔吸附树脂、中等极性大孔吸附树脂或极性大孔吸附树脂。

在本发明的一个实施例中，所述大孔吸附树脂具体为D101型非极性大孔吸附树脂。所述树脂柱的径高比具体为1:10，所述树脂柱的总体积为1500毫升。所述径高比为树脂柱内直径与树脂柱高的比。

利用本发明所提供的制备Sarcodonleucopus降血糖活性成分的方法制备得到的Sarcodonleucopus降血糖活性成分也属于本发明的保护范围。

利用本发明所提供的制备Sarcodonleucopus降血糖有机溶剂提取物的方法制备得到的Sarcodonleucopus降血糖有机溶剂提取物也属于本发明的保护范围。

所述Sarcodonleucopus降血糖活性成分，或所述Sarcodonleucopus降血糖有机溶剂提取物，或所述Sarcodonleucopus子实体在如下（A1）-（A4）任一种的应用也属于本发明的保护范围：

（A1）作为α-葡萄糖苷酶抑制剂；

（A2）制备治疗和/或预防II型糖尿病的药物；

（A3）制备抑制α-葡萄糖苷酶的药物；

（A4）制备具有降糖作用的食品或功能保健品。

本发明的再一个目的是提供一种治疗和/或预防II型糖尿病的药物。

本发明所提供的治疗和/或预防II型糖尿病的药物，其活性成分为所述Sarcodonleucopus降血糖活性成分，或所述Sarcodonleucopus降血糖有机溶剂提取物，或所述Sarcodonleucopus子实体。

本发明的还一个目的是提供一种抑制α-葡萄糖苷酶的药物

本发明所提供的抑制α-葡萄糖苷酶的药物，其活性成分为所述Sarcodonleucopus降血糖活性成分，或所述Sarcodonleucopus降血糖有机溶剂提取物，或所述Sarcodonleucopus子实体。

本发明的又一个目的是提供一种具有降糖作用的食品或功能保健品。

本发明所提供的具有降糖作用的食品或功能保健品，其活性成分为所述Sarcodonleucopus降血糖活性成分，或所述Sarcodonleucopus降血糖有机溶剂提取物，或所述Sarcodonleucopus子实体。

以上所有的所述药物均可为片剂、粉剂、胶囊、口服液、乳剂、膏剂、霜剂、注射剂、混悬剂、酊剂、颗粒剂或气雾剂。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

在本发明中，以上所有的所述治疗和/或预防II型糖尿病具体体现在：降低Ⅱ型糖尿病模型大鼠的空腹血糖值。

实验证明，本发明所提供的Sarcodonleucopus降血糖活性成分和Sarcodonleucopus降血糖有机溶剂提取物表现出很强的抑制α-葡萄糖苷酶的活性。通过测定其对α-葡萄糖苷酶半数抑制浓度（IC₅₀值）显示：Sarcodonleucopus降血糖活性成分抑制α-葡萄糖苷酶的强度明显强于阳性对照药物阿卡波糖；Sarcodonleucopus降血糖有机溶剂提取物抑制α-葡萄糖苷酶的强度也强于阳性对照药物阿卡波糖。另外，在动物实验中，Sarcodonleucopus降血糖活性成分和Sarcodonleucopus降血糖有机溶剂提取物都可明显降低Ⅱ型糖尿病模型大鼠的血糖值。同时Sarcodonleucopus降血糖活性成分制备仅“吸附-解吸”一步法，有效成分的损失少，还可完全采用乙醇操作，投资成本较低且易于工业化扩大生产，具有潜在巨大的社会效益和经济效益。另外，Sarcodonleucopus降血糖活性成分和Sarcodonleucopus降血糖有机溶剂提取物均源于自被大众广泛食用的真菌，其安全性具有初步的保障。总之，本发明为开发治疗和/或预防II型糖尿病的创新药物、开发抑制α-葡萄糖苷酶的创新型降糖药物，以及开发具有上述功能的食品、功能保健品等提供了新的物质基础，具有潜在巨大的社会效益和经济效益。

