CN103127227A

CN103127227A - 一种桑叶多糖降血糖活性组分的制备方法

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Publication number: CN103127227A
Application number: CN2011103826306A
Authority: CN
Inventors: 牟志美; 路国兵; 崔为正; 王彦文; 高绘菊; 张瑶
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2011-11-28
Filing date: 2011-11-28
Publication date: 2013-06-05

Abstract

一种具有降血糖作用的桑叶多糖活性组分的制备方法，属于天然药物提取技术领域。本发明提供了一种桑叶多糖降血糖活性组分的制备方法。用100g干桑叶粉经水提、脱蛋白、醇析、冷冻干燥后得到桑叶总多糖3.2896g，得率为3.29%，纯度为92.81%。所得多糖样品分别经DEAE-52纤维素柱层析和SephadexG-100柱层析纯化得到3个均一多糖单组分，即MLPI、MLPII和MLPIII。桑叶多糖各组分对糖尿病大鼠的体重减轻和高血糖症状改善效果具佳，并能修复胰岛损伤，促进糖尿病大鼠胰岛β细胞分泌胰岛素，且无任何毒、副作用，可以用于治疗糖尿病。

Description

一种桑叶多糖降血糖活性组分的制备方法

技术领域

本发明涉及一种从桑叶中分离提取具有降血糖作用的活性组分，属于天然药物提取技术领域。

背景技术

桑科桑属（Morus.L.）植物的叶子除用作家蚕饲料外，还具有药食功能，自古以来，中医就将桑叶作为治疗消渴症的中药应用于临床（中国医学科学院药物研究所. 中药志[M]. 北京: 人民卫生出版社, 1982）。现代药理学研究表明，桑叶具有抑制人体血糖上升的作用，可预防和治疗糖尿病（Naowaboot J, Pannangpetch P , Kukongviriyapan, et al. Mulberry leaf extract restores arterial pressure in streptozotocin- induced chronic diabetic rats[J]. Nutrition Research, 2009, 29: 602-608）。目前，国内外学者关注最多的桑叶降血糖活性成分为生物碱1-脱氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin, DNJ)，以其为模板开发出的亚氨基糖类药物—米格列醇也已获批上市，现已广泛应用于糖尿病的防治（Toshiyuki K, Kiyotaka N, Hiroyuki K, et al. Food-grade mulberry powder enriched with 1-Deoxynojirimycin suppresses the elevation of postprandial blood glucose in humans[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2007, 55: 5569- 5874）。桑叶中另一重要的降血糖活性成分—桑多糖对四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠也具有显著的降血糖作用（Li Y G, Ji D F, Zhong S, et al. Hybrid of 1-deoxynojirimycin and polysaccharide from mulberry leaves treat diabetes mellitus by activating PDX-1/insulin-1 signaling pathway and regulating the expression of glucokinase, phosphoenolpyruvate carboxykinase and glucose-6-phosphatase in alloxan-induced diabetic mice[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2011, 134: 961-970）。

目前，国内外关于桑叶多糖的研究大多集中于多糖分离纯化及多糖粗提物对糖尿病动物模型的降血糖降脂试验，然而对于桑叶多糖单组份的提取技术和确切的降血糖活性组分研究较少。

发明内容

本发明的目的在于提供一种桑叶多糖降血糖活性组分的制备方法。

本发明内容是：称取干燥桑叶粉100 g，用滤纸袋包好置于索氏提取器中，加入400 mL石油醚，升温至80℃后冷凝回流脱脂3小时，取出脱脂所得的桑叶粉，用95%乙醇冲洗3次，每次3分钟，桑叶粉与乙醇的质量比为1∶8，再用去离子水冲洗3次，每次5分钟，桑叶粉与去离子水的质量比为1∶8，然后置于80℃热水中浸提4次，每次45分钟，将浸提液浓缩，用三氯乙酸脱蛋白3次，三氯乙酸在浸提液中浓度为15%，收集上清液，将上清液加入过氧化氢，过氧化氢在上清液中浓度为10%，于55℃脱色30分钟，然后用去离子水透析24小时，浓缩至100 mL，将所得的100 mL浓缩液缓慢加入375 mL 95%乙醇，使乙醇总含量达到75%，于4℃下静置12小时，然后2000转/分钟离心10分钟，收集沉淀物，将所得的沉淀物复溶于100 mL蒸馏水后，通过D101大孔树脂进行洗脱，收集洗脱液，洗脱液经冷冻干燥后得到为粉状的桑叶总多糖。经苯酚-硫酸法测定得到桑叶总多糖3.2896 g，得率为3.29%，纯度为92.81%。

