CN106929427B - 适于药用真菌灵芝高产胞外多糖的培养基及其培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种适于药用真菌灵芝高产胞外多糖的培养基及其培养方法。所述培养基由葡萄糖、酵母浸粉、碳酸钙、维生素B1、磷酸二氢钾、蛋白胨、吐温80、硫酸锌、甘露醇、硫酸镁以及天冬氨酸组成。通过本发明培养基或方法培养的灵芝能够提取出含量高的灵芝胞外多糖，为灵芝多糖的开发、利用提供基础生产资料。
Description
技术领域
本发明涉及利用微生物获取目标产物的微生物技术，尤其涉及利用药用真菌灵芝高产胞外多糖的培养基以及基于该培养基的培养方法。
背景技术
“灵芝”在中国已经有2000多年的应用历史，但是这个真菌种类曾经被误认为是亮盖灵芝Ganoderma lucidum(Curtis.)P.Karst.多年。直到2012年，科学家基于大量样品的系统发育分析发现该种实际应为一个新种，根据汉语学名命名为灵芝Ganoderma lingzhiSheng H.Wu,Y.Cao&Y.C.Dai。
灵芝的生物活性成分十分丰富，包括多糖、甾醇、三萜、核酸、呋喃、生物碱、蛋白质、油脂、有机锗、矿物元素等，其中灵芝多糖是灵芝的关键药效成分，有广泛的生物活性，如调节免疫系统、通过增强宿主免疫调节达到抑肿瘤作用、促进体内生理代谢、通过提高氧化酶活性而清除体内自由基达到抗氧化、抗衰老目的、镇静、强心、降血糖血脂等。
然而，以前往往通过野外采集或人工栽培灵芝，生长周期长、所需条件苛刻，成分比例不稳定且易受环境因素影响，使得提取灵芝多糖远不能满足市场需求。灵芝液体发酵产物中的多糖组分主要分为发酵液胞外多糖和菌丝体胞内多糖，胞外多糖存在于发酵液中，通过离心、醇沉等方法容易得到，得率也相对较高。本发明提供了一种适于药用真菌灵芝高产胞外多糖的培养基及其培养方法，能够提高发酵液中胞外多糖的含量，为灵芝多糖的开发、利用提供基础生产资料。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种适于药用真菌灵芝高产胞外多糖的培养基。为了达成该目的，本发明对应的技术方案如下：
适于药用真菌灵芝高产胞外多糖的培养基，该培养基的成分包括：葡萄糖、酵母浸粉、维生素B1、吐温80以及天冬氨酸，这些组分由左及右按重量份的配比为(550～650):(100～110):(0.4～0.5):(90～110):(80～100)。
为了达成本发明的上述目的之一，在基于上述初始的技术方案的基础上，在某些实施例中，所述培养基的组分还由碳酸钙、磷酸二氢钾、蛋白胨、硫酸锌、甘露醇、硫酸镁组成。
为了达成本发明的上述目的之一，在基于上述初始的技术方案的基础上，在某些实施例中，所述培养基的初始pH值为5.0。
为了达成本发明的上述目的之一，在基于上述初始的技术方案的基础上，在某些实施例中，所述培养基的初始pH值为5.0。
本发明的目的之二在于提供一种适于药用真菌灵芝高产胞外多糖的培养方法。为了达成该目的，本发明对应的技术方案如下：
适于药用真菌灵芝高产胞外多糖的培养方法，所述方法所用的液体培养基是权利要求1或2或3或4所述的培养基。
为了达成本发明的上述目的之二，在基于上述初始的技术方案的基础上，在某些实施例中，所述方法所用的固体培养基由马铃薯、葡萄糖、琼脂、维生素B1、磷酸二氢钾、蛋白胨、硫酸镁组成。
为了达成本发明的上述目的之二，在基于上述初始的技术方案的基础上，在某些实施例中，所述固体培养基中各个组分按重量份的配比为3000:200:200:0.1:10:50:5。