附图说明

图1为本发明Sarcodonleucopus的降血糖活性的活性成分的高效液相色谱分析结果，紫外检测波长为254纳米。其中，A、B和C分别为式（1）、式（2）和式（3）单体化合物样品；D为活性成分样品。保留时间在11.9分钟的吸收峰（图中峰1）为式（1）化合物；保留时间在12.4分钟的吸收峰（图中峰2）为式（2）化合物；保留时间在28.6分钟的吸收峰（图中峰3）为式（3）化合物。图中不同样品的同一物质保留时间误差均在可接受范围内。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

α-葡萄糖苷酶：购买自Sigma公司（货号为G5003）；4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷：购买自百灵威科技有限公司（货号为270305）；链脲霉素：购买自百灵威科技有限公司（货号为M02540）。wistar雄性大鼠（SPF级）：北京维通利华实验动物技术有限公司提供。

Sarcodonleucopus：记载于“CorradGeraci,PlacidoNeri,CinziaPaterno,etal.AnUnusualNitrogenousTerphenylDerivativefromFruitingBodiesoftheBasidiomyceteSarcodonleucopus.J.Nat.Prod.2000,63,347-351”一文，公众可从中国科学院微生物研究所获得。

实施例1、Sarcodonleucopus降血糖活性成分的制备与分析

一、有机溶剂（乙醇）提取物的获取

取新鲜的Sarcodonleucopus子实体，干燥粉碎后称取200克，再用2升无水乙醇浸泡，室温（25℃）搅拌3h后，过滤收集滤液。重复上述无水乙醇浸泡-搅拌-过滤的操作4次（每次的无水乙醇加入到前一次过滤所得滤渣中）后合并滤液，于38℃减压浓缩，然后用真空干燥箱干燥获得乙醇提取物14.1克。

二、Sarcodonleucopus降血糖活性成分的制备

使用体积分数为20%的乙醇水溶液500毫升溶解上述的乙醇提取物，将所得溶液通入大孔吸附树脂柱（D101型大孔吸附树脂）中，柱总体积为1500毫升，径高比为1:10，反复吸附4次，使用1000毫升蒸馏水洗涤，用6倍柱保留体积的体积分数为20%的乙醇水溶液解吸，再用6倍柱保留体积的体积分数为85%的乙醇水溶液解吸。吸附、洗涤和解吸时的流速均为1.5个柱保留体积每小时。将体积分数为85%的乙醇水溶液解吸获得的解吸液混合，于38℃（请核实）减压浓缩，然后用真空干燥箱干燥，即获得Sarcodonleucopus降血糖活性成分3.86克。

三、活性成分所含主要物质的分离与分析

（1）取上述Sarcodonleucopus降血糖活性成分2克，用甲醇溶解，5000rpm离心5min，收集上清液，将上清液与400mgODS反向硅胶（YMC*GEL，12nm，S-50um）混合，在40℃水浴锅中蒸干有机溶剂，然后添加至中低压色谱柱（Φ3.0×45cm，已填充有50g反相ODS硅胶，YMC*GEL,12nm,S-50um）中，然后采用甲醇-水作为流动相进行梯度洗脱（梯度洗脱过程中，依次采用体积比为20:80、30:70、40:60、50:50、60:40、85:15和0:1的甲醇-水；每个梯度的洗脱体积为300毫升）。收集采用30：70的甲醇-水作为流动相的后200ml洗脱液（溶液甲），将溶液甲减压浓缩蒸干，得到干物质甲（0.53g）；收集采用60：40的甲醇-水作为流动相的后200ml洗脱液（溶液乙），将溶液乙减压浓缩蒸干，得到干物质乙（1.05g）。

（2）将0.53g干物质甲，用甲醇溶解，5000rpm离心5min，收集上清液，将上清液上样于凝胶柱sephadexLH-20（Φ2.0×60cm，sephadexLH-20，Merck公司），然后采用甲醇作为流动相进行洗脱，收集第100毫升至第150毫升的洗脱液（溶液丙）；收集第180毫升至第210毫升的洗脱液（溶液丁）。将溶液丙减压浓缩蒸干，得到干物质丙（132mg），即式（1）所示化合物，其波谱数据如下所示：