将粉状桑叶多糖溶于蒸馏水，2000转/分钟离心所得的上清液，再通过DEAE-52 (2.6 cm×25 cm)纤维素柱进行初步分离，依次用水、0.05～0.5 mol/L NaCl溶液进行梯度洗脱，采用苯酚-硫酸法跟踪检测洗脱液中多糖含量并分别收集洗脱液，各部分洗脱液用蒸馏水透析48小时，得到3个桑叶多糖单组分，再通过Sephadex G-100柱层析(1.0 cm×60 cm)进一步纯化，采用蒸馏水洗脱，以苯酚-硫酸法跟踪检测，最终得到3个均一桑叶多糖单组分，分别命名为MLP I，MLP II和MLP III。

本发明桑叶多糖3个均一降血糖活性单组分MLP I，MLP II和MLP III具有降血糖作用，其中MLP II对糖尿病大鼠的体重减轻和高血糖症状改善效果最佳，并能修复胰岛损伤，促进糖尿病大鼠胰岛β细胞分泌胰岛素，且无任何毒、副作用，可以用于治疗糖尿病。

附图说明

图1 桑叶多糖降血糖活性组分的提取工艺流程图

图中1是桑叶干燥粉碎，2是石油醚脱脂，3是醇提、水提，4是三氯乙酸脱蛋白，5是过氧化氢脱色，6是乙醇醇析，7是树脂洗脱，8是冷冻干燥，9是纯化。

图2桑叶多糖MLP Ⅱ对糖尿病大鼠胰腺组织形态的影响

A. 正常对照组，B. 糖尿病对照组，C. 50 mg/kg MLP Ⅱ治疗组，D. 100 mg/kg MLP Ⅱ治疗组，E. 150 mg/kg MLP Ⅱ治疗组，F. 5 mg/kg格列苯脲治疗组

图3桑叶多糖MLP Ⅱ对糖尿病大鼠胰岛素表达的影响

A. 正常对照组，B. 糖尿病对照组，C. 50 mg/kg MLP Ⅱ治疗组，D. 100 mg/kg MLP Ⅱ治疗组，E. 150 mg/kg MLP Ⅱ治疗组，F. 5 mg/kg格列苯脲治疗组。

具体实施方式

1、桑叶多糖降血糖活性组分制备，按以下步骤操作：

鲜桑树叶经干燥、粉碎后过40目筛(1)，称取桑叶粉100 g，用滤纸袋包好置于索氏提取器中，加入400 mL石油醚，升温至80℃后冷凝回流脱脂3小时(2)，取出步骤(2)所得的桑叶粉，用95%乙醇冲洗3次，每次3分钟，冲洗时桑叶粉经称重与乙醇按1∶8的质量比，再用去离子水冲洗3次，每次5 分钟，冲洗时桑叶粉经称重与去离子水按1∶8的质量比，然后置于80℃热水中浸提4次，每次45分钟(3)，采用旋转蒸发仪将浸提液浓缩，用三氯乙酸脱蛋白3次，三氯乙酸在浸提液中浓度为15%，收集上清液(4)，将上清液加入过氧化氢，过氧化氢在上清液中浓度为10%，于55℃脱色30分钟，然后用去离子水透析24小时，浓缩至100 mL，浓缩方法同上(5)，将所得的100 mL浓缩液缓慢加入375 mL 95%乙醇，使乙醇总含量达到75%，于4℃下静置12小时，然后2000转/分钟离心10分钟，收集沉淀物(6)，将所得的沉淀物复溶于100 mL蒸馏水后，通过D101大孔树脂进行洗脱，收集洗脱液(7)，洗脱液经冷冻干燥后得到为粉状的桑叶总多糖(8)。

将步骤(8)所得的桑叶总多糖（MLP）溶于蒸馏水，2000转/分钟离心离心所得的上清液通过DEAE-52 (2.6 cm×25 cm)纤维素柱进行初步分离，依次用水、0.05～0.5 mol/L NaCl溶液进行梯度洗脱，采用苯酚-硫酸法跟踪检测洗脱液中多糖含量并分别收集洗脱液，各部分洗脱液用蒸馏水透析48小时，得到3个桑叶多糖单组分，再通过Sephadex G-100柱层析(1.0 cm×60 cm)进一步纯化，采用蒸馏水洗脱，以苯酚-硫酸法跟踪检测，最终得到3个均一桑叶多糖单组分，分别命名为MLP I，MLP II和MLP III (9)。

