CN101100682B

CN101100682B - 绿僵菌发酵提纯苦马豆素的工艺

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Publication number: CN101100682B
Application number: CN2006100431205A
Authority: CN
Inventors: 赵宝玉; 来航线; 王建军; 傅艳萍
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2006-07-07
Filing date: 2006-07-07
Publication date: 2011-04-27
Anticipated expiration: 2026-07-07
Also published as: CN101100682A

Abstract

本发明公开了一种绿僵菌发酵提纯苦马豆素的工艺，从中国农业科学院微生物菌种保存中心购买的标准绿僵菌(Metarrhizium anisopliae)菌株，通过生物发酵工程培养，获得含苦马豆素较高的菌丝体和发酵液，采用超声提取、溶剂萃取、薄层色谱、D101树脂、硅胶柱层析及梯度升华等技术，从菌丝体和发酵液中分离提纯出苦马豆素纯品。该工艺制备的苦马豆素呈白色针状结晶，分子量为173，熔点144～145℃，纯度≥98％。本发明的工艺，不破坏现有的植物资源，不存在资源匮乏问题，生产周期短，提取成本低，生产量大，产品纯度高，利于工厂化生产，可促进苦马豆素作为抗肿瘤药物及免疫增强剂等药物研发的产业化进程。

Description

绿僵菌发酵提纯苦马豆素的工艺

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及微生物学、生物发酵，天然产物提取、分离和鉴定方法，特别涉及一种绿僵菌发酵提纯苦马豆素的工艺。

背景技术

苦马豆素的来源有三种途径：(1)从植物中提取分离苦马豆素：目前已知含苦马豆素的植物有①豆科苦马豆属植物，如苦马豆、灰苦马豆(Swainsonacanescens)，该属植物在澳大利亚和我国均有分布灰苦马豆，是首先分离出苦马豆素的植物；②豆科黄芪属(Astragalas)和棘豆属(Oxytropis)植物，这类植物是国内外研究较多的植物，分布于世界各地，尤其是北美和我国，资源十分丰富。据不完全统计，这类植物在我国有44种，其中黄芪属21种，棘豆属23种；③锦葵科黄花稔属(Sida)，如鹅耳枥黄花稔(Sida carpinifolia)，热带美洲和非洲可能是其发源地，在巴西的南部和东南部也发现有大量的鹅耳枥黄花稔；④旋花科番薯属，Haraguchi M等(2003)从Ipomea carnea的叶子、花和种子中分离出苦马豆素，新鲜叶子和花中的含量分别为0.0029％和0.0028％，种子中的含量大约为叶子和花中含量的10倍。这类植物主要分布于澳大利亚。植物中的苦马豆素相当稳定，据Molyneux等(1991)^]报道，保存15年的斑荚黄芪仍含有苦马豆素。

(2)从真菌菌丝体及其培养液中提取分离苦马豆素：Schneider B等(1984)从美国标准库保存的豆类丝核菌(Rhizoctonia Legaminicola)中分离出苦马豆素。Sim K L等(1997)报道绿僵菌(Metarrhizium anisopliae)中也含有苦马豆素，如果降低绿僵菌培养液的pH值，可使苦马豆素的浓度增加。Braun K等(2003)从中毒疯草密柔毛黄芪，兰伯氏棘豆，绢毛棘豆的8个类群的叶、茎、种子和花中分离出内生植物真菌。所有培养的内生植物都产生导致疯草病的生物碱-苦马豆素。感染内生植物的疯草类群也产生苦马豆素，而且体外培养的内生植物的苦马豆素水平与宿主植物类群的苦马豆素水平高度相关。

(3)人工合成苦马豆素

鉴于苦马豆素及其相关化合物在生物化学、免疫学、医学和毒理学等方面的众多用途，美国的化学家Yasuda(1984)、Bennett(1989)和我国科学院院士周维善先后对苦马豆素人工合成进行了研究。由于苦马豆素有4个手性碳原子，即使很好地控制反应，但是合成的产物中还有16个化学结构相同，而立体构象不同的异构体，要使之分离却十分困难，整个合成过程有21步，产率仅为6.6％。

