CN109609568A - 一种采用固体发酵法制备苦马豆素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种采用固体发酵法制备苦马豆素的方法，涉及真菌次生代谢产物分离提纯技术领域，所述方法包括：固体培养产苦马豆素的植物内生菌，将所得发酵产物以含水有机溶剂提取后依次采用石油醚、乙酸乙酯和碱性水饱和正丁醇溶液进行萃取，得到碱性正丁醇层；对碱性正丁醇层进行硅胶柱层析和液相色谱制备，从而得到苦马豆素纯品。本发明所述方法相对于现有的苦马豆素提取方法缩短了提取时间、节约提取成本，并且所制得的苦马豆素纯度可达到99％。克服了现有技术获得苦马豆素纯品的成本高、时间长、难度大的问题。

Description

一种采用固体发酵法制备苦马豆素的方法

技术领域

本发明涉及真菌次生代谢产物分离提纯技术领域，尤其涉及一种采用固体发酵法制备苦马豆素的方法。

背景技术

真菌次生代谢产物是新药研发中活性先导化合物的重要来源。自19世纪以来，美国西部边疆以及我国西北等广大草原地区的牲畜会患有一种神经系统机能紊乱的慢性中毒病，中毒家畜表现出流涎、瘫痪、不育、流产、体重下降，严重的发生死亡，造成巨大的经济损失。然而幕后黑手却是家畜们食用了臭名昭著的“疯草”，即豆科黄芪属和棘豆属有毒植物的统称，是世界范围内危害草原畜牧业发展的主要毒草。1982年Molyneux等认为吲哚里西啶类生物碱苦马豆素(Swainsonine，SW)即是疯草的主要毒性成分，它能引起牲畜神经毒性反应，同时具有抗癌活性，在肿瘤细胞转移抑制和免疫激活方面也有疗效。随着SW活性研究深入，其药用价值也备受重视，已成为近来筛选新型抗肿瘤药物的热点，其开发运用前景一片光明。但是目前市场上苦马豆素纯品达到每毫克1000元，解决SW来源问题已是迫在眉睫。

关于苦马豆素来源有三种途径，一是从植物中分离，曹光荣等(1989)、黄有德等(1992)、童德文(2001)等分别从黄花棘豆，甘肃棘豆以及变异黄芪中分离出苦马豆素，但是SW在植物体中含量较低，植物资源有限，再加上植物提取分离技术繁琐，耗时长、效率低，导致SW单纯从植物中获得较为困难，也制约了对其药用研究的进度。二是通过人工合成苦马豆素，美国化学家Yasuda(1984)、Bennett(1989)和我国科学院院士周维善先后对苦马豆素人工合成进行了研究。虽然SW结构式简单，由于4个手性碳原子的存在，加大手性全合成难度，增加一系列立体构象不同的异构体，使之分离难度加大，合成步骤繁琐，产率低下。三是从微生物发酵中获取，Pryor.B，etal(2009)和我国学者余永涛等研究发现疯草内普遍存在能够产生SW的内生真菌即Undifilumoxytropis(棘豆波状牙管蠕孢菌)，该类真菌是疯草中SW产生的主要因素。林福呈等(2003)认为微生物发酵生产天然活性物质具有成本低、可控性高、生产周期短等优点，利用产SW真菌发酵生产苦马豆素，也是解决其来源的一条重要途径。

中国专利CN1396263A研究了生物发酵提纯苦马豆素工艺，其所用产苦马豆素的豆类丝核菌7-3菌株仅是代号并没有菌株的具体特性、标准以及品质鉴定，同领域的普通技术人员无法按说明书进行内容重复实现，除此之外该生物发酵仅仅涉及从液体培养的菌丝体中提取苦马豆素，菌丝体用量巨大，浪费材料，降低苦马豆素提取率。

中国专利CN101100682B研究了绿僵菌发酵提纯苦马豆素的工艺，主要是从菌丝体和发酵液中分离提纯苦马豆素，材料损耗大，提取率低，并采用梯度升华的方法获取苦马豆素的纯度并不高。

中国专利CN101200745A研究了白僵菌发酵生产苦马豆素的工艺，主要是使用液体发酵的方法获得菌丝体，菌丝体所需样品量庞大，因为菌丝体烘干之后重量少，发酵成本大，后期也仅是采用梯度升华的方法获得苦马豆素，升华过程也有杂质存在，故所得纯度不高。

