CN114480526B - 一种疯草内生真菌（U.oxytropis）中苦马豆素的提取方法 - Google Patents
一种疯草内生真菌（U.oxytropis）中苦马豆素的提取方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及天然药物化学处理领域，具体涉及一种疯草内生真菌(U.oxytropis)中苦马豆素的提取方法，包括以下步骤：(1)将疯草内生真菌制备成菌悬液，培养；(2)步骤(1)的菌悬液培养结束后，抽滤，漂洗，烘干，研磨破壁，收集干粉；(3)称取步骤(2)收集的干粉转移至离心管中，加入甲醇，提取，离心，收集上清液，蒸干，复溶，过滤，稀释；所述的提取方法苦马豆素的产率达到220μg/g，相较于现有技术获得了显著的提高，且所述的方法工艺条件简单、安全，成本低、易于工业化生产，为微生物发酵产苦马豆素的开发利用提供了依据，拓展了苦马豆素产品的原料资源，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及天然药物化学处理领域，具体涉及一种疯草内生真菌(U.oxytropis)中苦马豆素的提取方法。
背景技术
疯草(1ocoweed)是含苦马豆素(swainsonine，SW)并可引起动物典型疯草中毒神经症状和病理学变化的棘豆属(Oxytropis)和黄芪属(Astragalus)有毒植物的统称。动物采食后会引起神经系统疾病“疯草病(Localism)”或“绵羊猝狙(Peastruck)”。早在1984年，TulsianiDR等首次证明疯草的毒性物质主要是苦马豆素。毒理学研究表明，苦马豆素可抑制哺乳动物细胞内溶酶体α-甘露糖苷酶和高尔基体甘露糖苷酶Ⅱ的活性，引起细胞内低聚糖代谢和糖蛋白合成障碍，导致细胞空泡变性和组织器官功能紊乱。正当人们苦恼该如何降低疯草给牧民带来的损失时，学者发现苦马豆素在一定情况下，可作为有用的治疗药物，其中包括免疫调节剂、肿瘤转移及扩散抑制剂、抗病毒和细胞保护剂等。
目前，苦马豆素纯品因植物提取周期长、效率低和人工合成工艺复杂、纯化难度大等原因，导致苦马豆素价格极其昂贵，高达1400元/mg，严重制约着苦马豆素作为药物的深入研究。国内外学者也从豆类丝核菌及金龟子绿僵菌发酵产物中检测到苦马豆素。研究证明豆类丝核菌自然干燥菌丝体中苦马豆素含量达到12.3mg/g～29.9mg/g，金龟子绿僵菌干燥菌丝体和发酵液中苦马豆素含量分别为2.26mg/g和11.21mg/L。这些系列研究为进一步拓宽苦马豆素的来源，特别是利用微生物发酵生产苦马豆素成为一种可能。
以甘肃棘豆中分离鉴定的疯草内生真菌(U.oxytropis)为研究对象，利用微生物发酵生产苦马豆素，具有提取利用的价值，以期为今后疯草内生真菌(U.oxytropis)发酵生产苦马豆素工艺优化及其次级代谢产物活性研究提供理论基础。
发明内容
本发明的目的就是针对微生物发酵生产苦马豆素，提供了一种操作简单、安全，成本低、有效成分含量和得率高的疯草内生真菌中苦马豆素的提取方法。
为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：一种疯草内生真菌(U.oxytropis)中苦马豆素的提取方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：
(1)将疯草内生真菌(U.oxytropis)制备成菌悬液，在无菌环境下连续培养；
(2)步骤(1)的菌悬液培养结束后，抽滤，漂洗，烘干，研磨破壁，收集干粉；
(3)称取步骤(2)收集的干粉转移至离心管中，向离心管中加入甲醇，超声提取，离心，收集上清液，上清液在水浴锅上蒸干，后加入甲醇复溶，过滤至离心管中，用甲醇稀释；
上述方法从疯草内生真菌(U.oxytropis)中提取苦马豆素的含量通过以下公式得到：
Y＝210.56+1.11A+4.17B-7.2C-0.54D-2.78AB+5.81AC-1.39AD+3.97BC+4.99BD+2.29CD-15.49A2-12.63B2-18.12C2-16.65D2
式中，Y代表苦马豆素提取量，A代表提取时间，B代表提取温度，C代表甲醇中的甲酸浓度，D代表料液比。
优选的，所述的提取时间为20-120min，所述的提取温度为30-80℃，所述的甲醇中的甲酸浓度为0-6％，所述的料液比为1:10-1:35g/mL。
优选的，所述的提取时间为90min、提取温度为41℃、甲醇中的甲酸浓度为0.8％、料液比为1:25。
优选的，步骤(1)所述的菌悬液的通过以下方法制备：疯草内生真菌(U.oxytropis)接种于PDA培养基，置25℃恒温培养箱培养30d至复苏，用接菌环挑取菌丝于无菌组织研磨器中，加无菌水研磨制成菌悬液。