苦马豆素的抗肿瘤活性、免疫增强作用及其抗辐射作用是十分明显的，不容质疑。然而制约苦马豆素作为抗肿瘤药物研发，产品产业化，最终走向临床用药的关键是苦马豆素纯品的来源十分匮乏，远远不能满足人们研究的需要。植物中苦马豆素含量本身很低，仅为0.02％左右，且植物资源受自然因素的影响较大，使得苦马豆素的生产量十分匮乏。化学合成由于受合成路线及分离技术的限制使得苦马豆素的来源也十分有限，这些都严重的制约着苦马豆素抗肿瘤活性研究及其产品开发。从真菌菌丝体及其培养液中提取分离苦马豆素，中国专利公开号CN1396263，公开日2003年2月12日，发明创造的名称为生物发酵提纯苦马豆素的工艺，其所采用的微生物菌株是自行从自然界豆科植物中分离、筛选的可产生苦马豆素的豆类丝核菌7-3菌株(代号)，但没有公开豆类丝核菌7-3菌株的具体获得方法和途径，也没有公开该豆类丝核菌7-3菌株的具体特性、标准、以及品质鉴定方法，同领域的普通技术人员无法按说明书的内容重复实现；另外，采用生物发酵提取苦马豆素，不仅是菌丝体中含有苦马豆素，培养液中也含有大量的苦马豆素，而该发明的工艺只涉及菌丝体中苦马豆素的提取，确丢掉了培养液中苦马豆素的提取，使提取苦马豆素的效率降低。

发明内容

针对上述现有技术中存在的缺陷和不足，本发明的目的在于，提供一种绿僵菌发酵提纯苦马豆素的工艺，该工艺使苦马豆素原材料来源更为便利，有利于工厂化批量生产，使生产成本大幅度降低，最终为促进苦马豆素在抗肿瘤药物及免疫增强剂等方面的产业化提供物质保障。

实现上述本发明目的的技术方案是一种绿僵菌发酵提纯苦马豆素的工艺，该工艺是将从中国农业科学院微生物菌种保存中心保存的标准菌株—绿僵菌(Metarrhizium anisopliae CCTCC No.M93049D)通过生物发酵，使提取所得到的原材料(菌丝体和培养液)中苦马豆素得以富集，再经过D101大孔树脂和硅胶柱层析、梯度分段升华等技术获得苦马豆素纯品。

本发明的生物发酵法提纯苦马豆素工艺，具体包括下列步骤：

1)绿僵菌菌株的保存与传代：将绿僵菌接种于高氏合成一号培养基(Gause’s synthetic No1)，培养4～6天，待菌种充分生长发育后，置-20℃低温冰箱保存，每1～2个月传代一次。

所述的高氏合成一号培养基的配方组成为硝酸钾1g，硫酸镁0.5g，硫酸亚铁0.01g，磷酸氢二钾0.5g，氯化钠0.5g，可溶性淀粉20g，琼脂20g，水1000ml；

2)绿僵菌接种、发酵培养及菌丝体和培养液收集：在无菌状态下，将绿僵菌接种于生物发酵用改良克氏合成I号培养基，20℃～25℃通气发酵培养10～ 14天。收集菌丝体和培养液，干燥，备用；

所述改良克氏合成I号培养基的配方组成为：可溶性淀粉10g，糊精10g，硝酸钾2g，磷酸氢二钾2g，氯化钠2g，硫酸镁0.05g，碳酸钙0.02g，硫酸亚铁0.01g，酪蛋白0.3g，DL-赖氨酸0.1g，水1000ml；

3)菌丝体中苦马豆素的提取：

①菌丝体总浸膏提取：称取菌丝体，置超声循环提取机，加6～10倍量(重量体积比)的乙醇，20KHz超声波室温处理4次，每次0.5～1小时，收集乙醇提取液并分离残留物，收集的提取液减压回收溶剂，得到菌丝体总浸膏；