为了达成本发明的上述目的之二，在基于上述初始的技术方案的基础上，在某些实施例中，按如下步骤进行：
a.将药用真菌灵芝于固体培养基上活化；
b.将步骤a的培养物制成种子发酵悬液；
c.采用本发明目的之一的所述培养基培养种子发酵悬液，培养一段时间后获得含所述药用真菌灵芝胞外多糖的溶液。
本发明培养基以及培养方法能够使药用真菌灵芝高产胞外多糖，为胞外多糖的获取和利用提供了高产基础。
本发明人已经在此发明内容章节总地描述了本发明的精神；以下实施例的举例是为了方便本领域普通技术人员进一步了解本发明的实施过程所进行的描述，不能理解为对本发明精神具体化的限制。
具体实施方式
以下实施例所用的菌株为灵芝(Ganoderma lingzhi)菌株Si 21，采自山东省泰安市泰山景区，寄主为栎树。
以下实施例中灵芝胞外多糖的提取如下：将所得含所述药用真菌灵芝胞外多糖的溶液经60℃真空浓缩至原体积的1/10，按浓缩液4倍体积加入预冷的无水乙醇，充分混匀后于4℃条件下醇沉静置过夜，12000rpm离心30min得沉淀。将沉淀溶解后透析48h，经冷冻干燥后加入3％(w/w)蛋白酶于42℃反应3h，冷却后加入25％(v/v)Sevag试剂[氯仿:正丁醇＝5:1(v/v)]剧烈震荡20min，于分液漏斗中静置20min，弃去下层有机相得上清液。将上清液经透析后冷冻干燥称重，即得灵芝胞外多糖，以g/L发酵液计。
以下实施例中所用多糖含量的测定方法如下：采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，以葡萄糖作为标准品。
其中，标准曲线的制作如下：准确配制0、0.2、0.4、0.8、1.0mg/mL葡萄糖标准液。分别吸取1.0mL葡萄糖标准液于10mL具塞刻度试管中，加入1.0mL 6.0％(v/v)苯酚溶液，随后快速加入4.0mL浓硫酸(与液面垂直加入，勿接触试管壁，以便于反应液充分混合)，静置10min，充分混匀后置于30℃水浴反应20min，于490nm处测定吸光值。设3个重复，求平均值。以反应体系中葡萄糖标准液的浓度为横坐标、吸光值为纵坐标作标准曲线，计算回归方程为：y＝1.867x+1.012，相关系数R2＝0.9917。
其中，多糖含量的测定如下：称取10.0mg灵芝多糖样品，溶解并定容至10.0mL。吸取1.0mL样品溶液于10mL具塞刻度试管中，按制作标准曲线的方法进行多糖含量测定。以去离子水替代样品溶液同体积的反应混合液为对照，多糖含量以培养液中葡萄糖当量计。
实施例一
配置固体培养基：马铃薯、葡萄糖、琼脂、维生素B1、磷酸二氢钾、蛋白胨、硫酸镁按重量份3000:200:200:0.1:10:50:5调配，初始pH 5.0，1×105Pa高压灭菌30min。
配置液体培养基：葡萄糖、酵母浸粉、碳酸钙、维生素B1、磷酸二氢钾、蛋白胨、吐温80、硫酸锌、甘露醇、硫酸镁以及天冬氨酸按重量份650:105:2:0.5:10:15:100:3:15:5:90调配，初始pH 5.0，1×105Pa高压灭菌30min。
将药用真菌灵芝置于固体培养基上活化，28℃恒温培养箱培养6天备用。
取250mL三角瓶分装100mL液体培养基，接种5个直径1.0cm菌饼，于恒温摇床28℃、150r/min振荡培养6天。利用内切式匀浆机以5000r/min、1min将培养物制成种子发酵悬液，充分振荡备用。将种子发酵悬液以10.0％(v/v)的接种量加入含100mL液体培养基的250mL三角瓶中，于恒温摇床28℃、150r/min振荡培养6天后得含药用真菌灵芝胞外多糖的溶液。