2、动物药效试验

本发明制备的桑叶多糖活性组分经过动物试验证明，具有显著的降血糖效果，药效试验报告如下：

(1) 糖尿病大鼠模型制备

①实验动物与饲料雄性wistar大鼠，体质量140-160 g，购自北京维通利华动物实验中心，合格证号为SCXK(京)2009-0003。基础饲料和高脂高糖饲料均购自北京维通利华动物实验中心，高脂高糖饲料配方为：20%蔗糖，10%猪油，2.0%胆固醇，0.5%胆酸钠，67.5%基础饲料。

②大鼠适应性喂养1周后，给予高脂高糖饲料，喂养4周后，禁食12 h，以35 mg/kg剂量腹腔注射STZ (STZ溶于0.1 mol/L柠檬酸缓冲液，pH4.5)。继续高脂高糖饲料喂养1周后，禁食12h，采用毛细玻璃管从大鼠内眦静脉取血1 mL，通过葡萄糖氧化酶法（Thomas L. Clinical laboratory diagnostcs[M]. Frankfurt: TH-Books verlagsgesellschaft, 1998, 131-137）测定大鼠的空腹血糖(FBG)，FBG≥7.8 mmol/L视为糖尿病模型制备成功。

(2) 桑叶多糖各组分降血糖作用测定

随机选取糖尿病大鼠24只，均分为4组：糖尿病模型组，桑叶多糖MLP I治疗组，桑叶多糖MLP II治疗组和MLP III治疗组，另取基础饲料喂养且体质量相近的大鼠6只作为正常对照组。其中，3个多糖治疗组大鼠每天灌胃150 mg/kg剂量的桑叶多糖(溶于0.154 mol/L NaCl溶液)，而正常对照组和糖尿病模型组大鼠则每天灌胃同等容积的0.154 mol/L NaCl溶液，持续灌胃5周。试验过程中除正常对照组大鼠以基础饲料喂养外，其余各组大鼠均喂以高脂高糖饲料。于试验开始前后分别测定各组大鼠的体质量和FBG。桑叶多糖治疗后的统计结果表明(表1)，同正常对照组相比，模型对照组大鼠呈现出明显的体重减轻和高血糖症状，而桑叶多糖各组分对糖尿病大鼠的治疗效果存在明显差异，其中，MLP II的治疗效果最为明显。与模型对照组大鼠相比，MLP II治疗组大鼠体重增加26.79%，血糖降低51.84%，提示MLP II显著地改善了糖尿病大鼠的体重减轻和高血糖症状。

表1 桑叶多糖不同组分对糖尿病大鼠体重和空腹血糖的影响(`x±s)

*P < 0.05, **P < 0.01均表示与空白对照组相比.

(3) 桑叶多糖MLP II对糖尿病大鼠胰岛b细胞结构和功能的影响

①随机选取糖尿病大鼠30只，均分为5组：糖尿病模型组，MLP II低剂量(50 mg/kg) 治疗组，MLP II中剂量(100 mg/kg) 治疗组，MLP II高剂量(150 mg/kg) 治疗组和格列苯脲(5 mg/kg) 治疗组。另取基础饲料喂养且体质量相近的大鼠6只作为正常对照组。其中，3个多糖治疗组和格列苯脲治疗组大鼠每天灌胃相应剂量的药物 (溶于0.154 mol/L NaCl溶液)，而正常对照组和糖尿病模型组大鼠则每天灌胃同等容积的0.154 mol/L NaCl溶液，持续灌胃5周。试验过程中除正常对照组大鼠以基础饲料喂养外，其余各组大鼠均喂以高脂高糖饲料。