式（1）

HRTOFMS(正离子模式)m/z:[M+H]⁺341.0661(calcd.forC₁₈H₁₃O₇,341.0656);其分子式为C₁₈H₁₂O₇。¹H-NMR(500MHz，甲醇-d₄):δ7.34(2H,d,J=8.3Hz,H-2”，H-6”)，δ6.98(1H,s,H-2)，δ6.83(4H,m,H-5，H-6，H-3”,H-5”)。¹³C-NMR(125MHz，二甲基亚砜-d₆):δ168.1(C-2’，C-3’,C-5’,C-6’),δ156.7(C-4”),δ144.9(C-4),δ144.2(C-3),δ131.7(C-2”,C-6”),δ121.9(C-2),δ121.4(C-5),δ121.0(C-6),δ118.0(C-4’),δ115.5(C-1),δ115.3(C-1’),δ114.8(C-1”),δ114.4(C-3”,C-5”)。

将溶液丁减压浓缩蒸干，得到干物质丁（202mg），即式（2）所示化合物，其波谱数据如下所示：

式（2）

HRTOFMS(正离子模式)m/z:[M+H]⁺427.1026(calcd.forC₂₂H₁₉O₉,427.1024);其分子式为C₂₂H₁₈O₉。¹H-NMR(500MHz，甲醇-d₄):δ7.18(2H,d,J=8.4Hz,H-2”，H-6”)，δ6.84(2H,d,J=8.4Hz,H-5，H-3”,H-5”)，δ6.81(1H,dd,J=8.4Hz,2.0Hz,H-2),δ6.71(1H,dd,J=8.4Hz,2.0Hz,H-6),δ1.93(3H,s,H-3’-OAc),δ1.91(3H,s,H-2’-OAc)。¹³C-NMR(125MHz，二甲基亚砜-d₆):δ169.8(C-3’CO),δ169.7(C-2’CO),δ156.8(C-4”),δ144.9(C-3),δ144.8(C-4),δ140.7(C-3’),δ140.6(C-2’),δ133.8(C-6’),δ133.7(C-5’),δ131.6(C-2”,C-6”),δ123.9(C-1),δ123.6(C-1”),δ122.3(C-6,C-1’,C-4’),δ117.4(C-2),δ115.5(C-5,C-3’’,C-5’’),δ20.2(C-2’COCH₃,C-3’COCH₃)。

（3）将1.05g干物质乙，用70%甲醇-水（甲醇和水的体积比为70:30）溶解，5000rpm离心5min，收集上清液，将上清液上样于凝胶柱sephadexLH-20（Φ2.0×60cm，sephadexLH-20，Merck公司），然后采用70%甲醇-水作为流动相进行洗脱，收集第100毫升至第160毫升的洗脱液（溶液戊）将溶液戊减压浓缩蒸干，得到干物质戊（263mg），即式（3）所示化合物，其波谱数据如下所示：

式（3）

HRTOFMS(正离子模式)m/z:[M+H]⁺681.2295(calcd.forC₃₄H₃₇N₂O₁₃,681.2290);其分子式为C₃₄H₃₆N₂O₁₃。¹H-NMR(500MHz，氯仿-d₁):δ7.18(2H,d,J=7.3Hz,H-2”，H-6”)，δ7.13(1H,d,J=8.0Hz,H-5)，δ7.12(1H,s,H-2),δ7.03(1H,d,J=8.3Hz,H-6),δ6.82(2H,d,J=7.3Hz,H-3”，H-4”),δ2.50(2H,m,H-4α,H-4β),δ2.00(3H,s,H-3’-OAc),δ1.99(3H,s,H-2’-OAc),δ1.89(1H,m,H-5β),δ1.62(1H,m,H-5α),δ1.42(1H,m,H-5α),δ1.39(1H,m,H-5β),δ1.35(3H,d,J=5.0Hz,H-7β),δ1.09(3H,d,J=5.0Hz,H-7α),δ1.04(3H,t,J=7.0Hz,H-6β),δ0.91(3H,t,J=7.0Hz,H-6α)。¹³C-NMR(125MHz，氯仿-d₁):δ170.0(C-3’CO),δ169.7(C-2’CO),δ166.5(C-2α),δ160.0(C-3β),δ158.3(C-3α),δ156.3(C-4”),δ141.0(C-3),δ140.9(C-4),δ140.2(C-2’),δ139.9(C-3’),δ133.6(C-6’,C-5’),δ131.2(C-2”,C-6”),δ128.8(C-1),δ125.5(C-6),δ122.6(C-1’,C-1”),δ120.8(C-4’),δ119.5(C-2),δ116.8(C-5),δ115.8(C-3”,C-5”),δ90.9(C-2β),δ41.9(C-4β),δ37.8(C-4α),δ26.0(C-5α),δ23.1(C-5β),δ20.1(C-2’COCH₃,C-3’COCH₃),δ17.1(C-7α),δ13.9(C-7β),δ12.4(C-6β),δ11.4(C-6α)。