按本实施例的提取方法提取本实施例含药用真菌灵芝胞外多糖的溶液得本实施例灵芝胞外多糖。测定本实施例灵芝胞外多糖的含量为3.57g/L。
实施例二
配置固体培养基：马铃薯、葡萄糖、琼脂、维生素B1、磷酸二氢钾、蛋白胨、硫酸镁按重量份3000:200:200:0.1:10:50:5调配，初始pH 5.0，1×105Pa高压灭菌30min。
配置液体培养基：葡萄糖、酵母浸粉、碳酸钙、维生素B1、磷酸二氢钾、蛋白胨、吐温80、硫酸锌、甘露醇、硫酸镁以及天冬氨酸按重量份550:105:2:0.4:10:15:100:3:15:5:90调配，初始pH 5.0，1×105Pa高压灭菌30min。
将药用真菌灵芝置于固体培养基上活化，28℃恒温培养箱培养6天备用。
取250mL三角瓶分装100mL液体培养基，接种5个直径1.0cm菌饼，于恒温摇床28℃、150r/min振荡培养6天。利用内切式匀浆机以5000r/min、1min将培养物制成种子发酵悬液，充分振荡备用。将种子发酵悬液以10.0％(v/v)的接种量加入含100mL液体培养基的250mL三角瓶中，于恒温摇床28℃、150r/min振荡培养6天后得含药用真菌灵芝胞外多糖的溶液。
按本实施例的提取方法提取本实施例含药用真菌灵芝胞外多糖的溶液得本实施例灵芝胞外多糖。测定本实施例灵芝胞外多糖的含量为3.63g/L。
实施例三
配置固体培养基：马铃薯、葡萄糖、琼脂、维生素B1、磷酸二氢钾、蛋白胨、硫酸镁按重量份3000:200:200:0.1:10:50:5调配，初始pH 5.0，1×105Pa高压灭菌30min。
配置液体培养基：葡萄糖、酵母浸粉、碳酸钙、维生素B1、磷酸二氢钾、蛋白胨、吐温80、硫酸锌、甘露醇、硫酸镁以及天冬氨酸按重量份600:105:2:0.4:10:15:100:3:15:5:80调配，初始pH 5.0，1×105Pa高压灭菌30min。
将药用真菌灵芝置于固体培养基上活化，28℃恒温培养箱培养6天备用。
取250mL三角瓶分装100mL液体培养基，接种5个直径1.0cm菌饼，于恒温摇床28℃、150r/min振荡培养6天。利用内切式匀浆机以5000r/min、1min将培养物制成种子发酵悬液，充分振荡备用。将种子发酵悬液以10.0％(v/v)的接种量加入含100mL液体培养基的250mL三角瓶中，于恒温摇床28℃、150r/min振荡培养6天后得含药用真菌灵芝胞外多糖的溶液。
按本实施例的提取方法提取本实施例含药用真菌灵芝胞外多糖的溶液得本实施例灵芝胞外多糖。测定本实施例灵芝胞外多糖的含量为3.59g/L。
实施例四
配置固体培养基：马铃薯、葡萄糖、琼脂、维生素B1、磷酸二氢钾、蛋白胨、硫酸镁按重量份3000:200:200:0.1:10:50:5调配，初始pH 5.0，1×105Pa高压灭菌30min。
配置液体培养基：葡萄糖、酵母浸粉、碳酸钙、维生素B1、磷酸二氢钾、蛋白胨、吐温80、硫酸锌、甘露醇、硫酸镁以及天冬氨酸按重量份600:100:2:0.5:10:15:100:3:15:5:90调配，初始pH 5.0，1×105Pa高压灭菌30min。
将药用真菌灵芝置于固体培养基上活化，28℃恒温培养箱培养6天备用。
取250mL三角瓶分装100mL液体培养基，接种5个直径1.0cm菌饼，于恒温摇床28℃、150r/min振荡培养6天。利用内切式匀浆机以5000r/min、1min将培养物制成种子发酵悬液，充分振荡备用。将种子发酵悬液以10.0％(v/v)的接种量加入含100mL液体培养基的250mL三角瓶中，于恒温摇床28℃、150r/min振荡培养6天后得含药用真菌灵芝胞外多糖的溶液。