②各组大鼠经腹主动脉取血后，迅速分离胰腺，固定于10%中性甲醛溶液，经脱水、透明后常规石蜡包埋，4 mm连续切片，HE染色后置于光学显微镜下观察胰腺组织形态学改变。由胰腺HE染色图片(图2)可以看出，正常对照组大鼠胰腺中胰岛组织与腺泡之间结合紧密且界限清晰，胰岛细胞丰富且分布均匀，形态规则(图2-A)；而糖尿病对照组大鼠胰岛组织明显萎缩且出现与腺泡脱离现象，胰岛细胞明显减少，部分细胞变性、核固缩(图2-B)；桑叶多糖MLP II(图2-C~E)和格列苯脲(图2-F)治疗组的大鼠胰岛组织形态得到明显改善，尤其以150 mg/kg MLP II治疗组(图2-E)和格列苯脲治疗组的治疗效果最为明显，胰岛细胞较多且细胞排列整齐，胰岛组织形态基本恢复正常。

③采用免疫组化法（王秀琴, 瓦龙美, 张华, 等. 组织化学与免疫组织化学[M]. 北京: 首都医科大学出版社, 2002: 71-73.）检测各组大鼠胰腺中胰岛素的表达情况，通过光学显微镜对大鼠胰岛区进行观察、拍照，棕黄色或棕褐色颗粒为胰岛素阳性反应信号。由各组大鼠胰岛中胰岛素免疫组化结果(图3)可以看出，胰岛b细胞分泌的胰岛素与胰岛素特异性抗体结合后呈棕黄色颗粒；其中，正常对照组大鼠的胰岛素分泌细胞，即胰岛b细胞较为丰富，细胞核呈蓝紫色，细胞质中可见大量棕黄色胰岛素阳性反应颗粒，且着色较深(图3-A)；而糖尿病模型组大鼠胰岛b细胞明显减少，且胞质中棕黄色胰岛素阳性反应颗粒较少，着色较浅(图3-B)；桑叶多糖MLP II(图3-C~E)和格列苯脲治疗组(图3-F)大鼠胰岛组织中胰岛素的表达情况得到明显改善，尤其以150 mg/kg MLP II治疗组(图3-E)和格列苯脲治疗组的治疗效果最为明显，糖尿病大鼠的胰岛b细胞明显增多，且胞质中棕黄色胰岛素阳性反应颗粒较为丰富且着色较深，阳性反应物面密度值极显著高于正常对照组。结果表明，桑叶多糖MLP II的降血糖作用可能与其能修复糖尿病大鼠的胰岛组织损伤，促进糖尿病大鼠的胰岛b细胞再生，改善b细胞胰岛素分泌功能有关。

Claims

1.一种桑叶多糖降血糖活性组分的制备方法，其特征在于以鲜桑树叶片为原料，首先摘取鲜桑树叶经干燥、粉碎后过40目筛，称取桑叶粉100 g，用滤纸袋包好置于索氏提取器中，加入400 mL石油醚，升温至80℃后冷凝回流脱脂3小时，取出脱脂所得的桑叶粉，用95%乙醇冲洗3次，每次3分钟，桑叶粉与乙醇的质量比为1∶8，再用去离子水冲洗3次，每次5分钟，桑叶粉与去离子水的质量比为1∶8，然后置于80℃热水中浸提4次，每次45分钟，将浸提液浓缩，用三氯乙酸脱蛋白3次，三氯乙酸在浸提液中浓度为15%，收集上清液，将上清液加入过氧化氢，过氧化氢在上清液中浓度为10%，于55℃脱色30分钟，然后用去离子水透析24小时，浓缩至100 mL，将所得的100 mL浓缩液缓慢加入375 mL 95%乙醇，使乙醇总含量达到75%，于4℃下静置12小时，然后2000转/分钟离心10分钟，收集沉淀物，将所得的沉淀物复溶于100 mL蒸馏水后，通过D101大孔树脂进行洗脱，收集洗脱液，洗脱液经冷冻干燥后得到粉状的桑叶总多糖，专用于治疗糖尿病。

2.根据权利要求1所述的一种桑叶多糖降血糖活性组分制备方法，其特征在于将所得的粉状桑叶多糖溶于蒸馏水，2000转/分钟离心所得的上清液，再通过DEAE-52 (2.6 cm×25 cm)纤维素柱进行初步分离，依次用水、0.05～0.5 mol/L NaCl溶液进行梯度洗脱，采用苯酚-硫酸法跟踪检测洗脱液中多糖含量并分别收集洗脱液，各部分洗脱液用蒸馏水透析48小时，得到3个桑叶多糖单组分，再通过Sephadex G-100柱层析(1.0 cm×60 cm)进一步纯化，采用蒸馏水洗脱，以苯酚-硫酸法跟踪检测，最终得到3个均一桑叶多糖单组分。