CN106011202A - 利用微生物转化生产糖苷类化合物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物转化技术领域，具体涉及一种利用微生物转化生产糖苷类化合物的方法。方法是平板培养，种子培养，微生物转化试验，糖苷化转化产物的提取。本发明的方法是微生物发酵培养到一定时间，添加一定浓度的降苦参酮溶液，微生物自身产生的酶对底物进行了结构修饰，发生了糖苷化反应，产生了高活性、低毒性的糖苷化转化产物；首次提出了利用微生物转化手段制备黄酮糖苷类天然产物，还获得了4个新的黄酮糖苷化产物。

Description

利用微生物转化生产糖苷类化合物的方法
技术领域
本发明属于微生物转化技术领域，具体涉及一种利用微生物转化生产糖苷类化合物的方法。
背景技术
生物转化，是利用生物体系(包括植物、微生物或动物组织的培养体系)或生物体系的相关酶制剂对外源有机底物某一特定部位或功能基团进行特异性的结构修饰以获得有价值产物的生理、生化反应。其本质是利用生物体系自身所产生的酶对外源物质进行催化反应，具有高效、高选择性、反应清洁、产物单纯、易分离纯化、能耗低等优点，符合现代科学发展绿色环保的要求。
很多菌种都能使多种化合物发生不同的反应，这些菌种主要是霉菌、酵母菌和细菌，其中又以霉菌在文献中特别常见。微生物转化已经涉及到了羟基化、环氧化、脱氢、加氢等氧化还原反应，水解、酯化、脱水、脱羧、酰化、胺化、异构化等各类化学反应。微生物转化中较为常见的反应类型是羟基化、水解、环氧化和甲基化反应。而糖苷化反应在微生物转化中很少被观察到。
降苦参酮是黄酮类化合物，是植物代谢过程中产生的一类重要天然有机化合物，具有抗菌、抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗过敏等活性，具有很高的药用价值和医用价值，也因此受到了越来越来多的关注。但是，大多数黄酮类化合物有溶解度低、在极性和非极性溶液中稳定性都很差的特点，这大大限制了它的推广使用。提高黄酮类化合物的亲水性和稳定性，可以通过化学法和酶法进行结构修饰。酶法具有化学法无法比拟的优点，条件温和，化学、区域和立体选择性高，操作简便，环境友好等特点而发展非常迅速。微生物法是酶法的一种，依靠微生物自身产生的酶发挥作用，在黄酮类化合物的结构修饰上是一种有效的方式。同时微生物转化还可以发现新的活性化合物，获得高活性、低毒性的衍生物，这为新药开发提供一条有效途径。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用微生物转化生产糖苷类化合物的方法，通过微生物转化将降苦参酮进行结构修饰，获得新的高活性、低毒性物质。
本发明所述的利用微生物转化生产糖苷类化合物的方法，步骤如下：
(1)平板培养：用接种环挑取短刺小克银汉霉的菌丝体在PDA平板上划线，于恒温培养箱中培养，4℃保存，得到短刺小克银汉霉菌株平板；
(2)种子培养：从短刺小克银汉霉菌株平板中用接种环挑取一环菌丝体，接种到有种子培养基的锥形瓶中，用棉塞封口后震荡培养，得种子液；
(3)微生物转化试验：量取种子液加入到装有PDA培养基的无菌锥形瓶中，用棉塞封口后放于生物摇床中进行振荡培养，36小时后将降苦参酮丙酮溶液加入到PDA培养基中，继续培养，得发酵培养液；
