CN114480526A - 一种疯草内生真菌(U.oxytropis)中苦马豆素的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及天然药物化学处理领域,具体涉及一种疯草内生真菌(U.oxytropis)中苦马豆素的提取方法,包括以下步骤:(1)将疯草内生真菌制备成菌悬液,培养;(2)步骤(1)的菌悬液培养结束后,抽滤,漂洗,烘干,研磨破壁,收集干粉;(3)称取步骤(2)收集的干粉转移至离心管中,加入甲醇,提取,离心,收集上清液,蒸干,复溶,过滤,稀释;所述的提取方法苦马豆素的产率达到220μg/g,相较于现有技术获得了显著的提高,且所述的方法工艺条件简单、安全,成本低、易于工业化生产,为微生物发酵产苦马豆素的开发利用提供了依据,拓展了苦马豆素产品的原料资源,具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及天然药物化学处理领域,具体涉及一种疯草内生真菌(U.oxytropis)中苦马豆素的提取方 法。
背景技术
疯草(1ocoweed)是含苦马豆素(swainsonine,SW)并可引起动物典型疯草中毒神经症状和病理学变化的 棘豆属(Oxytropis)和黄芪属(Astragalus)有毒植物的统称。动物采食后会引起神经系统疾病“疯草病 (Localism)”或“绵羊猝狙(Peastruck)”。早在1984年,Tulsiani D R等首次证明疯草的毒性物质主要是苦马豆 素。毒理学研究表明,苦马豆素可抑制哺乳动物细胞内溶酶体α-甘露糖苷酶和高尔基体甘露糖苷酶Ⅱ的活 性,引起细胞内低聚糖代谢和糖蛋白合成障碍,导致细胞空泡变性和组织器官功能紊乱。正当人们苦恼该 如何降低疯草给牧民带来的损失时,学者发现苦马豆素在一定情况下,可作为有用的治疗药物,其中包括 免疫调节剂、肿瘤转移及扩散抑制剂、抗病毒和细胞保护剂等。
目前,苦马豆素纯品因植物提取周期长、效率低和人工合成工艺复杂、纯化难度大等原因,导致苦马 豆素价格极其昂贵,高达1400元/mg,严重制约着苦马豆素作为药物的深入研究。国内外学者也从豆类丝 核菌及金龟子绿僵菌发酵产物中检测到苦马豆素。研究证明豆类丝核菌自然干燥菌丝体中苦马豆素含量达 到12.3mg/g~29.9mg/g,金龟子绿僵菌干燥菌丝体和发酵液中苦马豆素含量分别为2.26mg/g和11.21 mg/L。这些系列研究为进一步拓宽苦马豆素的来源,特别是利用微生物发酵生产苦马豆素成为一种可能。
以甘肃棘豆中分离鉴定的疯草内生真菌(U.oxytropis)为研究对象,利用微生物发酵生产苦马豆素, 具有提取利用的价值,以期为今后疯草内生真菌(U.oxytropis)发酵生产苦马豆素工艺优化及其次级代谢 产物活性研究提供理论基础。
发明内容
本发明的目的就是针对微生物发酵生产苦马豆素,提供了一种操作简单、安全,成本低、有效成分含 量和得率高的疯草内生真菌中苦马豆素的提取方法。
为了实现上述目的,本发明提供的技术方案为:一种疯草内生真菌(U.oxytropis)中苦马豆素的提取 方法,其特征在于,所述的方法包括以下步骤:
(1)将疯草内生真菌(U.oxytropis)制备成菌悬液,在无菌环境下连续培养;
(2)步骤(1)的菌悬液培养结束后,抽滤,漂洗,烘干,研磨破壁,收集干粉;
(3)称取步骤(2)收集的干粉转移至离心管中,向离心管中加入甲醇,超声提取,离心,收集上清液, 上清液在水浴锅上蒸干,后加入甲醇复溶,过滤至离心管中,用甲醇稀释;
上述方法从疯草内生真菌(U.oxytropis)中提取苦马豆素的含量通过以下公式得到:
Y=210.56+1.11A+4.17B-7.2C-0.54D-2.78AB+5.81AC-1.39AD+3.97BC+4.99BD+2.29CD-15.49A2-12.63B 2-18.12C2-16.65D2
式中,Y代表苦马豆素提取量,A代表提取时间,B代表提取温度,C代表甲醇中的甲酸浓度,D代 表料液比。
优选的,所述的提取时间为20-120min,所述的提取温度为30-80℃,所述的甲醇中的甲酸浓度为0-6%, 所述的料液比为1:10-1:35g/mL。