按本实施例的提取方法提取本实施例含药用真菌灵芝胞外多糖的溶液得本实施例灵芝胞外多糖。测定本实施例灵芝胞外多糖的含量为3.68g/L。
实施例五
配置固体培养基：马铃薯、葡萄糖、琼脂、维生素B1、磷酸二氢钾、蛋白胨、硫酸镁按重量份3000:200:200:0.1:10:50:5调配，初始pH 5.0，1×105Pa高压灭菌30min。
配置液体培养基：葡萄糖、酵母浸粉、碳酸钙、维生素B1、磷酸二氢钾、蛋白胨、吐温80、硫酸锌、甘露醇、硫酸镁以及天冬氨酸按重量份550:110:2:0.45:10:15:100:3:15:5:90调配，初始pH 5.0，1×105Pa高压灭菌30min。
将药用真菌灵芝置于固体培养基上活化，28℃恒温培养箱培养6天备用。
取250mL三角瓶分装100mL液体培养基，接种5个直径1.0cm菌饼，于恒温摇床28℃、150r/min振荡培养6天。利用内切式匀浆机以5000r/min、1min将培养物制成种子发酵悬液，充分振荡备用。将种子发酵悬液以10.0％(v/v)的接种量加入含100mL液体培养基的250mL三角瓶中，于恒温摇床28℃、150r/min振荡培养6天后得含药用真菌灵芝胞外多糖的溶液。
按本实施例的提取方法提取本实施例含药用真菌灵芝胞外多糖的溶液得本实施例灵芝胞外多糖。测定本实施例灵芝胞外多糖的含量为3.51g/L。
实施例六
配置固体培养基：马铃薯、葡萄糖、琼脂、维生素B1、磷酸二氢钾、蛋白胨、硫酸镁按重量份3000:200:200:0.1:10:50:5调配，初始pH 5.0，1×105Pa高压灭菌30min。
配置液体培养基：葡萄糖、酵母浸粉、碳酸钙、维生素B1、磷酸二氢钾、蛋白胨、吐温80、硫酸锌、甘露醇、硫酸镁以及天冬氨酸按重量份600:105:2:0.5:10:15:100:3:15:5:100调配，初始pH 5.0，1×105Pa高压灭菌30min。
将药用真菌灵芝置于固体培养基上活化，28℃恒温培养箱培养6天备用。
取250mL三角瓶分装100mL液体培养基，接种5个直径1.0cm菌饼，于恒温摇床28℃、150r/min振荡培养6天。利用内切式匀浆机以5000r/min、1min将培养物制成种子发酵悬液，充分振荡备用。将种子发酵悬液以10.0％(v/v)的接种量加入含100mL液体培养基的250mL三角瓶中，于恒温摇床28℃、150r/min振荡培养6天后得含药用真菌灵芝胞外多糖的溶液。
按本实施例的提取方法提取本实施例含药用真菌灵芝胞外多糖的溶液得本实施例灵芝胞外多糖。测定本实施例灵芝胞外多糖的含量为3.48g/L。
实施例七
配置固体培养基：马铃薯、葡萄糖、琼脂、维生素B1、磷酸二氢钾、蛋白胨、硫酸镁按重量份3000:200:200:0.1:10:50:5调配，初始pH 5.0，1×105Pa高压灭菌30min。
配置液体培养基：葡萄糖、酵母浸粉、碳酸钙、维生素B1、磷酸二氢钾、蛋白胨、吐温80、硫酸锌、甘露醇、硫酸镁以及天冬氨酸按重量份600:105:2:0.5:10:15:110:3:15:5:90调配，初始pH 5.0，1×105Pa高压灭菌30min。
将药用真菌灵芝置于固体培养基上活化，28℃恒温培养箱培养6天备用。
取250mL三角瓶分装100mL液体培养基，接种5个直径1.0cm菌饼，于恒温摇床28℃、150r/min振荡培养6天。利用内切式匀浆机以5000r/min、1min将培养物制成种子发酵悬液，充分振荡备用。将种子发酵悬液以10.0％(v/v)的接种量加入含100mL液体培养基的250mL三角瓶中，于恒温摇床28℃、150r/min振荡培养6天后得含药用真菌灵芝胞外多糖的溶液。