可以看出，目前微生物发酵制备苦马豆素的方法提取率低，所得苦马豆素纯度不高，提取时间长，并且成本高，极大的限制了苦马豆素的研究和应用。

发明内容

本发明为了克服现有苦马豆素制备方法时间长、成本高、纯度低的缺陷，提供了一种采用固体发酵法制备苦马豆素的方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种采用固体发酵法制备苦马豆素的方法，包括以下步骤：

(1)以产苦马豆素的植物内生真菌进行固体发酵，得到发酵产物；

(2)以含水的有机溶剂对所得发酵产物进行提取，固液分离得到提取液，去除有机溶剂，得到总提取物；

(3)以水稀释总提取物后，以石油醚萃取，分离得到第一水层；

(4)以乙酸乙酯萃取第一水层，分离得到第二水层；

(5)调节第二水层的pH值至9～10后，以碱性水饱和正丁醇溶液萃取，分离得到碱性正丁醇层；

(6)以硅胶吸附碱性正丁醇层，再将吸附后的硅胶以复合有机溶剂作为洗脱液进行梯度洗脱，收集各馏分；

(7)以薄层色谱分析各馏分，合并含有苦马豆素的馏分作为分离物；

(8)以制备型液相色谱对分离物进行纯化，回收所得纯化产物的有机溶剂，得到苦马豆素。

优选的，步骤(1)中，所述产苦马豆素的植物内生真菌包括豆类丝核菌属、金龟子绿僵菌属、埃里格孢属或疯草植物内生真菌属中产苦马豆素的植物内生真菌。

优选的，步骤(1)中，所述固体发酵的固体培养基选自PDA固体培养基、大米培养基、麦麸培养基、燕麦培养基或或蛋白胨培养基。

优选的，步骤(2)中，所述含水的有机溶剂中，除水外还包括乙酸乙酯、丙酮、甲醇、乙醇和二氯甲烷中的一种或多种。

优选的，步骤(2)中，所述含水的有机溶剂为体积百分浓度50％～95％的乙醇水溶液。

优选的，步骤(2)中，所述提取的方法包括浸泡提取、超声提取或加热回流提取。

优选的，所述步骤(3)中石油醚萃取的次数为2～4次，所述步骤(4)中乙酸乙酯萃取的次数为2～4次。

优选的，步骤(6)中，所述复合有机溶剂中包括石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮、环己烷、正己烷或者碱性正丁醇中的两种或两种以上。

优选的，步骤(6)中，所述复合有机溶剂由氨水饱和二氯甲烷和甲醇组成。

优选的，步骤(8)中，所述制备型液相色谱的色谱柱为反向硅胶半制备柱，流动相为甲醇水溶液。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

(1)本发明首次采用固体发酵的方式制备苦马豆素，相对于现有的液体培养法所需的原材料更少，提取率可以达到170mg/kg左右，比现有苦马豆素提取方法的提取率提高2倍以上；

(2)本发明根据苦马豆素的性质以及微生物发酵的特点，选择含水的有机溶剂对发酵产物进行提取，再根据所得总提取物的特点进行萃取，以富集含有苦马豆素的部分；

(3)本发明所述方法制备得到的苦马豆素纯度可达到99％，与现有技术常用的梯度升华方式相比，本发明采用液相色谱法制备更容易得到苦马豆素纯品，克服了梯度升华容易引入其他与苦马豆素沸点相近杂质而无法获得纯度高的苦马豆素的问题；