优选的，步骤(1)所述的连续培养为：将菌悬液转移至装有150mL灭菌马铃薯葡萄糖水的300mL锥形瓶中，用透气封口膜包好瓶口，放入27℃，130r/min恒温摇床中，连续培养24d。
优选的，步骤(2)所述的抽滤使用的是滤纸；漂洗采用的是超纯水；研磨为液氮研磨。
优选的，步骤(3)所述的离心，收集上清液需要重复三次；过滤采用的是0.22μm有机相针式滤器。
优选的，步骤(3)所述的稀释使用的是质谱级甲醇，稀释倍数为40倍。
优选的，所述的疯草内生真菌(U.oxytropis)分离自甘肃棘豆。
本发明的第二目的是提供所述的提取方法在制备苦马豆素中的应用。
本发明的有益效果为：本发明提供了一种疯草内生真菌(U.oxytropis)中苦马豆素的提取方法，所述的提取苦马豆素的产率达到220μg/g，相较于现有技术获得了显著的提高，且所述的方法工艺条件简单、安全，成本低、易于工业化生产，为微生物发酵产苦马豆素的开发利用提供了依据，拓展了苦马豆素产品的原料资源，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1单因素实验结果
其中，A.提取时间对苦马豆素提取量影响B.提取温度对苦马豆素提取量影响C.甲酸浓度对苦马豆素提取量影响D.料液比对苦马豆素提取量影响
图2提取时间和超声温度对苦马豆素提取率影响的响应曲面和等高线
图3提取时间和甲酸浓度对苦马豆素提取率影响的响应曲面和等高线
图4提取时间和料液比对苦马豆素提取率影响的响应曲面和等高线
图5提取温度和甲酸浓度对苦马豆素提取率影响的响应曲面和等高线
图6提取温度和料液比对苦马豆素提取率影响的响应曲面和等高线
图7甲酸浓度和料液比对苦马豆素提取率影响的响应曲面和等高线
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的描述说明，但以下实例仅用来详细说明本发明，并不是对本发明范围的限制。以下实例中所涉及的仪器设备、试剂、试验方法，如无特别说明，均为常规方法。
以下实施例中的疯草内生真菌(U.oxytropis)分离自甘肃棘豆。
以下实施例中的甲酸浓度是指溶剂甲醇中的甲酸浓度。
实施例1：疯草内生真菌(U.oxytropis)中的苦马豆素提取方法
将疯草内生真菌(U.oxytropis)接种于PDA培养基，置25℃恒温培养箱培养30d至复苏。用接菌环挑取菌丝于无菌组织研磨器中，加无菌水研磨制成菌悬液备用；吸取500μL菌悬液转移于装有150mL灭菌马铃薯葡萄糖水的300mL锥形瓶中，共培养32瓶，用透气封口膜包好瓶口，放入27℃，130r/min恒温摇床中，连续培养24d。培养结束后，用滤纸对发酵后的菌丝球进行抽滤，并用超纯水漂洗3次，然后将抽滤后的菌丝球转入玻璃平皿内，置于45℃烘箱中烘干至质量无变化。烘干后的菌丝放入研钵中，用液氮研磨快速破壁磨成干粉统一收集备用。
称取0.2g菌丝干粉转移至15mL离心管中，向离心管中加入6mL的甲醇，60℃超声提取40min，3500rpm离心5min，收集上清液，此步骤重复三次。合并三次的上清液在70℃的水浴锅上蒸干，后加入5mL甲醇复溶，经0.22μm有机相针式滤器过滤后转移至10mL离心管中，然后用质谱级甲醇稀释40倍后转入进样瓶中备用，待测。
采用超高效液相色谱-质谱联用(UPLC-MS/MS)技术测定疯草内生真菌(U.oxytropis)菌中苦马豆素含量。精密称取苦马豆素标准品1mg，用质谱级甲醇配制成100μg/mL的标准品储备液。再用质谱级甲醇逐级稀释，制成质量浓度分别为350、300、200、150、100、50ng/mL的系列溶液用以制作标准曲线，得回归方程Y＝258907X+3381050(R2＝0.9991)。结果表明，苦马豆素质量浓度在50～350ng/mL时线性关系良好。
实施例2：单因素实验
以苦马豆素得率为评价指标，分别考察提取时间、提取温度、溶剂中甲酸浓度、料液比4个参数对苦马豆素得率的影响，每个因素设定6个水平进行单因素实验。试验设计如下：
①提取时间的比较：溶剂甲醇中的甲酸浓度为0，料液比为1:30g/mL，提取温度为60℃，提取时间分别设置为20，40，60，80，100及120min；
②提取温度的比较：溶剂甲醇中的甲酸浓度为0，提取时间为40min，料液比为1:30g/mL，提取温度分别设定为30，40，50，60，70及80℃；
③溶剂甲醇中的甲酸浓度的比较：料液比1:30g/mL，提取温度60℃，提取时间40min，溶剂甲醇中的甲酸浓度分别设定为0，0.5％，1％，2％，4％及6％；