优选的,所述的提取时间为90min、提取温度为41℃、甲醇中的甲酸浓度为0.8%、料液比为1:25。
优选的,步骤(1)所述的菌悬液的通过以下方法制备:疯草内生真菌(U.oxytropis)接种于PDA培 养基,置25℃恒温培养箱培养30d至复苏,用接菌环挑取菌丝于无菌组织研磨器中,加无菌水研磨制成 菌悬液。
优选的,步骤(1)所述的连续培养为:将菌悬液转移至装有150mL灭菌马铃薯葡萄糖水的300mL 锥形瓶中,用透气封口膜包好瓶口,放入27℃,130r/min恒温摇床中,连续培养24d。
优选的,步骤(2)所述的抽滤使用的是滤纸;漂洗采用的是超纯水;研磨为液氮研磨。
优选的,步骤(3)所述的离心,收集上清液需要重复三次;过滤采用的是0.22μm有机相针式滤器。
优选的,步骤(3)所述的稀释使用的是质谱级甲醇,稀释倍数为40倍。
优选的,所述的疯草内生真菌(U.oxytropis)分离自甘肃棘豆。
本发明的第二目的是提供所述的提取方法在制备苦马豆素中的应用。
本发明的有益效果为:本发明提供了一种疯草内生真菌(U.oxytropis)中苦马豆素的提取方法,所述 的提取苦马豆素的产率达到220μg/g,相较于现有技术获得了显著的提高,且所述的方法工艺条件简单、 安全,成本低、易于工业化生产,为微生物发酵产苦马豆素的开发利用提供了依据,拓展了苦马豆素产品 的原料资源,具有广阔的应用前景。
附图说明
图1单因素实验结果
其中,A.提取时间对苦马豆素提取量影响B.提取温度对苦马豆素提取量影响C.甲酸浓度对苦马豆素提取 量影响D.料液比对苦马豆素提取量影响
图2提取时间和超声温度对苦马豆素提取率影响的响应曲面和等高线
图3提取时间和甲酸浓度对苦马豆素提取率影响的响应曲面和等高线
图4提取时间和料液比对苦马豆素提取率影响的响应曲面和等高线
图5提取温度和甲酸浓度对苦马豆素提取率影响的响应曲面和等高线
图6提取温度和料液比对苦马豆素提取率影响的响应曲面和等高线
图7甲酸浓度和料液比对苦马豆素提取率影响的响应曲面和等高线
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的描述说明,但以下实例仅用来详细说明本发明,并不是对本发明 范围的限制。以下实例中所涉及的仪器设备、试剂、试验方法,如无特别说明,均为常规方法。
以下实施例中的疯草内生真菌(U.oxytropis)分离自甘肃棘豆。
以下实施例中的甲酸浓度是指溶剂甲醇中的甲酸浓度。
实施例1:疯草内生真菌(U.oxytropis)中的苦马豆素提取方法
将疯草内生真菌(U.oxytropis)接种于PDA培养基,置25℃恒温培养箱培养30d至复苏。用接菌环 挑取菌丝于无菌组织研磨器中,加无菌水研磨制成菌悬液备用;吸取500μL菌悬液转移于装有150mL灭 菌马铃薯葡萄糖水的300mL锥形瓶中,共培养32瓶,用透气封口膜包好瓶口,放入27℃,130r/min恒 温摇床中,连续培养24d。培养结束后,用滤纸对发酵后的菌丝球进行抽滤,并用超纯水漂洗3次,然后 将抽滤后的菌丝球转入玻璃平皿内,置于45℃烘箱中烘干至质量无变化。烘干后的菌丝放入研钵中,用 液氮研磨快速破壁磨成干粉统一收集备用。
称取0.2g菌丝干粉转移至15mL离心管中,向离心管中加入6mL的甲醇,60℃超声提取40min,3500 rpm离心5min,收集上清液,此步骤重复三次。合并三次的上清液在70℃的水浴锅上蒸干,后加入5mL 甲醇复溶,经0.22μm有机相针式滤器过滤后转移至10mL离心管中,然后用质谱级甲醇稀释40倍后转 入进样瓶中备用,待测。
采用超高效液相色谱-质谱联用(UPLC-MS/MS)技术测定疯草内生真菌(U.oxytropis)菌中苦马豆素 含量。精密称取苦马豆素标准品1mg,用质谱级甲醇配制成100μg/mL的标准品储备液。再用质谱级甲醇 逐级稀释,制成质量浓度分别为350、300、200、150、100、50ng/mL的系列溶液用以制作标准曲线,得 回归方程Y=258907X+3381050(R2=0.9991)。结果表明,苦马豆素质量浓度在50~350ng/mL时线性关系 良好。
实施例2:单因素实验