②苦马豆素粗品提取；上述得到的菌丝体总浸膏，先用3倍量(重量体积比)1moL/L盐酸溶解浸膏，滤去不溶物，得到酸水液。将酸水液用浓氨水调pH至9～10，然后用饱和正丁醇反复萃取4～6次，减压回收溶剂得到苦马豆素粗品。

③苦马豆素纯品提取：称取苦马豆素粗品，按1∶1的比例(重量比)拌等量柱层析用硅胶，挥干研成细粉末，硅胶柱层析分离，乙酸乙酯—乙醇(1∶4，体积比)洗脱，采用薄层色谱技术监测合并含苦马豆素部分，最后经90～95℃油浴减压梯度升华得到苦马豆素纯品。

4)发酵液中苦马豆素的提取：发酵液经脱水、浓缩、脱糖、脱蛋白、超声波裂解细胞等前处理得到的浓缩水溶液，通过D101大孔树脂收集蒸馏水洗脱部分，浓缩得到苦马豆素粗品，然后经硅胶柱层析和减压梯度升华得到苦马豆素纯品。

所述的薄层色谱监测技术是硅胶GF254薄层板点样，氯仿∶甲醇∶氨水∶水(70∶26∶2∶2，体积比)或乙醇∶乙酸乙酯(2∶1，4∶1，体积比)上行法展开，

以下通过表1来说明本发明与现有技术相比的优点：

表1绿僵菌生物发酵提取苦马豆素工艺与现有技术对比性试验

具有以下几个优点：

①菌种的来源和质量有保障

本发明专利所使用的绿僵菌菌株是从中国农业科学院微生物菌种保存中心购买的标准菌株—绿僵菌，是经过中国农业科学院微生物菌种保存中心鉴定的。而“豆类丝核菌7-3(代号)生物发酵提纯苦马豆素工艺”专利所公开的豆类丝核菌7-3菌株只是一个代号，未经过国家权威机构鉴定。

②节约植物资源，不破坏草地植被

本发明专利采用生物发酵技术提取苦马豆素，不需采集大量疯草类植物(棘豆属和黄芪属)，不破坏草地植被，有利于生态保护，可彻底解决“疯草中苦马豆素的提纯工艺”专利所存在的草地疯草资源最终匮乏问题。

③提取率高、成本低，产品纯度达≥98％。

本发明专利所用的试剂，如工业酒精，乙酸乙酯，正丁醇毒性很低，达到国家环保要求，利用绿僵菌发酵系统生产并提纯苦马豆素，使苦马豆素原材料来源更为便利，有利于工厂化批量生产，使生产成本大幅度降低，最终为促进苦马豆素在抗肿瘤药物及免疫增强剂等方面的产业化提供物质保障。

附图说明

图1为发酵生产苦马豆素工艺流程图。

图2为本发明提取的苦马豆素紫外(UV)光谱图。

图3为本发明提取的苦马豆素的红外(IR)光谱图。

图4为本发明提取的苦马豆素的质谱(MS)图。

图5为本发明提取的苦马豆素的氢谱(¹HNMR)图谱。

图6为本发明提取的苦马豆素的碳谱(¹³CNMR)图谱。

以下结合附图和发明人给出的具体对比试验例以及对本发明工艺制备的产品的具体指标检测数据来进一步的说明本发明的有益效果。

具体实施方式

试验例1从菌丝体和发酵培养液中苦马豆素提取的稳定性试验

1、菌丝体中苦马豆素的提取率

由于不同批次的发酵培养，使得菌丝体和发酵液中产生的苦马豆素量也有差异。采用本发明技术进行了不同批次的放大发酵培养条件下菌丝体中苦马豆素的提纯，提取结果见表2。菌丝体中苦马豆素纯品的平均提取率为30.2mg/kg。

表2菌丝体中苦马豆素提取结果

2、发酵液中苦马豆素的提取率

由于不同批次的发酵培养，使得菌丝体和发酵液中产生的苦马豆素量也有差异。采用本发明技术进行了不同批次的放大发酵培养条件下发酵液中苦马豆素的提纯，提取结果见表3。发酵液中苦马豆素纯品的平均提取率为7.4mg/L。