降糖活性活性成分的高效液相色谱分析：

HPLC条件如下：色谱柱：CosmosilODS-C₁₈柱（250mm×4.6mm，5μm）；柱温：25℃；检测器：DAD检测器；流动相：乙腈为流动相A，体积百分含量为0.01%的三氟乙酸水溶液为流动相B，采用梯度洗脱方式：从0-10min，流动相A的体积百分含量由10%线性提高至40%，流动相B的体积百分含量由90%线性降低至60%；从10-18min，流动相A的体积百分含量由40%线性提高至50%，流动相B的体积百分含量由60%线性降低至50%；从18-35min，流动相A的体积百分含量由50%线性提高至55%，流动相B的体积百分含量由50%线性降低至45%；从35-45min，流动相A的体积百分含量由55%线性提高至100%，流动相B的体积百分含量由45%线性降低至0%；从45-55min，流动相A的体积百分含量维持在100%，流动相B的体积百分含量维持在0%；流速：1.0mL/min。

使用安捷伦1200高效液相分析结果如图1所示，根据图1可知Sarcodonleucopus降血糖活性成分主要含有式（1）、式（2）、式（3）所示的化合物及其衍生物。

实施例2、Sarcodonleucopus降血糖有机溶剂（50%甲醇-水）提取物的获取

取新鲜的Sarcodonleucopus子实体，干燥粉碎后称取50克，再用500毫升体积分数为50%甲醇-水溶液（体积比为50:50的甲醇和水的混合液）浸泡，室温（20℃）搅拌5h后，过滤收集滤液。重复上述50%甲醇水浸泡-搅拌-过滤的操作6次（每次的无水乙醇加入到前一次过滤所得滤渣中）后合并滤液，于40℃减压浓缩，然后用真空干燥箱干燥获得50%甲醇-水提取物3.3克。

实施例3、Sarcodonleucopus降血糖有机溶剂（80%乙醇-水）提取物的获取

取新鲜的Sarcodonleucopus子实体，干燥粉碎后称取50克，再用500毫升体积分数为80%乙醇-水溶液（体积比为80:20的乙醇和水的混合液）浸泡，室温（25℃）搅拌4h后，收集滤液。重复上述80%乙醇水浸泡-搅拌-过滤的操作5次（每次的无水乙醇加入到前一次过滤所得滤渣中）后合并滤液，于40℃减压浓缩，然后用真空干燥箱干燥获得80%乙醇-水提取物3.9克。

实施例4、Sarcodonleucopus降血糖有机溶剂（丙酮-正丁醇）提取物的获取

取新鲜的Sarcodonleucopus子实体，干燥粉碎后称取50克，再用500毫升体积分数比为1:1的丙酮-正丁醇浸泡，室温（25℃）搅拌5h后，过滤收集滤液。重复上述丙酮-正丁醇浸泡-搅拌-过滤的操作6次（每次的无水乙醇加入到前一次过滤所得滤渣中）后合并滤液，于36℃减压浓缩，然后用真空干燥箱干燥获得丙酮-正丁醇提取物2.9克。

实施例5、Sarcodonleucopus降血糖有机溶剂（乙酸乙酯）提取物的获取

取新鲜的Sarcodonleucopus子实体，干燥粉碎后称取50克，再用500毫升乙酸乙酯浸泡，室温（20℃）搅拌4h后，过滤收集滤液。重复上述乙酸乙酯浸泡-搅拌-过滤的操作4次（每次的无水乙醇加入到前一次过滤所得滤渣中）后合并滤液，于36℃减压浓缩，然后用真空干燥箱干燥获得乙酸乙酯提取物4.1克。