(4)糖苷化转化产物的提取：过滤发酵培养液，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取，合并萃取有机相，真空减压浓缩至干，得转化残渣；将残渣溶解于丙酮，与硅胶拌样，以硅胶柱分离，氯仿-丙酮梯度洗脱，收集馏分；该馏分以甲醇-水为流动相，利用制备型高效液相分离得到转化产物2'甲氧基-6"羟基-降苦参酮-7-O-β-D-葡萄糖苷(Ⅰ)和降苦参酮7-O-β-D-葡萄糖苷(Ⅱ)；馏分再进一步利用乙腈-水系统分离得到转化产物6"羟基-降苦参酮-7-O-β-D-葡萄糖苷(Ⅲ)和7"-羟基-2'-甲氧基-降苦参酮-7-O-β-D-葡萄糖苷(Ⅳ)。
步骤(1)中所述的恒温培养箱的温度为28℃，培养时间为3-5天。
步骤(2)中所述的震荡培养条件为28℃，180rpm，培养时间24小时。
步骤(3)中所述的振荡培养条件为180rpm、28℃。
步骤(3)中所述的降苦参酮丙酮溶液的浓度为10mg/ml。
步骤(3)中所述的降苦参酮丙酮溶液的加入量为50-200ml。
步骤(3)中所述的继续培养时间为5天。
步骤(4)中所述的甲醇与水的体积比为55:45。
步骤(4)中所述的乙腈与水的体积比为50:50。
本发明所述的利用微生物转化生产糖苷类化合物的方法，具体步骤如下：
(1)平板培养：取去皮马铃薯20g，加入200ml去离子水煮沸并保持20min；冷却后过滤，取过滤后的清液加2g葡萄糖和2g琼脂，常压加热使琼脂全部溶解后，加去离子水定容至100ml；115℃下灭菌30min，待培养基冷却至50℃左右后，按无菌操作法倒平板(每皿约倒15ml)，平置，待凝后制得PDA平板；用接种环挑取短刺小克银汉霉的菌丝体在PDA平板上划线，于28℃恒温培养箱中培养3-5天，4℃保存；
(2)种子培养：取去皮马铃薯200g，加入1000ml去离子水煮沸并保持20min；冷却后过滤，取过滤后的清液加20g葡萄糖，葡萄糖全部溶解后，加去离子水定容至1000ml，分装于250ml锥形瓶中，115℃下灭菌30min，得种子培养基；从短刺小克银汉霉菌株平板中用接种环挑取一环菌丝体，接种到有100ml的种子培养基的250ml锥形瓶中，用棉塞封口后放于28℃，180rpm条件下震荡培养24小时，得种子液；
(3)微生物转化试验：量取30ml左右的种子液(接种量为20％)加入到装有350ml PDA培养基的无菌、1000mL的锥形瓶中，用棉塞封口后放于180rpm、28℃的生物摇床中进行振荡培养，36小时后将50-200ml、10mg/ml降苦参酮丙酮溶液加入到PDA培养基中，继续培养5天；
(4)糖苷化转化产物的提取：过滤发酵培养液，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取5次。合并萃取有机相，真空减压浓缩至干，得转化残渣。将残渣溶解于少量丙酮，与两倍量硅胶(200-300目)拌样，以一根30倍于样品量的硅胶柱分离(4×5cm)，氯仿-丙酮梯度洗脱(100:5-1:1)，收集馏分，可获得糖苷降苦参酮糖苷化产物。该馏分以甲醇-水(55:45)为流动相，利用制备型高效液相分离得到转化产物2'甲氧基-6"羟基-降苦参酮-7-O-β-D-葡萄糖苷6mg(Ⅰ)和降苦参酮7-O-β-D-葡萄糖苷(Ⅱ)；馏分再进一步利用乙腈-水系统(50:50)分离得到转化产物6"羟基-降苦参酮-7-O-β-D-葡萄糖苷(Ⅲ)和7"-羟基-2'-甲氧基-降苦参酮-7-O-β-D-葡萄糖苷(Ⅳ)。
(5)糖苷类化合物的鉴定：对上述转化产物(Ⅰ)(Ⅱ)(Ⅲ)(Ⅳ)经过UV、IR、MS、NMR等仪器方法进行了结构鉴定确定为降苦参酮的糖苷化转化产物。
(6)抗肿瘤活性测定：选用人宫颈癌细胞(HeLa)、人黑色素瘤细胞(A375)为受试对象，降苦参酮及其相应的4个糖苷化微生物转化产物进行抗肿瘤活性的测定。
本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：