(4)本发明所述方法相对于现有技术省略了液体发酵方式所涉及的脱水、浓缩、脱糖、脱蛋白、超声波裂解细胞等前处理，缩短了分离提取时间，节约了提取成本。

附图说明

图1为实施例2中以二氯甲烷-甲醇为展开剂的薄层色谱板；

图2为实施例2中以氨水饱和二氯甲烷-甲醇为展开剂的薄层色谱板。

具体实施方式

本发明提供了一种采用固体发酵法制备苦马豆素的方法，包括以下步骤：

(1)以产苦马豆素的植物内生真菌进行固体发酵，得到发酵产物；

(2)以含水的有机溶剂对所得发酵产物进行提取，固液分离得到提取液，去除有机溶剂，得到总提取物；

(3)以水稀释总提取物后，以石油醚萃取，分离得到第一水层；

(4)以乙酸乙酯萃取第一水层，分离得到第二水层；

(5)调节第二水层的pH值至9～10后，以碱性水饱和正丁醇溶液萃取，分离得到碱性正丁醇层；

(6)以硅胶吸附碱性正丁醇层，再将吸附后的硅胶以复合有机溶剂作为洗脱液进行梯度洗脱，收集各馏分；

(7)以薄层色谱分析各馏分，合并含有苦马豆素的馏分作为分离物；

(8)以制备型液相色谱对分离物进行纯化，回收所得纯化产物的有机溶剂，得到苦马豆素。

本发明采用固体培养基对产苦马豆素的植物内生真菌发酵，得到发酵产物。常规的液体发酵法制备苦马豆素时需要制备大量的菌丝体，原料用量大，造成了材料的浪费，并且还需要后续进行脱水、浓缩、脱糖、脱蛋白、细胞破碎等一系列处理步骤，成本高、提取率低并且时间长。本发明首次提出以固体培养基对产苦马豆素的植物内生菌进行发酵培养，省却了液体发酵法的一系列前处理步骤，节省成本和时间。

在本发明中，所述固体培养基优选的选自PDA固体培养基、大米培养基、麦麸培养基、燕麦培养基或或蛋白胨培养基；更优选为大米培养基或PDA固体培养基。

在本发明中，所述产苦马豆素的植物内生真菌包括但不限于豆类丝核菌属、金龟子绿僵菌属、埃里格孢属或疯草植物内生真菌属中产苦马豆素的植物内生真菌。在本发明的具体实施例中，采用购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心的标准疯草植物内生真菌Alternariasect.Undifilumoxytropis(CICC2492)。

在本发明中，所述产苦马豆素的植物内生真菌在接种固体培养基前，优选的先进行活化；在本发明中，所述活化时采用的培养基优选为PDA固体培养基。将所述活化的、处于对数期的产苦马豆素的植物内生真菌接种于固体培养基上进行发酵即可，本发明先进行活化是为了扩增菌种。

在本发明中，所述发酵的温度优选为22～28℃，更优选为25℃。在本发明中，所述发酵的时间优选为40～65d，更优选为45～55d。

得到发酵产物后，本发明以含水的有机溶剂对所得发酵产物进行提取，固液分离得到提取液，去除有机溶剂，得到总提取物。

在本发明中，所述含水的有机溶剂中，除水外优选的还包括乙酸乙酯、丙酮、甲醇、乙醇和二氯甲烷中的一种或多种；更优选为体积百分浓度50％～95％的乙醇水溶液，最优选为75％的乙醇水溶液。本发明通过试验表明，采用含水的有机溶剂作为溶剂的提取率，比不含水的有机溶剂更高，这主要是由于苦马豆素极性较大。在本发明的具体实施方式中，总提取物与体积百分浓度50％～95％的乙醇水溶液的体积比优选为1:2～6；更优选的，总提取物与体积百分浓度75％的乙醇水溶液按照体积比1:2～4混合。

在本发明中，所述提取的方法包括浸泡提取、超声提取或加热回流提取；当选择浸泡提取、超声提取时，提取温度优选为22～28℃，更优选为25℃；当选择加热回流提取时，所述加热的问题优选为90～110℃，更优选为100℃。在本发明中，所述提取的次数优选为2～4次，更优选为3次。

本发明对固液分离的方式没有特殊限定，采用本领域已知的方式即可，例如离心、过滤等。本发明对去除有机溶剂的方式没有特殊限定，采用本领域已知的方式即可，例如旋转蒸发等。

得到总提取物后，本发明以水稀释总提取物后，以石油醚萃取，分离得到第一水层。本发明先采用石油醚进行萃取的目的是为了去除总提取物中脂肪酸等极性小的杂质，本发明分离的第一水层是去除了脂肪酸等极性小杂质后的苦马豆素提取物。

在本发明中，所述水稀释总提取物时，水和总提取物的质量比优选为1：10～20；更优选为1:15。

在本发明中，所述石油醚与水稀释后的总提取物优选的按照等比例进行混合。在本发明中，所述石油醚萃取的次数优选为2～4次，更优选为3次。

得到第一水层后，本发明以乙酸乙酯萃取第一水层，分离得到第二水层。本发明采用乙酸乙酯萃取的目的是为了去除第一水层中有机酸等中等极性的杂质。本发明选择依次采用石油醚和乙酸乙酯进行萃取，是基于极性大小的顺序，石油醚极性小于乙酸乙酯，因而在萃取时先采用石油醚去除杂质，再以乙酸乙酯去除杂质，是因为本来提取的苦马豆素极性是偏大的，如果一上来就用中等极性的乙酸乙酯来萃取的话，会导致后期萃取的苦马豆素含有小极性杂质未除去，按照极性大小原则目的就是为了层层除去总浸膏中的杂质，使得最后富集的苦马豆素含量高。