实施例6、体外抑制α-葡萄糖苷酶活性试验

供试样品溶液：终浓度分别为50.0μg/mL、25.0μg/mL、12.5μg/mL、6.3μg/mL、3.13μg/mL、1.56μg/mL的实施例1制备的Sarcodonleucopus降血糖活性成分及主要成分的三种纯化合物（式（1）、式（2）和式（3）所示的化合物），和实施例1-5制备的Sarcodonleucopus各种降血糖有机溶剂提取物的溶液（溶于少量DMSO后，用蒸馏水稀释至相应浓度，控制DMSO的最终体积分数<0.1%）；阳性对照阿卡波糖溶液终浓度分别为3000μg/mL、1000μg/mL、300μg/mL、100μg/mL（溶于少量DMSO后，用蒸馏水稀释至相应浓度，控制DMSO的最终体积分数<0.1%）。

取25μL不同浓度的以上供试样品溶液，加入25μLα-葡萄糖苷酶水溶液（浓度为0.2U/mL）及175μL磷酸盐缓冲溶液（50mM，pH7.0）。混合溶液于室温放置10min后加入25μL4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷水溶液（浓度为2.5mM），37℃恒温孵育30min，5000rpm离心5min，取上清150μL至96孔板中，在波长405nm处测定吸光值。

实验同时设置空白组：使用25μL的磷酸盐缓冲液（50mM，pH7.0）代替供试样品溶液；空白对照组：使用25μL的磷酸盐缓冲液（50mM，pH7.0）代替供试样品溶液，同时25μL的磷酸盐缓冲液（50mM，pH7.0）代替α-葡萄糖苷酶溶液；样品对照组：使用25μL的磷酸盐缓冲液（50mM，pH7.0）代替α-葡萄糖苷酶溶液。

上述每个实验组均重复三次，结果取平均值。使用下述公式计算样品对α-葡萄糖苷酶的抑制率：

抑制率(%)=[1-(样品组吸光值-样品对照组吸光值)/(空白组组吸光值-空白对照组吸光值)]×100%

对实验数据统计分析，使用IC₅₀软件计算各供试样品的IC₅₀值，结果如表1所示。可见，实施例1制备的Sarcodonleucopus降血糖活性成分、式（1）、式（2）和式（3）所示的化合物，以及实施例1-5中Sarcodonleucopus的各种有机溶剂提取物在测试中表现出极强的α-葡萄糖苷酶抑制活性，其强度均超过阳性药物阿卡波糖；并且Sarcodonleucopus降血糖活性成分比Sarcodonleucopus的各种有机溶剂提取物表现出更高的活性。以上结果表明，本发明中的制备方法有效的富集了α-葡萄糖苷酶抑制活性成分。

表1各样品的α-葡萄糖苷酶抑制活性测试结果

实施例7、动物实验

一、II型糖尿病大鼠模型的构建

1、实验动物

取wistar雄性大鼠60只，适应性饲养一周：室温18-25℃，湿度50-60％，明暗周期12/12小时，自由摄食、饮水；给予标准大鼠饲料。

2、II型糖尿病大鼠模型造模实验

空白组：10只wistar雄性大鼠，给予普通标准大鼠饲料。

模型组：50只wistar雄性大鼠，给予高糖高脂饲料。

将空白组和模型组大鼠均喂养4周后，禁食8小时，于第29天取大鼠尾静脉血测量空腹血糖，并静脉注射链脲霉素45mg/kg体重，在静脉注射后饲喂72小时，禁食8小时，取大鼠尾静脉血测空腹血糖。

结果显示，注射链脲霉素后，模型组大鼠的空腹血糖值为23.76±0.83mmol/L，显著高于空白组大鼠的5.45±0.72mmol/L（P＜0.01），且模型组大鼠的状况欠佳，出现多饮、多尿、多食等糖尿病症状明，以上结果说明II型糖尿病大鼠模型造模成功。

二、给药实验

给药实验分组如表2所示，其中，模型组随机分为5组，各10只步骤一构建成功的II型糖尿病大鼠；；空白对照组为10只正常wistar雄性大鼠。

表2给药实验分组及处理

注：降血糖活性成分、乙醇提取物和乙酸乙酯提取物均溶于蒸馏水中。

各组大鼠同条件下喂养相应的饲料，并灌胃给药，每天一次，连续给药一周，取各组大鼠的尾静脉血测量空腹血糖。

结果如表3所示，可见，Sarcodonleucopus降血糖活性成分、乙醇提取物和乙酸乙酯提取物在测试中均明显降低Ⅱ型糖尿病模型大鼠的血糖值；并且Sarcodonleucopus降血糖活性成分比有机溶剂提取物表现出更高的活性。以上结果表明实施例1中的制备方法有效的富集了降低Ⅱ型糖尿病模型大鼠血糖值的活性成分。