本发明的方法是微生物发酵培养到一定时间，添加一定浓度的降苦参酮溶液，微生物自身产生的酶对底物进行了结构修饰，发生了糖苷化反应，产生了高活性、低毒性的糖苷化转化产物。根据文献报道，糖苷化在微生物转化中极少被观察到，而本发明首次提出了利用微生物转化手段制备黄酮糖苷类天然产物，本发明还获得了4个新的黄酮糖苷化产物。
附图说明
图1是本发明的工艺流程图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步描述。
实施例1
(1)平板培养：取去皮马铃薯20g，加入200ml去离子水煮沸并保持20min；冷却后过滤，取过滤后的清液加2g葡萄糖和2g琼脂，常压加热使琼脂全部溶解后，加去离子水定容至100ml；115℃下灭菌30min，待培养基冷却至50℃左右后，按无菌操作法倒平板(每皿约倒15ml)，平置，待凝后制得PDA平板；用接种环挑取短刺小克银汉霉的菌丝体在PDA平板上划线，于28℃恒温培养箱中培养5天，4℃保存；
(2)种子培养：取去皮马铃薯200g，加入1000ml去离子水煮沸并保持20min；冷却后过滤，取过滤后的清液加20g葡萄糖，葡萄糖全部溶解后，加去离子水定容至1000ml，分装于250ml锥形瓶中，115℃下灭菌30min，得种子培养基；从短刺小克银汉霉菌株平板中用接种环挑取一环菌丝体，接种到有100ml的种子培养基的250ml锥形瓶中，用棉塞封口后放于28℃，180rpm条件下震荡培养24小时，得种子液；
(3)微生物转化试验：量取30ml左右的种子液(接种量为20％)加入到装有350ml PDA培养基的无菌、1000mL的锥形瓶中，用棉塞封口后放于180rpm、28℃的生物摇床中进行振荡培养，36小时后将50ml、10mg/ml降苦参酮丙酮溶液加入到PDA培养基中，继续培养5天。
(4)糖苷化转化产物的提取：过滤发酵培养液，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取5次。合并萃取有机相，真空减压浓缩至干，得转化残渣1.67g。将转化残渣溶于少量丙酮，与两倍量硅胶(200-300目)拌样，以一根30倍于样品量的硅胶柱分离(4×5cm)，氯仿-丙酮梯度洗脱(100:5-1:1)，收集第五个馏分，可获得214mg。该馏分以甲醇-水(55:45)为流动相，利用制备型高效液相分离得到转化产物(Ⅰ)2.8mg，(Ⅱ)3.39mg；馏分再进一步利用乙腈-水系统(50:50)分离得到转化产物(Ⅲ)4.5mg，(Ⅳ)5.45mg。
(5)糖苷类化合物的鉴定：对上述转化产物经过UV、IR、MS、NMR等仪器方法进行了结构鉴定确定为：(Ⅰ)2'-甲氧基-6"羟基-降苦参酮-7-O-β-D-葡萄糖苷，(Ⅱ)降苦参酮7-O-β-D-葡萄糖苷，(Ⅲ)6"-羟基-降苦参酮-7-O-β-D-葡萄糖苷9mg，(Ⅳ)7"-羟基-2'-甲氧基-降苦参酮-7-O-β-D-葡萄糖苷。
实施例2
(1)平板培养：取去皮马铃薯20g，加入200ml去离子水煮沸并保持20min；冷却后过滤，取过滤后的清液加2g葡萄糖和2g琼脂，常压加热使琼脂全部溶解后，加去离子水定容至100ml；115℃下灭菌30min，待培养基冷却至50℃左右后，按无菌操作法倒平板(每皿约倒15ml)，平置，待凝后制得PDA平板；用接种环挑取短刺小克银汉霉的菌丝体在PDA平板上划线，于28℃恒温培养箱中培养5天，4℃保存；