④料液比的比较：溶剂甲醇中的甲酸浓度为0，提取温度为60℃，提取时间40min，料液比分别设定为1:10，1:15，1:20，1:25，1:30及1:35g/mL；每组实验重复3次，取平均值，提取液按1.3中方法进行处理，测定苦马豆素含量。
在其他因素不变的条件下，提取时间对苦马豆素提取量的影响如图1A所示，可知在时间为80min时苦马豆素提取量最高；提取温度对苦马豆素提取量的影响如图1B所示，温度为40℃时苦马豆素提取量最高；甲酸浓度对苦马豆素提取量的影响如图1C所示，甲酸浓度为1％苦马豆素提取量最高；料液比对苦马豆素提取量的影响如图1D所示，可知在料液比为1:25处苦马豆素提取量最高。
实施例3：模型建立
1.响应面设计
根据单因素实验结果选择提取时间(A)、提取温度(B)、甲酸浓度(C)、料液比(D)4个因素作为变量，利用Design-Expert8.0.6软件，以-1、0、1代表变量水平，进行响应面设计的四因素三水平响应面实验，独立变量的真实值与编码水平见表1。
表1试验因素与水平
精密称取5份各0.2g样品，按照修正后提取工艺条件提取苦马豆素，按照实施例1中实验步骤处理提取液的供试品溶液，按照实施例2中方法测定苦马豆素含量，计算苦马豆素提取率。
2.Box-Behnken试验与结果
通过Box-Behnken软件获得试验方案如表2所示共29组，每组做3个重复并测定其提取液中苦马豆素含量，计算平均值填入表2中，利用Box-Behnken软件对其进行分析。
3.模型建立与方差分析
利用Design-Expert8.0.6软件对试验方案和试验结果进行多元线性回归拟合分析，得到苦马豆素含量与各因素间相互关系的回归方程如下，方差分析结果见表3。
Y＝210.56+1.11A+4.17B-7.2C-0.54D-2.78AB+5.81AC-1.39AD+3.97BC+4.99BD+2.29CD-15.49A2-12.63B2-18.12C2-16.65D2
式中，Y代表苦马豆素提取量，A代表提取时间，B代表提取温度，C代表甲酸浓度，D代表料液比。
表2试验与结果
表3响应曲面二次模拟方差分析
由表3可知SW提取模型的P＜0.05，表明该回归模型具有显著性，因此用此模型对SW的提取工艺进行分析试验是合理的。由F值大小可推断出影响苦马豆素提取量的因素从大到小为C，B，A，D，也可以看出A2、B2、C2、及D2对响应值的影响极显著(P＜0.01)
4.响应面分析
模型的响应曲面及其等高线见图2～图7。6组图直观地反映了各因素对响应值的影响。
通过响应面软件Box-Behnken分析，使用数学回归模型优化数据，得到超声辅助提取疯草内生真菌(U.oxytropis)中苦马豆素的最佳提取工艺参数为：提取时间89.66min、提取温度41.36℃、甲酸浓度0.81％、料液比1:24.96，预测苦马豆素提取率为211.504μg/g。考虑到实验实际情况将提取工艺参数修正为：提取时间90min、提取温度41℃、甲酸浓度0.8％、料液比1:25。
5.工艺验证试验
按照实施例1中实验步骤制备菌丝干粉，称取0.2g菌丝干粉转移至15mL离心管中，按优化后的条件(提取时间90min、提取温度41℃、甲酸浓度0.8％、料液比1:25)进行提取，在此条件下重复测定5次。测定苦马豆素的含量，其平均值为220.5721μg/g，其RSD为2.02％(见表4)。
表4工艺验证试验结果
在次生代谢产物的提取过程中，提取方法、提取溶剂的种类、提取时间、提取次数、提取温度、溶剂的浓度、料液比等都会对获得提取物的量产生影响。单因素结果显示随着时间、温度、甲酸浓度及料液比的增加，苦马豆素提取量先增加再降低。但当因素间相互影响时，在利用响应面法优化出的提取工艺测定了疯草内生真菌(U.oxytropis)中苦马豆素含量，并在根据实际情况修正后测得疯草内生真菌(U.oxytropis)中苦马豆素含量为220.5721μg/g，与模拟预测值211.504μg/g相差不大，表明基于响应曲面法所得的优化提取工艺参数准确可靠，具有较好的稳定性。
综上所述，本发明提供了一种疯草内生真菌(U.oxytropis)中苦马豆素的提取方法，所述的提取苦马豆素的产率达到220μg/g，相较于现有技术获得了显著的提高，且所述的方法工艺条件简单、安全，成本低、易于工业化生产，为微生物发酵产苦马豆素的开发利用提供了依据，拓展了苦马豆素产品的原料资源，具有广阔的应用前景。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种疯草内生真菌(U.oxytropis)中苦马豆素的提取方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：