表3各组大鼠空腹血糖值

Claims (11)

1.一种制备Sarcodonleucopus降血糖活性成分的方法，包括如下步骤：

（1）将Sarcodonleucopus子实体干燥粉碎后，加入有机溶剂，配比为0.1-1g干重的所述子实体：10ml所述有机溶剂，20-25℃浸泡提取3-5h，过滤后取滤液；

（2）重复步骤（1）4-6次，每次所述有机溶剂均加入到前一次过滤所得滤渣中，合并每次过滤所得滤液，于36-40℃减压浓缩，真空干燥获得有机溶剂提取物；

（3）用体积分数为20%的乙醇水溶液溶解步骤（2）所得的有机溶剂提取物，得到样品溶液；所述有机溶剂提取物和所述体积分数为20%的乙醇水溶液的配比为1g-1.5g：50mL；

（4）将步骤（3）所得样品溶液上样到装有大孔吸附树脂的树脂柱中，先用体积分数为20%的乙醇水溶液洗脱6个柱保留体积，再用体积分数为85%的乙醇水溶液洗脱6个柱保留体积，吸附和洗脱的流速均为1.5-2.5个柱保留体积每小时；收集合并用体积分数为85%的乙醇水溶液洗脱所得的洗脱液，于36-40℃减压浓缩，真空干燥获得Sarcodonleucopus的降血糖活性成分。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述有机溶剂为如下中的任一种：

（a1）单一溶剂：乙醇、甲醇、乙酸乙酯、正丁醇或丙酮；

（a2）混合溶剂1：由（a1）的单一溶剂中的两种或多种混合而成的溶剂；

（a3）混合溶剂2：由（a1）的单一溶剂与水任意比例混合而成的溶剂，或由（a2）的混合溶剂1与水任意比例混合而成的溶剂。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述大孔吸附树脂为非极性大孔吸附树脂、中等极性大孔吸附树脂或极性大孔吸附树脂。

4.一种制备Sarcodonleucopus降血糖有机溶剂提取物的方法，包括如下步骤：

（1）将Sarcodonleucopus子实体干燥粉碎后，加入有机溶剂，配比为0.1-1g干重，20-25℃浸泡提取3-5h，过滤后取滤液；

（2）重复步骤（1）4-6次，每次所述有机溶剂均加入到前一次过滤所得滤渣中，合并每次过滤所得滤液，于36-40℃减压浓缩，真空干燥获得Sarcodonleucopus降血糖有机溶剂提取物。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述有机溶剂为如下中的任一种：

（a1）单一溶剂：乙醇、甲醇、乙酸乙酯、正丁醇或丙酮；

（a2）混合溶剂1：由（a1）的单一溶剂中的两种或多种混合而成的溶剂；

（a3）混合溶剂2：由（a1）的单一溶剂与水任意比例混合而成的溶剂，或由（a2）的混合溶剂1与水任意比例混合而成的溶剂。

6.利用权利要求1-3中任一所述的方法制备得到的Sarcodonleucopus降血糖活性成分。

7.利用权利要求4或5所述的方法制备得到的Sarcodonleucopus降血糖有机溶剂提取物。

8.权利要求6所述的Sarcodonleucopus降血糖活性成分或权利要求7所述的Sarcodonleucopus降血糖有机溶剂提取物在如下（A1）-（A3）任一中的应用：

（A1）制备治疗和/或预防II型糖尿病的药物；

（A2）制备抑制α-葡萄糖苷酶的药物；

（A3）制备具有降糖作用的食品或功能保健品。

9.治疗和/或预防II型糖尿病的药物，其活性成分为权利要求6所述的Sarcodonleucopus降血糖活性成分或权利要求7所述的Sarcodonleucopus降血糖有机溶剂提取物。

10.抑制α-葡萄糖苷酶的药物，其活性成分为权利要求6所述的Sarcodonleucopus降血糖活性成分或权利要求7所述的Sarcodonleucopus降血糖有机溶剂提取物。

11.具有降糖作用的食品或功能保健品，其活性成分为权利要求6所述的Sarcodonleucopus降血糖活性成分或权利要求7所述的Sarcodonleucopus降血糖有机溶剂提取物。