表3发酵液中苦马豆素提取结果

3、用本发明的工艺提取的苦马豆素纯品的光谱数据及技术指标

①苦马豆素紫外(UV)光谱数据：UVλmax∶289(log4.67)，249(log3.83)(见图2)。

②苦马豆素红外(IR)光谱数据：IRmax(KBr，cm^-1)：3423(O-H)，2943，2891(C-H)，2828～2724(Bohlmann带)，1072(C-O)吸收峰(见图3)。

③苦马豆素GC光谱数据：苦马豆素分子结构中含有羟基，与单糖结构相似，因此GC直接进样不出峰，所以要进行GC分析必须首先制备成硅醚衍生物。苦马豆素用100μl吡啶溶解，用100μlBSTFA+TMCS(99:1)室温处理30min，形成TMS衍生物。在0.32mm×30m SE-30毛细管柱(具注入柱)进行气相色谱。柱温从120℃逐渐升高至300℃，5℃/min，13.77min出峰。

④苦马豆素质谱(MS)光谱数据：EI-MS m/e∶173(M⁺)，155(M-H₂O)，138(M-H₂O-OH)，115，113(基峰)，96，84，72，43(母核裂解碎片峰)(图4)。

⑤苦马豆素氢谱(¹HNMR)和碳谱(¹³CNMR)光谱数据：¹HNMR(400M，D₂O，ppm)：

δ4.340(m，J＝2.0and8.0Hz，H-2)，δ4.245(dd，J＝4.0and5.6Hz，H-1)，δ3.792(td，J＝4.4and10.4Hz，H-8)，δ2.896(m，H-5eq)，δ2.868(dd，J＝2.0and8.0Hz，H-3eq)，δ2.543(dd，J＝8.0and11.2Hz，H-3ax)，δ2.031(m，H-7eq)，δ1.945(m，H-8a)，δ1.918(m，J＝3.6and12.8Hz，H-5ax)，δ1.708(br，d，J＝13.6Hz，H-6eq)，δ1.504(qt，J＝4and13.2Hz，H-6ax)，δ1.228(qd，J＝4and12.8Hz，H-7ax)(见图5)；¹³CNMR(400M，D₂O，ppm)：δ75.1(C-2)，δ72.0(C-1)，δ71.4(C-8)，δ68.7(C-8a)，δ62.9(C-3)，δ54.0(C-5)，δ34.8(C-7)，δ25.5(C-6)(见图6)。

苦马豆素白色针状结晶，分子量为173，熔点144～145℃，纯度≥98％。UV、IR、GC、MS、NMR光谱数据与苦马豆素标准光谱数据完全吻合。

表4苦马豆素的技术性能指标

下面通过发明人给出的具体实施例来进一步说明本发明的提取工艺。

实施例1

1)绿僵菌菌株的保存与传代：将绿僵菌接种于高氏合成一号培养基培养基，培养4天，待菌种充分生长发育后，置-20℃低温冰箱保存，每1个月传代一次。

所述的高氏合成一号培养基的配方组成为硝酸钾1g，硫酸镁0.5g，硫酸亚铁0.01g，磷酸氢二钾0.5g，氯化钠0.5g，可溶性淀粉20g，琼脂20g，水1000ml。

2)将绿僵菌在无菌状态下，接种于2L生物发酵用改良克氏合成I号培养基，25℃通气培养14天，收集菌丝体125g和培养液2L，干燥，备用。

所述改良克氏合成I号培养基的配方组成为：可溶性淀粉10g，糊精10g，硝酸钾2g，磷酸氢二钾2g，氯化钠2g，硫酸镁0.05g，碳酸钙0.02g，硫酸亚铁0.01g，酪蛋白0.3g，DL-赖氨酸0.1g，水1000ml。