在本发明中，所述第一水层和乙酸乙酯优选的按照等体积混合。在本发明中，所述乙酸乙酯萃取的次数优选为2～4次，更优选为3次。

得到第二水层后，本发明调节第二水层的pH值至9～10后，以碱性水饱和正丁醇溶液萃取，分离得到碱性正丁醇层。苦马豆素为吲哚里西啶类生物碱，易溶于极性大的溶液中，正丁醇极性较大并且制成水饱和正丁醇溶液后便于后期萃取，有利于提高萃取率；同时，本发明将第二水层调节至碱性，基于相似相溶原理使苦马豆素尽可能多的溶解在碱性正丁醇层中。本发明提取得到的总提取物中含有大量的极性物质，由于正丁醇与水不互溶，采用碱性水饱和正丁醇溶液进行萃取可得到杂质少的萃取部分。

在本发明中，pH值9～10的第二水层与碱性水饱和正丁醇溶液优选的按照等体积比混合萃取。在本发明中，所述碱性水饱和正丁醇萃取的次数优选为2～4次，更优选为3次。本发明对如何制备碱性水饱和正丁醇溶液无特殊限定。本发明对如何调节第二水层的pH值无特殊限定，例如以氢氧化钠溶液进行调节。

得到碱性正丁醇层后，本发明以硅胶吸附碱性正丁醇层，再将吸附后的硅胶以复合有机溶剂作为洗脱液进行梯度洗脱，收集各馏分。本发明采用硅胶柱层析法对分离的碱性正丁醇层进行分离纯化。

在本发明中，为了提高吸附效率，优选的在硅胶吸附碱性正丁醇层前去除其中的正丁醇。本发明对如何去除正丁醇无特殊限定，例如旋转蒸发等。

在本发明中，所述硅胶优选的包括拌样硅胶和分离硅胶；更优选的，所述拌样硅胶的规格优选为60～100目；更优选的，所述分离硅胶的规格优选为100～200目。

在本发明中，所述复合有机溶剂优选的包括石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮、环己烷、正己烷或者碱性正丁醇中的两种或两种以上；更优选的包括石油醚-乙酸乙酯、环己烷-丙酮、二氯甲烷和甲醇、正己烷-乙酸乙酯或正己烷-丙酮；最优选的由氨水饱和二氯甲烷和甲醇组成。

试验表明，苦马豆素极性大，易吸附在硅胶柱上，需选用含水的洗脱液进行快速洗脱，因而选用氨水饱和的二氯甲烷-甲醇作为洗脱液进行梯度洗脱时，其分离效果和纯度更高。二氯甲烷-甲醇、乙酸乙酯-乙醇这两种洗脱剂虽然能够分离苦马豆素，但是均存在硅胶薄层板上存在拖尾现象，使用氨水饱和二氯甲烷-甲醇溶液作为洗脱剂时既可以实现样品的洗脱，拖尾现象也不严重，其分离效果更佳。

在本发明的具体实施例中，采用氨水饱和二氯甲烷和甲醇依次按照体积比1:0、5:1、3:1、1:1和0:1的梯度进行洗脱。

收集得到各馏分后，本发明以薄层色谱分析各馏分，合并含有苦马豆素的馏分作为分离物。本发明利用薄层色谱法对洗脱馏分进行分析的目的是为了得到洗脱中含有苦马豆素的馏分，将这些馏分合并能够减少物质损失，提高得率。

在本发明中，所述薄层色谱分析时的展开剂优选的与前述步骤的洗脱剂组成相同。在本发明的具体实施例中，所述薄层色谱分析时的展开剂为氨水饱和二氯甲烷-甲醇，其体积比优选为3:1。

在本发明中，所述薄层色谱分析的显色剂优选为质量体积百分比10％的硫酸乙醇溶液、碘化秘钾溶液；所述显色剂还可采用质量体积百分比3％的双氧水溶液、质量体积百分比10％的无水乙醇醋酸酐溶液和Ehrlich’s试剂的组合。