以苦马豆素得率为评价指标,分别考察提取时间、提取温度、溶剂中甲酸浓度、料液比4个参数对苦 马豆素得率的影响,每个因素设定6个水平进行单因素实验。试验设计如下:
①提取时间的比较:溶剂甲醇中的甲酸浓度为0,料液比为1:30g/mL,提取温度为60℃,提取时间 分别设置为20,40,60,80,100及120min;
②提取温度的比较:溶剂甲醇中的甲酸浓度为0,提取时间为40min,料液比为1:30g/mL,提取温度 分别设定为30,40,50,60,70及80℃;
③溶剂甲醇中的甲酸浓度的比较:料液比1:30g/mL,提取温度60℃,提取时间40min,溶剂甲醇中 的甲酸浓度分别设定为0,0.5%,1%,2%,4%及6%;
④料液比的比较:溶剂甲醇中的甲酸浓度为0,提取温度为60℃,提取时间40min,料液比分别设定 为1:10,1:15,1:20,1:25,1:30及1:35g/mL;每组实验重复3次,取平均值,提取液按1.3中方法进行 处理,测定苦马豆素含量。
在其他因素不变的条件下,提取时间对苦马豆素提取量的影响如图1A所示,可知在时间为80min时 苦马豆素提取量最高;提取温度对苦马豆素提取量的影响如图1B所示,温度为40℃时苦马豆素提取量最 高;甲酸浓度对苦马豆素提取量的影响如图1C所示,甲酸浓度为1%苦马豆素提取量最高;料液比对苦马 豆素提取量的影响如图1D所示,可知在料液比为1:25处苦马豆素提取量最高。
实施例3:模型建立
1.响应面设计
根据单因素实验结果选择提取时间(A)、提取温度(B)、甲酸浓度(C)、料液比(D)4个因素作为 变量,利用Design-Expert 8.0.6软件,以-1、0、1代表变量水平,进行响应面设计的四因素三水平响应面 实验,独立变量的真实值与编码水平见表1。
表1试验因素与水平
精密称取5份各0.2g样品,按照修正后提取工艺条件提取苦马豆素,按照实施例1中实验步骤处理 提取液的供试品溶液,按照实施例2中方法测定苦马豆素含量,计算苦马豆素提取率。
2.Box-Behnken试验与结果
通过Box-Behnken软件获得试验方案如表2所示共29组,每组做3个重复并测定其提取液中苦马豆 素含量,计算平均值填入表2中,利用Box-Behnken软件对其进行分析。
3.模型建立与方差分析
利用Design-Expert 8.0.6软件对试验方案和试验结果进行多元线性回归拟合分析,得到苦马豆素含量 与各因素间相互关系的回归方程如下,方差分析结果见表3。
Y=210.56+1.11A+4.17B-7.2C-0.54D-2.78AB+5.81AC-1.39AD+3.97BC+4.99BD+2.29CD-15.49A2-12.63B 2-18.12C2-16.65D2
式中,Y代表苦马豆素提取量,A代表提取时间,B代表提取温度,C代表甲酸浓度,D代表料液比。
表2试验与结果
表3响应曲面二次模拟方差分析
由表3可知SW提取模型的P<0.05,表明该回归模型具有显著性,因此用此模型对SW的提取工艺 进行分析试验是合理的。由F值大小可推断出影响苦马豆素提取量的因素从大到小为C,B,A,D,也可 以看出A2、B2、C2、及D2对响应值的影响极显著(P<0.01)
4.响应面分析
模型的响应曲面及其等高线见图2~图7。6组图直观地反映了各因素对响应值的影响。
通过响应面软件Box-Behnken分析,使用数学回归模型优化数据,得到超声辅助提取疯草内生真菌(U. oxytropis)中苦马豆素的最佳提取工艺参数为:提取时间89.66min、提取温度41.36℃、甲酸浓度0.81%、 料液比1:24.96,预测苦马豆素提取率为211.504μg/g。考虑到实验实际情况将提取工艺参数修正为:提取 时间90min、提取温度41℃、甲酸浓度0.8%、料液比1:25。
5.工艺验证试验
按照实施例1中实验步骤制备菌丝干粉,称取0.2g菌丝干粉转移至15mL离心管中,按优化后的条 件(提取时间90min、提取温度41℃、甲酸浓度0.8%、料液比1:25)进行提取,在此条件下重复测定5 次。测定苦马豆素的含量,其平均值为220.5721μg/g,其RSD为2.02%(见表4)。
表4工艺验证试验结果