(1)将疯草内生真菌(U.oxytropis)制备成菌悬液，在无菌环境下连续培养；
(2)步骤(1)的菌悬液培养结束后，抽滤，漂洗，烘干，研磨破壁，收集干粉；
(3)称取步骤(2)收集的干粉转移至离心管中，向离心管中加入甲醇，超声提取，离心，收集上清液，上清液在水浴锅上蒸干，后加入甲醇复溶，过滤至离心管中，用甲醇稀释；
上述方法从疯草内生真菌(U.oxytropis)中提取苦马豆素的含量通过以下公式得到：
Y＝210.56+1.11A+4.17B-7.2C-0.54D-2.78AB+5.81AC-1.39AD+3.97BC+4.99BD+2.29CD-15.49A2-12.63B2-18.12C2-16.65D2
式中，Y代表苦马豆素提取量，A代表提取时间，B代表提取温度，C代表甲醇中的甲酸浓度，D代表料液比；
所述的提取时间为90min、提取温度为41℃、甲醇中的甲酸浓度为0.8％、料液比为1:25。
2.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(1)所述的菌悬液的通过以下方法制备：疯草内生真菌(U.oxytropis)接种于PDA培养基，置25℃恒温培养箱培养30d至复苏，用接菌环挑取菌丝于无菌组织研磨器中，加无菌水研磨制成菌悬液。
3.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(1)所述的连续培养为：将菌悬液转移至装有150mL灭菌马铃薯葡萄糖水的300mL锥形瓶中，用透气封口膜包好瓶口，放入27℃，130r/min恒温摇床中，连续培养24d。
4.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(2)所述的抽滤使用的是滤纸；漂洗采用的是超纯水；研磨为液氮研磨。
5.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(3)所述的离心，收集上清液需要重复三次；过滤采用的是0.22μm有机相针式滤器。
6.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(3)所述的稀释使用的是质谱级甲醇，稀释倍数为40倍。
7.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述的疯草内生真菌(U.oxytropis)分离自甘肃棘豆。
8.如权利要求1-7任一项所述的提取方法在制备苦马豆素中的应用。
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1396263A (zh) * | 2002-05-24 | 2003-02-12 | 杨凌大农生物技术有限公司 | 生物发酵提纯苦马豆素工艺 |
| CN101100682A (zh) * | 2006-07-07 | 2008-01-09 | 西北农林科技大学 | 绿僵菌发酵提纯苦马豆素的工艺 |
| CN109609568A (zh) * | 2019-01-30 | 2019-04-12 | 中国医学科学院药用植物研究所 | 一种采用固体发酵法制备苦马豆素的方法 |
| WO2019119992A1 (zh) * | 2017-12-21 | 2019-06-27 | 德州学院 | 一株银杏内生真菌及其代谢产物产品和应用 |
-
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1396263A (zh) * | 2002-05-24 | 2003-02-12 | 杨凌大农生物技术有限公司 | 生物发酵提纯苦马豆素工艺 |
| CN101100682A (zh) * | 2006-07-07 | 2008-01-09 | 西北农林科技大学 | 绿僵菌发酵提纯苦马豆素的工艺 |
| WO2019119992A1 (zh) * | 2017-12-21 | 2019-06-27 | 德州学院 | 一株银杏内生真菌及其代谢产物产品和应用 |
| CN109609568A (zh) * | 2019-01-30 | 2019-04-12 | 中国医学科学院药用植物研究所 | 一种采用固体发酵法制备苦马豆素的方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 不同因素对疯草内生真菌合成苦马豆素的影响;张蕾蕾等;畜牧兽医学报;第46卷(第1期);163-173 * |
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