得到分离物后，本发明以制备型液相色谱对分离物进行纯化，回收所得纯化产物的有机溶剂，得到苦马豆素。本发明以制备型液相色谱进行纯化，相对于常规梯度升华的纯化方法所得苦马豆素纯度更高。虽然苦马豆素是已知化合物，但在分离过程中往往纯度都达不到标准品的要求，梯度升华仅是根据沸点不同达到苦马豆素，容易引入其他与苦马豆素沸点接近的杂质，造成纯度不高。本发明采用液相色谱进行制备能够显著提高所得苦马豆素的纯度，达到99％的纯度。

在本发明中，所述制备型液相色谱的色谱柱优选为反向硅胶半制备柱。在本发明中，所述制备型液相色谱的流动相优选为甲醇水溶液；所述甲醇水溶液的浓度更优选为体积百分浓度20％～30％；在本发明中，所述流动相的流速优选为1.5～2.5mL/min。

在本发明中，所述制备型液相色谱在进样前优选的对所述分离物进行溶解、离心和过滤。在本发明中，所述溶解优选的采用色谱纯的甲醇。

现有研究对苦马豆素的绝对构型的鉴定少之又少，本发明为了确定制备得到的苦马豆素纯度，采用化学反应的方法对其纯度进行了鉴定；所述化学反应的方法优选为Mosher法。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1)菌种来源

所用真菌来源于疯草植物内生真菌Alternariasect.Undifilumoxytropis，由中国工业微生物菌种保藏管理中心提供。

2)菌种培养与发酵

PDA固体培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g和琼脂15～20g，煮沸后加蒸馏水至1000mL。

大米培养基：大米60g，蒸馏水80mL，121℃高压灭菌30分钟后备用。

首先，将购买得到的菌种接种在PDA固体培养基上进行活化，将生长良好的部分菌种分别保存于4℃和-20℃冰箱，以待后续需要，剩余在PDA固体培养基上长好的菌种留待进一步固体发酵。

其次，将生长在PDA培养基上、处于对数期的真菌切成小块儿，在超净工作台中接种到大米培养基上，共发酵7瓶(锥形瓶规格为500mL)。室温静置发酵50天。

3)菌种发酵完成后，得到固体发酵产物，按照发酵产物与体积百分浓度75％的乙醇水溶液按照体积比1:3混合，常温下浸泡24h，过滤；重复上述步骤3次，将所得滤液合并后旋转蒸发至无醇味，得到总提取物20g(浸膏)

按照总提取物与水的质量比1:15的比例进行稀释，所得稀释提取液以等体积的石油醚萃取3次，每次弃去石油醚层，得到第一水层。对第一水层以等体积的乙酸乙酯萃取3次，每次弃去乙酸乙酯层，得到第二水层。

向第二水层中加入氢氧化钠颗粒少许，调节pH值至9；pH＝9的第二水层以等体积的碱性(pH＝9)水饱和正丁醇溶液萃取3次，每次弃去水层，得到碱性正丁醇层。旋转蒸发回收碱性正丁醇层中的正丁醇，得到碱性正丁醇部位萃取物(1.4g)。

4)将碱性正丁醇部位萃取物与60～100目的拌料硅胶等质量比混合，用100～200目的普通柱层析硅胶(样品：硅胶重量比为1：20)进行分离。以氨水饱和二氯甲烷-甲醇(1:0，5:1，3:1，1:1，0:1)梯度洗脱，4mL一瓶的接馏分，共计得到160瓶。

再结合薄层(薄层预制板，展开剂为氨水饱和二氯甲烷-甲醇或者二氯甲烷-甲醇，体积比为5:1～1:1)分析，每个梯度洗脱3～6个柱体积，合并后共得到5个亚组分(Fr-A，Fr-B，Fr-C，Fr-D，Fr-E，根据编号从小到大顺序，所述亚组分为顺序流出)，其中确定组分Fr-B(31mg)为待进一步制备纯化的目标组分。

5)液相色谱制备

首先将购买的苦马豆素标准品(纯度99％)用色谱甲醇溶解，离心，过0.22μm滤膜后待用，液相色谱条件30％甲醇水溶液，得到色谱图在13～19min有宽峰出现，根据实验经验可能为苦马豆素的出峰带，于是将实例中所得组分Fr-B用相同条件分析，有相似峰形出现。后经过液相条件摸索，使用液相色谱条件25％甲醇-水对组分Fr-B进行制备，收集tR为18～21min的色谱峰，收集完成后，用旋转蒸发仪蒸干制备液，得到苦马豆素纯品3.4mg(纯度高于99％，与纯度为99％标品比对)。蒸干样品后取出用于核磁和质谱测试。注意。蒸干样品时，水浴锅温度不得超过45℃。通过高分辨质谱、一维核磁、二维核磁和Mosher反应的手段鉴定了苦马豆素结构。