按本实施例的提取方法提取本实施例含药用真菌灵芝胞外多糖的溶液得本实施例灵芝胞外多糖。测定本实施例灵芝胞外多糖的含量为3.28g/L。
实施例八
配置固体培养基：马铃薯、葡萄糖、琼脂、维生素B1、磷酸二氢钾、蛋白胨、硫酸镁按重量份3000:200:200:0.1:10:50:5调配，初始pH 5.0，1×105Pa高压灭菌30min。
配置液体培养基：葡萄糖、酵母浸粉、碳酸钙、维生素B1、磷酸二氢钾、蛋白胨、吐温80、硫酸锌、甘露醇、硫酸镁以及天冬氨酸按重量份550:105:2:0.45:10:15:100:3:15:5:80调配，初始pH 5.0，1×105Pa高压灭菌30min。
将药用真菌灵芝置于固体培养基上活化，28℃恒温培养箱培养6天备用。
取250mL三角瓶分装100mL液体培养基，接种5个直径1.0cm菌饼，于恒温摇床28℃、150r/min振荡培养6天。利用内切式匀浆机以5000r/min、1min将培养物制成种子发酵悬液，充分振荡备用。将种子发酵悬液以10.0％(v/v)的接种量加入含100mL液体培养基的250mL三角瓶中，于恒温摇床28℃、150r/min振荡培养6天后得含药用真菌灵芝胞外多糖的溶液。
按本实施例的提取方法提取本实施例含药用真菌灵芝胞外多糖的溶液得本实施例灵芝胞外多糖。测定本实施例灵芝胞外多糖的含量为3.53g/L。
实施例九
配置固体培养基：马铃薯、葡萄糖、琼脂、维生素B1、磷酸二氢钾、蛋白胨、硫酸镁按重量份3000:200:200:0.1:10:50:5调配，初始pH 5.0，1×105Pa高压灭菌30min。
配置液体培养基：葡萄糖、酵母浸粉、碳酸钙、维生素B1、磷酸二氢钾、蛋白胨、吐温80、硫酸锌、甘露醇、硫酸镁以及天冬氨酸按重量份550:105:2:0.5:10:15:100:3:15:5:90调配，初始pH 5.0，1×105Pa高压灭菌30min。
将药用真菌灵芝置于固体培养基上活化，28℃恒温培养箱培养6天备用。
取250mL三角瓶分装100mL液体培养基，接种5个直径1.0cm菌饼，于恒温摇床28℃、150r/min振荡培养6天。利用内切式匀浆机以5000r/min、1min将培养物制成种子发酵悬液，充分振荡备用。将种子发酵悬液以10.0％(v/v)的接种量加入含100mL液体培养基的250mL三角瓶中，于恒温摇床28℃、150r/min振荡培养6天后得含药用真菌灵芝胞外多糖的溶液。
按本实施例的提取方法提取本实施例含药用真菌灵芝胞外多糖的溶液得本实施例灵芝胞外多糖。测定本实施例灵芝胞外多糖的含量为3.41g/L。
实施例十
配置固体培养基：马铃薯、葡萄糖、琼脂、维生素B1、磷酸二氢钾、蛋白胨、硫酸镁按重量份3000:200:200:0.1:10:50:5调配，初始pH 5.0，1×105Pa高压灭菌30min。
配置液体培养基：葡萄糖、酵母浸粉、碳酸钙、维生素B1、磷酸二氢钾、蛋白胨、吐温80、硫酸锌、甘露醇、硫酸镁以及天冬氨酸按重量份600:100:2:0.45:10:15:90:3:15:5:90调配，初始pH 5.0，1×105Pa高压灭菌30min。
将药用真菌灵芝置于固体培养基上活化，28℃恒温培养箱培养6天备用。
取250mL三角瓶分装100mL液体培养基，接种5个直径1.0cm菌饼，于恒温摇床28℃、150r/min振荡培养6天。利用内切式匀浆机以5000r/min、1min将培养物制成种子发酵悬液，充分振荡备用。将种子发酵悬液以10.0％(v/v)的接种量加入含100mL液体培养基的250mL三角瓶中，于恒温摇床28℃、150r/min振荡培养6天后得含药用真菌灵芝胞外多糖的溶液。