(2)种子培养：取去皮马铃薯200g，加入1000ml去离子水煮沸并保持20min；冷却后过滤，取过滤后的清液加20g葡萄糖，葡萄糖全部溶解后，加去离子水定容至1000ml，分装于250ml锥形瓶中，115℃下灭菌30min，得种子培养基；从短刺小克银汉霉菌株平板中用接种环挑取一环菌丝体，接种到有100ml的种子培养基的250ml锥形瓶中，用棉塞封口后放于28℃，180rpm条件下震荡培养24小时，得种子液；
(3)微生物转化试验：量取30ml左右的种子液(接种量为20％)加入到装有350ml PDA培养基的无菌、1000mL的锥形瓶中，用棉塞封口后放于180rpm、28℃的生物摇床中进行振荡培养，36小时后将100ml、10mg/ml降苦参酮丙酮溶液加入到PDA培养基中，继续培养5天。
(4)糖苷化转化产物的提取：过滤发酵培养液，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取5次。合并萃取有机相，真空减压浓缩至干，得转化残渣3.5g。将转化残渣溶于少量丙酮，与两倍量硅胶(200-300目)拌样，以一根30倍于样品量的硅胶柱分离(4×5cm)，氯仿-丙酮梯度洗脱(100:5-1:1)，收集第五个馏分，可获得460mg。该馏分以甲醇-水(55:45)为流动相，利用制备型高效液相分离得到转化产物(Ⅰ)6mg，(Ⅱ)7mg；馏分再进一步利用乙腈-水系统(50:50)分离得到转化产物(Ⅲ)9mg，(Ⅳ)11mg。
(5)糖苷类化合物的鉴定：对上述转化产物经过UV、IR、MS、NMR等仪器方法进行了结构鉴定确定为：(Ⅰ)2'-甲氧基-6"羟基-降苦参酮-7-O-β-D-葡萄糖苷，(Ⅱ)降苦参酮7-O-β-D-葡萄糖苷，(Ⅲ)6"-羟基-降苦参酮-7-O-β-D-葡萄糖苷9mg，(Ⅳ)7"-羟基-2'-甲氧基-降苦参酮-7-O-β-D-葡萄糖苷。
实施例3
(1)平板培养：取去皮马铃薯20g，加入200ml去离子水煮沸并保持20min；冷却后过滤，取过滤后的清液加2g葡萄糖和2g琼脂，常压加热使琼脂全部溶解后，加去离子水定容至100ml；115℃下灭菌30min，待培养基冷却至50℃左右后，按无菌操作法倒平板(每皿约倒15ml)，平置，待凝后制得PDA平板；用接种环挑取短刺小克银汉霉的菌丝体在PDA平板上划线，于28℃恒温培养箱中培养5天，4℃保存；
(2)种子培养：取去皮马铃薯200g，加入1000ml去离子水煮沸并保持20min；冷却后过滤，取过滤后的清液加20g葡萄糖，葡萄糖全部溶解后，加去离子水定容至1000ml，分装于250ml锥形瓶中，115℃下灭菌30min，得种子培养基；从短刺小克银汉霉菌株平板中用接种环挑取一环菌丝体，接种到有100ml的种子培养基的250ml锥形瓶中，用棉塞封口后放于28℃，180rpm条件下震荡培养24小时，得种子液；
(3)微生物转化试验：量取30ml左右的种子液(接种量为20％)加入到装有350ml PDA培养基的无菌、1000mL的锥形瓶中，用棉塞封口后放于180rpm、28℃的生物摇床中进行振荡培养，36小时后将200ml、10mg/ml降苦参酮丙酮溶液加入到PDA培养基中，继续培养5天；
(4)糖苷化转化产物的提取：过滤发酵培养液，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取5次。合并萃取有机相，真空减压浓缩至干，得转化残渣7.2g。将转化残渣溶于少量丙酮，与两倍量硅胶(200-300目)拌样，以一根30倍于样品量的硅胶柱分离(4×5cm)，氯仿-丙酮梯度洗脱(100:5-1:1)，收集第五个馏分，可获得930mg。该馏分以甲醇-水(55:45)为流动相，利用制备型高效液相分离得到转化产物(Ⅰ)13.1mg，(Ⅱ)14.5mg；馏分再进一步利用乙腈-水系统(50:50)分离得到转化产物(Ⅲ)17.6mg，(Ⅳ)23.6mg。