苦马豆素：无色透明(甲醇溶液)，HR-ESI-MS(m/z174.1130[M+H]⁺，calcd.174.1118)。

液相色谱制备条件：样品室温度：20℃，柱温：35℃，色谱柱：AcquityUPLCBEHC18(2.1×100mm，1.7μm，WatersCorp.，Milford，USA)，流动相：色谱甲醇/水，色谱方法：25％乙腈/75％水，流速：2mL/min

进样量：30微升。

①核磁共振法(1D和2DNMR)进一步确认苦马豆素结构：

¹H-NMR(500MHz，DMSO)δ3.97(1H，br.dd，J＝6.5，4.5Hz，H-1)，4.03(1H，br.t，J＝7.5Hz，H-2)，2.74(1H，dd，J＝10.0，2.0Hz，H-3a)，2.20(1H，dd，J＝10.0，7.5Hz，H-3b)，2.78(1H，br.d，J＝10.5Hz，H-5a)，1.70(1H，br.dt，J＝13.0，2.5Hz，H-5b)，1.52(1H，overlapped，H-6a)，1.40(1H，dtt，J＝13.0，13.0，4.0Hz，H-6b)，1.85(1H，m，H-7a)，1.02(1H，dtd，J＝13.0，11.5，4.5Hz，H-7b)，3.56(1H，br.t，J＝11.5Hz，H-8)，1.52(1H，overlapped，H-8a)，4.23(1H，br.s，OH-1)，4.60(1H，br.s，OH-2)，4.45(1H，br.s，OH-8)

¹³C-NMR(125MHz，DMSO)δ69.6(C-1)，68.5(C-2)，62.4(C-3)，51.9(C-5)，23.9(C-6)，33.8(C-7)，65.3(C-8)，74.4(C-8a)。

②本发明首次通过Mosher反应的方法确定了苦马豆素的绝对构型，具体步骤如下：

首先将得到的苦马豆素纯品各取1mg分别置于4mL样品瓶中，并标记R和S，置于真空干燥器中，干燥24小时。然后将标记为R和S的苦马豆素中各自加入0.2mL的氘代吡啶，待样品溶解于吡啶中后再分别向标记为R的苦马豆素瓶中加入试剂(R)-MTPA-Cl(5μL，26.5μmol)，向S中加入试剂(S)-MTPA-Cl(5μL，26.5μmol)，各自混匀后，封口，待反应完全后再用半制备液相制备出成酯产物。手性试剂(R)-MTPA-Cl与苦马豆素生成S型酯，液相制备条件为88％甲醇-水，收集t_R为12min色谱峰，并用旋转蒸发仪旋干制备液得到反应物S型酯；手性试剂(S)-MTPA-Cl与苦马豆素生成R型酯，液相制备条件为88％甲醇-水，收集t_R为12.5min色谱峰，并用旋转蒸发仪旋干制备液得到反应物R型酯。最后通过核磁测试确定出苦马豆素的立体构型。

本次试验通过固体发酵7瓶苦马豆素的发酵物，得到纯度为99％的苦马豆素3.4mg，即20g总提取物中分离得到了3.4mg苦马豆素纯品，提取率大致为170mg/kg。与背景技术涉及的现有微生物发酵法制备苦马豆素的专利相比，本发明所述方法省略了离子树脂和由浴升华的步骤，发酵所需原料较少，比中国专利CN101200745A(搜索最新专利)中提取率80.9mg/Kg高2倍以上。表明本发明所述方法在简化提取步骤后，提取率明显提高，成本预估也是降低。

实施例2洗脱剂的对比

1、薄层板样品点选择：取市售的苦马豆素标准品(纯度99％以上)、按照实施例1的步骤1)～3)制备得到的碱性正丁醇部位萃取物作为含苦马豆素的粗品；

2、将苦马豆素标准品以色谱甲醇溶解，配制成浓度为5mg/ml的苦马豆素标准溶液(标品1)；将含苦马豆素的粗品分别以色谱甲醇溶解，分别两个配制成浓度为10mg/ml的苦马豆素粗品溶液，记为粗品1和粗品2；