3)菌丝体中苦马豆素的提纯，按下列工艺进行：

①准确称取菌丝体125g置入95％工业酒精溶液1250mL，20KHz超声波室温处理4次，每次1小时，收集乙醇提取液并分离残留物。收集的提取液减压回收溶剂，得到菌丝体总浸膏25g，出膏率为20％。

②总浸膏25g先用3倍量1moL/L盐酸溶解浸膏，滤去不溶物，得到酸水液。将酸水液用浓氨水调pH至10，然后用饱和正丁醇反复萃取6次，减压回收溶剂得到苦马豆素粗品2.5g。

③将所得苦马豆素粗品拌等量柱层析用硅胶，挥干研成细粉末，硅胶柱层析分离，乙酸乙酯—乙醇(1:4，体积比)洗脱，每5mL收集一份，薄层色谱技术监测合并含苦马豆素部分。最后经90～95℃油浴减压梯度升华得到苦马豆素纯品3.8mg，菌丝体中苦马豆素的提取率为30.4mg/kg。

所述的薄层色谱监测技术是硅胶GF254薄层板点样，氯仿:甲醇:氨水:水(70:26:2:2，体积比)或乙醇:乙酸乙酯(2:1，4:1，体积比)上行法展开，双氧水/10％醋酐/Ehrlich’s试剂喷雾显色。

4)发酵液中苦马豆素的提取：

2L发酵液先经脱水、浓缩、脱糖、脱蛋白、超声波裂解细胞等前处理，然后浓缩到0.6L。通过D101大孔树脂收集蒸馏水洗脱部分，浓缩得到苦马豆素粗品7.5g。粗品经硅胶柱层析分离和梯度升华得到苦马豆素纯品15.2mg(纯度≥98％)。发酵液中苦马豆素的提取率为7.6mg/L。具体工艺流程见(图1)。

共获苦马豆素纯品19mg。

实施例2

1)绿僵菌菌株的保存与传代：将绿僵菌接种于高氏合成一号培养基培养基，培养5天，待菌种充分生长发育后，置-20℃低温冰箱保存，每45天传代一次；

2)绿僵菌在无菌状态下，接种于5L生物发酵用改良克氏合成I号培养基， 23℃通气培养12天，收集菌丝体312g和培养液5L，干燥，备用。

3)菌丝体中苦马豆素的提纯，按下列工艺进行：

①准确称取菌丝体312g置入95％工业酒精溶液3000mL，20KHz超声波室温处理4次，每次0.5小时，收集乙醇提取液并分离残留物。收集的提取液减压回收溶剂，得到菌丝体总浸膏62g，出膏率为19.87％。

②总浸膏62g先用3倍量1moL/L盐酸溶解浸膏，滤去不溶物，得到酸水液。将酸水液用浓氨水调pH至9，然后用饱和正丁醇反复萃取6次，减压回收溶剂得到苦马豆素粗品6.1g。

③将所得苦马豆素粗品拌等量柱层析用硅胶，挥干研成细粉末，硅胶柱层析分离，乙酸乙酯—乙醇(1:4，体积比)洗脱，每15mL收集一份，薄层色谱技术监测合并含苦马豆素部分。最后经90～95℃油浴减压梯度升华得到苦马豆素纯品9.3mg(纯度≥98％)。菌丝体中苦马豆素的提取率为30mg/kg。

4)发酵液中苦马豆素的提取

5L发酵液先经脱水、浓缩、脱糖、脱蛋白、超声波裂解细胞等前处理，然后浓缩到1.6L。通过D101大孔树脂收集蒸馏水洗脱部分，浓缩得到苦马豆素粗品18.7g。粗品经硅胶柱层析分离和梯度升华得到苦马豆素纯品36mg(纯度≥ 98％)。发酵液中苦马豆素的提取率为7.2mg/L。