按本实施例的提取方法提取本实施例含药用真菌灵芝胞外多糖的溶液得本实施例灵芝胞外多糖。测定本实施例灵芝胞外多糖的含量为3.56g/L。
实施例十一
配置固体培养基：马铃薯、葡萄糖、琼脂、维生素B1、磷酸二氢钾、蛋白胨、硫酸镁按重量份3000:200:200:0.1:10:50:5调配，初始pH 5.0，1×105Pa高压灭菌30min。
配置液体培养基：葡萄糖、酵母浸粉、碳酸钙、维生素B1、磷酸二氢钾、蛋白胨、吐温80、硫酸锌、甘露醇、硫酸镁以及天冬氨酸按重量份650:100:2:0.45:10:15:100:3:15:5:90调配，初始pH 5.0，1×105Pa高压灭菌30min。
将药用真菌灵芝置于固体培养基上活化，28℃恒温培养箱培养6天备用。
取250mL三角瓶分装100mL液体培养基，接种5个直径1.0cm菌饼，于恒温摇床28℃、150r/min振荡培养6天。利用内切式匀浆机以5000r/min、1min将培养物制成种子发酵悬液，充分振荡备用。将种子发酵悬液以10.0％(v/v)的接种量加入含100mL液体培养基的250mL三角瓶中，于恒温摇床28℃、150r/min振荡培养6天后得含药用真菌灵芝胞外多糖的溶液。
按本实施例的提取方法提取本实施例含药用真菌灵芝胞外多糖的溶液得本实施例灵芝胞外多糖。测定本实施例灵芝胞外多糖的含量为3.47g/L。
通过以上实施举例，本发明之精神对于本领域普通技术人员而言已经能够清楚地掌握，所以，在本发明中未明确给出的另外的特征、优点和实施方案对于查看了本发明的本领域普通技术人员来说都是清楚的，因此，应该理解，吸取了本发明之后对本发明所作出的修饰和改进都在本专利的保护范围之内，对于在本发明的基础上作出的变劣性技术方案也属于本专利的保护范围内。
Claims (7)
1.适于药用真菌灵芝高产胞外多糖的培养基，其特征在于，所述培养基是液体培养基，用于培养活化后得灵芝真菌，该培养基的成分包括：葡萄糖、酵母浸粉、维生素B1、吐温80以及天冬氨酸，这些组分由左及右按重量份的配比为(550～650):(100～110):(0.4～0.5):(90～110):(80～100)。
2.根据权利要求1所述的适于药用真菌灵芝高产胞外多糖的培养基，其特征在于，所述培养基的组分包括碳酸钙、磷酸二氢钾、蛋白胨、硫酸锌、甘露醇、硫酸镁。
3.根据权利要求1所述的适于药用真菌灵芝高产胞外多糖的培养基，其特征在于，所述培养基的初始pH值为5.0。
4.根据权利要求2所述的适于药用真菌灵芝高产胞外多糖的培养基，其特征在于，所述培养基的初始pH值为5.0。
5.适于药用真菌灵芝高产胞外多糖的培养方法，其特征在于，按如下步骤进行：
a.将药用真菌灵芝于固体培养基上活化；
b.将步骤a的培养物制成种子发酵悬液；
c.采用如权利要求1至3任一一项所述的培养基培养种子发酵悬液，培养一段时间后获得含所述药用真菌灵芝胞外多糖的溶液。
6.根据权利要求5所述的适于药用真菌灵芝高产胞外多糖的培养方法，其特征在于，所述方法所用的固体培养基由马铃薯、葡萄糖、琼脂、维生素B1、磷酸二氢钾、蛋白胨、硫酸镁组成。
7.根据权利要求6所述的适于药用真菌灵芝高产胞外多糖的培养方法，其特征在于，所述固体培养基中各个组分按重量份的配比为3000:200:200:0.1:10:50:5。
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