(5)糖苷类化合物的鉴定：对上述转化产物经过UV、IR、MS、NMR等仪器方法进行了结构鉴定确定为：(Ⅰ)2'-甲氧基-6"羟基-降苦参酮-7-O-β-D-葡萄糖苷，(Ⅱ)降苦参酮7-O-β-D-葡萄糖苷，(Ⅲ)6"-羟基-降苦参酮-7-O-β-D-葡萄糖苷9mg，(Ⅳ)7"-羟基-2'-甲氧基-降苦参酮-7-O-β-D-葡萄糖苷。
抗肿瘤活性测定：降苦参酮及其相应的4个糖苷化微生物转化产物(实施例1、2、3获得的转化产物分别进行合并)进行抗肿瘤活性的测定，选用人宫颈癌细胞(HeLa)、人黑色素瘤细胞(A375)为受试对象，结果显示结构中引入葡萄糖单元，不仅可明显增加其水溶性同时抗肿瘤活性显著提高。降苦参酮及其相应的4个糖苷化微生物转化产物的体外细胞毒活性筛选结果见表1。
表1降苦参酮及其相应的4个糖苷化微生物转化产物的体外细胞毒活性筛选结果

Claims (9)

1.一种利用微生物转化生产糖苷类化合物的方法，其特征在于步骤如下：
(1)平板培养：用接种环挑取短刺小克银汉霉的菌丝体在PDA平板上划线，于恒温培养箱中培养，4℃保存，得到短刺小克银汉霉菌株平板；
(2)种子培养：从短刺小克银汉霉菌株平板中用接种环挑取一环菌丝体，接种到有种子培养基的锥形瓶中，用棉塞封口后震荡培养，得种子液；
(3)微生物转化试验：量取种子液加入到装有PDA培养基的无菌锥形瓶中，用棉塞封口后放于生物摇床中进行振荡培养，36小时后将降苦参酮丙酮溶液加入到PDA培养基中，继续培养，得发酵培养液；
(4)糖苷化转化产物的提取：过滤发酵培养液，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取，合并萃取有机相，真空减压浓缩至干，得转化残渣；将残渣溶解于丙酮，与硅胶拌样，以硅胶柱分离，氯仿-丙酮梯度洗脱，收集馏分；该馏分以甲醇-水为流动相，利用制备型高效液相分离得到转化产物2'甲氧基-6"羟基-降苦参酮-7-O-β-D-葡萄糖苷(Ⅰ)和降苦参酮7-O-β-D-葡萄糖苷(Ⅱ)；馏分再进一步利用乙腈-水系统分离得到转化产物6"羟基-降苦参酮-7-O-β-D-葡萄糖苷(Ⅲ)和7"-羟基-2'-甲氧基-降苦参酮-7-O-β-D-葡萄糖苷(Ⅳ)。
2.根据权利要求1所述的利用微生物转化生产糖苷类化合物的方法，其特征在于步骤(1)中所述的恒温培养箱的温度为28℃，培养时间为3-5天。
3.根据权利要求1所述的利用微生物转化生产糖苷类化合物的方法，其特征在于步骤(2)中所述的震荡培养条件为28℃，180rpm，培养时间24小时。
4.根据权利要求1所述的利用微生物转化生产糖苷类化合物的方法，其特征在于步骤(3)中所述的振荡培养条件为180rpm、28℃。
5.根据权利要求1所述的利用微生物转化生产糖苷类化合物的方法，其特征在于步骤(3)中所述的降苦参酮丙酮溶液的浓度为10mg/ml。
6.根据权利要求1所述的利用微生物转化生产糖苷类化合物的方法，其特征在于步骤(3)中所述的降苦参酮丙酮溶液的加入量为50-200ml。
7.根据权利要求1所述的利用微生物转化生产糖苷类化合物的方法，其特征在于步骤(3)中所述的继续培养时间为5天。
8.根据权利要求1所述的利用微生物转化生产糖苷类化合物的方法，其特征在于步骤(4)中所述的甲醇与水的体积比为55:45。
9.根据权利要求1所述的利用微生物转化生产糖苷类化合物的方法，其特征在于步骤(4)中所述的乙腈与水的体积比为50:50。
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