共获苦马豆素纯品45.3mg。

实施例3

1)绿僵菌菌株的保存与传代：将绿僵菌接种于高氏合成一号培养基培养基，培养6天，待菌种充分生长发育后，置-20℃低温冰箱保存，每60天传代一次；

2)将绿僵菌在无菌状态下，接种于10L生物发酵用改良克氏合成I号培养基，20℃通气培养10天，收集菌丝体625g和培养液10L，干燥，备用。

3)菌丝体中苦马豆素的提纯，按下列工艺进行：

①准确称取菌丝体625g置入95％工业酒精溶液6300mL，20KHz超声波室温处理4次，每次0.5小时，收集乙醇提取液并分离残留物。收集的提取液减压回收溶剂，得到菌丝体总浸膏125g，出膏率为20％。

②总浸膏125g先用3倍量1moL/L盐酸溶解浸膏，滤去不溶物，得到酸水液。将酸水液用浓氨水调pH至9，然后用饱和正丁醇反复萃取6次，减压回收溶剂得到苦马豆素粗品12.3g。

③将所得苦马豆素粗品拌等量柱层析用硅胶，挥干研成细粉末，硅胶柱层析分离，乙酸乙酯—乙醇(1:4，体积比)洗脱，每30mL收集一份，薄层色谱技术监测合并含苦马豆素部分。最后经90～95℃油浴减压梯度升华得到苦马豆素纯品18.7mg(纯度≥98％)。菌丝体中苦马豆素的提取率为29.9mg/kg。

4)发酵液中苦马豆素的提取：

10L发酵液先经脱水、浓缩、脱糖、脱蛋白、超声波裂解细胞等前处理，然后浓缩到3L。通过D101大孔树脂收集蒸馏水洗脱部分，浓缩得到苦马豆素粗品38.4g。粗品经硅胶柱层析分离和梯度升华得到苦马豆素纯品74mg(纯度≥98％)。发酵液中苦马豆素的提取率为7.4mg/L。

共获苦马豆素纯品92.7mg。

Claims

1.一种绿僵菌发酵提纯苦马豆素的工艺，其特征在于，包括下列步骤：

1)绿僵菌菌株的保存与传代：将绿僵菌接种于高氏合成一号培养基，培养4～6天，待菌种充分生长发育后，置-20℃低温冰箱保存，每1～2个月传代一次；

2)绿僵菌接种、发酵培养及菌丝体和培养液收集：在无菌状态下，将绿僵菌接种于生物发酵用改良克氏合成I号培养基，20℃～25℃通气发酵培养10～14天，收集菌丝体和培养液，干燥，备用；

3)菌丝体中苦马豆素的提取：

①菌丝体总浸膏提取：称取菌丝体，置超声循环提取机，加6～10倍量的工业酒精，20KHz超声波室温处理4次，每次0.5～1小时，收集乙醇提取液并分离残留物，收集的提取液减压回收溶剂，得到菌丝体总浸膏；

②苦马豆素粗品提取；上述得到的菌丝体总浸膏，先用3倍量1moL/L盐酸溶解浸膏，滤去不溶物，得到酸水液，将酸水液用浓氨水调pH至9～10，然后用饱和正丁醇反复萃取4～6次，减压回收溶剂得到苦马豆素粗品；

③苦马豆素纯品提取：称取苦马豆素粗品，按1∶1的比例(重量比)拌等量柱层析用硅胶，挥干研成细粉末，硅胶柱层析分离，乙酸乙酯∶乙醇1∶4，(体积比)洗脱，采用薄层色谱技术监测合并含苦马豆素部分，最后经90～95℃油浴减压梯度升华得到苦马豆素纯品；

4)发酵液中苦马豆素的提取：发酵液经脱水、浓缩、脱糖、脱蛋白、超声波裂解细胞等前处理得到的浓缩水溶液，通过D101大孔树脂收集蒸馏水洗脱部分，浓缩得到苦马豆素粗品，然后经硅胶柱层析和减压梯度升华得到苦马豆素纯品；

所述的薄层色谱监测技术是硅胶GF254薄层板点样，氯仿∶甲醇∶氨水∶水70∶26∶2∶2，(体积比)或乙醇∶乙酸乙酯2∶1或4∶1，(体积比)上行法展开，双氧水/10％醋酐/Ehrlich’s试剂喷雾显色。