3、硅胶薄层板选择GF254型号的，用玻璃刀裁剪成合适大小，以待上样。选用干净的0.3mm毛细吸管各自吸取标品1、粗品1、粗品2分别点至准备好的薄层板上，准备好两块已点好样的薄层板。

4、展开剂的准备及薄层显色：

(1)二氯甲烷-甲醇

先选用5mL移液管用洗耳球吸取3mL二氯甲烷于展开缸中，再用1mL移液管吸取1mL甲醇于展开缸中，将两者混匀进行预饱和，预饱和5min后再将点好样品的薄层板用镊子夹取放入预饱和的展开缸中，待混合溶液跑至薄层板前沿(上行划线处)，再用镊子取出薄层板，待溶剂自然挥干后，在254nm紫外灯下观察现象并用手机拍照记录，最后再用显色三步法对薄层板显色，观察显色效果，即分离情况。

(2)氨水饱和二氯甲烷-甲醇

先选用5mL移液管用洗耳球吸取3.8mL二氯甲烷加入展开缸中，再吸取1.3mL甲醇加入展开缸，再用0.2mL移液管吸取0.2mL氨水和0.2mL去离子水加入展开缸中混匀，使得溶剂预饱和，预饱和5min后再将点好样品的薄层板用镊子夹取放入预饱和后的展开缸中，待混合溶液跑至薄层板前沿，再用镊子取出薄层板，待溶剂自然挥干后，在254nm紫外灯下观察现象并用手机拍照记录，最后再用显色三步法对薄层板显色，观察显色效果，即分离情况。

不同溶剂的显色效果如图1和图2所示，普通二氯甲烷-甲醇展开剂对样品展开效果不好，拖尾严重，在紫外线下显示含苦马豆素粗品2展开效果不佳，不适合后期的过柱子的洗脱剂；标品在普通溶剂中展开的效果也不好，拖尾严重，所以在分离的时候样品易挂在柱子上，使得分离效果差，但是氨水饱和二氯甲烷-甲醇的洗脱剂可以将苦马豆素快速洗脱下来，在快速分离过程中，可以多富集苦马豆素，也提高了分离效果。因此在硅胶柱环节选用洗脱剂为氨水饱和二氯甲烷-甲醇的分离效果更佳。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种采用固体发酵法制备苦马豆素的方法，包括以下步骤：

(1)以产苦马豆素的植物内生真菌进行固体发酵，得到发酵产物；

(2)以含水的有机溶剂对所得发酵产物进行提取，固液分离得到提取液，去除有机溶剂，得到总提取物；

(3)以水稀释总提取物后，以石油醚萃取，分离得到第一水层；

(4)以乙酸乙酯萃取第一水层，分离得到第二水层；

(5)调节第二水层的pH值为9～10后，以碱性水饱和正丁醇溶液萃取，分离得到碱性正丁醇层；

(6)以硅胶吸附碱性正丁醇层，再将吸附后的硅胶以复合有机溶剂作为洗脱液进行梯度洗脱，收集各馏分；

(7)以薄层色谱分析各馏分，合并含有苦马豆素的馏分作为分离物；

(8)以制备型液相色谱对分离物进行纯化，回收所得纯化产物的有机溶剂，得到苦马豆素。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述产苦马豆素的植物内生真菌包括豆类丝核菌属、金龟子绿僵菌属、埃里格孢属或疯草植物内生真菌属中产苦马豆素的植物内生真菌。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述固体发酵的固体培养基选自PDA固体培养基、大米培养基、麦麸培养基、燕麦培养基或蛋白胨培养基。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述含水的有机溶剂中，除水外还包括乙酸乙酯、丙酮、甲醇、乙醇和二氯甲烷中的一种或多种。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述含水的有机溶剂为体积百分浓度50％～95％的乙醇水溶液。

6.根据权利要求1、4或5所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述提取的方法包括浸泡提取、超声提取或加热回流提取。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中石油醚萃取的次数为2～4次，所述步骤(4)中乙酸乙酯萃取的次数为2～4次。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(6)中，所述复合有机溶剂中包括石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮、环己烷、正己烷或者碱性正丁醇中的两种或两种以上。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(6)中，所述复合有机溶剂由氨水饱和二氯甲烷和甲醇组成。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(8)中，所述制备型液相色谱的色谱柱为反向硅胶半制备柱，流动相为甲醇水溶液。