在次生代谢产物的提取过程中,提取方法、提取溶剂的种类、提取时间、提取次数、提取温度、溶剂 的浓度、料液比等都会对获得提取物的量产生影响。单因素结果显示随着时间、温度、甲酸浓度及料液比 的增加,苦马豆素提取量先增加再降低。但当因素间相互影响时,在利用响应面法优化出的提取工艺测定 了疯草内生真菌(U.oxytropis)中苦马豆素含量,并在根据实际情况修正后测得疯草内生真菌(U.oxytropis) 中苦马豆素含量为220.5721μg/g,与模拟预测值211.504μg/g相差不大,表明基于响应曲面法所得的优化提取工艺参数准确可靠,具有较好的稳定性。
综上所述,本发明提供了一种疯草内生真菌(U.oxytropis)中苦马豆素的提取方法,所述的提取苦马 豆素的产率达到220μg/g,相较于现有技术获得了显著的提高,且所述的方法工艺条件简单、安全,成本 低、易于工业化生产,为微生物发酵产苦马豆素的开发利用提供了依据,拓展了苦马豆素产品的原料资源, 具有广阔的应用前景。
最后应说明的是:以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,尽管参照前述实施 例对本发明进行了详细的说明,对于本领域的技术人员来说,其依然可以对前述各实施例所记载的技术方 案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、 等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种疯草内生真菌(U.oxytropis)中苦马豆素的提取方法,其特征在于,所述的方法包括以下步骤:
(1)将疯草内生真菌(U.oxytropis)制备成菌悬液,在无菌环境下连续培养;
(2)步骤(1)的菌悬液培养结束后,抽滤,漂洗,烘干,研磨破壁,收集干粉;
(3)称取步骤(2)收集的干粉转移至离心管中,向离心管中加入甲醇,超声提取,离心,收集上清液,上清液在水浴锅上蒸干,后加入甲醇复溶,过滤至离心管中,用甲醇稀释;
上述方法从疯草内生真菌(U.oxytropis)中提取苦马豆素的含量通过以下公式得到:
Y=210.56+1.11A+4.17B-7.2C-0.54D-2.78AB+5.81AC-1.39AD+3.97BC+4.99BD+2.29CD-15.49A2-12.63B2-18.12C2-16.65D2
式中,Y代表苦马豆素提取量,A代表提取时间,B代表提取温度,C代表甲醇中的甲酸浓度,D代表料液比。
2.如权利要求1所述的提取方法,其特征在于,所述的提取时间为20-120min,所述的提取温度为30-80℃,所述的甲醇中的甲酸浓度为0-6%,所述的料液比为1:10-1:35g/mL。
3.如权利要求2所述的提取方法,其特征在于,所述的提取时间为90min、提取温度为41℃、甲醇中的甲酸浓度为0.8%、料液比为1:25。
4.如权利要求1所述的提取方法,其特征在于,步骤(1)所述的菌悬液的通过以下方法制备:疯草内生真菌(U.oxytropis)接种于PDA培养基,置25℃恒温培养箱培养30d至复苏,用接菌环挑取菌丝于无菌组织研磨器中,加无菌水研磨制成菌悬液。
5.如权利要求1所述的提取方法,其特征在于,步骤(1)所述的连续培养为:将菌悬液转移至装有150mL灭菌马铃薯葡萄糖水的300mL锥形瓶中,用透气封口膜包好瓶口,放入27℃,130r/min恒温摇床中,连续培养24d。
6.如权利要求1所述的提取方法,其特征在于,步骤(2)所述的抽滤使用的是滤纸;漂洗采用的是超纯水;研磨为液氮研磨。
7.如权利要求1所述的提取方法,其特征在于,步骤(3)所述的离心,收集上清液需要重复三次;过滤采用的是0.22μm有机相针式滤器。
8.如权利要求1所述的提取方法,其特征在于,步骤(3)所述的稀释使用的是质谱级甲醇,稀释倍数为40倍。
9.如权利要求1所述的提取方法,其特征在于,所述的疯草内生真菌(U.oxytropis)分离自甘肃棘豆。
10.如权利要求1-9任一项所述的提取方法在制备苦马豆素中的应用。
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