CN110711212B - 黄芪-蝉拟青霉发酵菌质及其用途 - Google Patents

黄芪-蝉拟青霉发酵菌质及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种黄芪‑蝉拟青霉发酵菌质及其用途。所述发酵菌质以黄芪药材粉末作为发酵底物，蝉拟青霉作为发酵菌种，通过固体发酵制备得到。本发明的黄芪‑蝉拟青霉发酵菌质具有显著的治疗高尿酸血症和高甘油三酯血症的作用。

Description

黄芪-蝉拟青霉发酵菌质及其用途
技术领域
本发明涉及一种中药发酵菌质及其用途，具体来说，涉及黄芪-蝉拟青霉发酵菌质及其在制备治疗高尿酸血症和/或高甘油三酯血症的药物的用途。
背景技术
中药发酵是借助于酶和微生物的作用，在一定的环境条件下(如温度、湿度、空气、水分等)，使药物通过发酵过程改变其原有性能、增强或产生新的功效、扩大用药品种，以适应临床用药的需要。传统中药发酵为微生物发酵技术，是指药物经过净制或处理后，在一定的温度和湿度条件下，借助微生物和酶的催化分解作用，使药物发泡，产生黄白色霉衣的方法。由于传统中药发酵中参与发酵的菌种种类及数量会受到地理环境和季节变化的影响，而且发酵工艺过程多凭人为主观经验进行判断和控制，因此难以保证发酵中药产品的安全有效性和稳定可控性。
中药发酵已从传统的自然发酵向现代中药发酵逐渐转变。其中，后者可对发酵过程进行实时监控，针对性更强，更加有利于对中药发酵机制的深入研究。同时，新型发酵技术凭借中药材作为药性基质应用某些真菌进行固态或液态发酵，在发酵过程中真菌产生的各种酶及代谢产物使得药材的化学成分与含量都发生变化，从而起到对原药材“改性”的功能。并且这种新型双向发酵有设备平价易得、原料来源广泛、实验操作简单、发酵方法简便、经济效益高、生产周期短等诸多优点，继而在实际应用中可实现大规模产业化生产。
黄芪是常用中药，具有补气升阳、固表止汗、利水消肿等功效。关于黄芪的现代发酵研究，陆潭等(一种黄芪药渣发酵产物的抗高尿酸血症活性，江苏农业科学[J]，2013年第41卷第9期，第288-291页)报道了以灵芝作为发酵菌种、以黄芪药渣作为基质进行发酵后，得到的发酵产物具有抗高尿酸血症活性。赵崇妍等(黄芪-蝉拟青霉双向发酵体系建立及成分研究，世界中医药，2018年12月第13卷第12期，3195-3198页)建立了黄芪-蝉拟青霉药材的双向发酵体系，并发现经发酵后，黄芪药材菌质中多糖、总皂苷含量减少，黄酮含量增加。
目前尚未见黄芪-蝉拟青霉发酵菌质的药理活性方面的研究报道。
发明内容
本发明的目的在于提供黄芪-蝉拟青霉发酵菌质及其新的制药用途。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的。
本发明提供黄芪-蝉拟青霉发酵菌质用于制备治疗高尿酸血症和/或高甘油三酯血症的药物的用途，所述黄芪-蝉拟青霉发酵菌质以黄芪药材粉末作为发酵底物，以蝉拟青霉作为发酵菌种，通过固体发酵途径制备得到。
本发明中，优选地，所述黄芪-蝉拟青霉发酵菌质用于制备治疗高尿酸血症并发高甘油三酯血症的药物。
本发明中，优选地，所述黄芪-蝉拟青霉发酵菌质通过如下方法制备得到：
(1)将黄芪药材粉末加水混合均匀，灭菌，得到黄芪固态培养基；
(2)将蝉拟青霉接种于所述黄芪固态培养基中，于培养温度为24～30℃、相对湿度为50～90％的条件下培养，培养时间为7～30天，得到黄芪-蝉拟青霉发酵菌质。
本发明中，优选地，步骤(1)中，所述黄芪药材粉末的粒度为过6～20目筛，更优选为过8～14目筛，再优选为过8目筛。采用所述的黄芪药材粉末的粒度，有利于蝉拟青霉的生长。
本发明中，优选地，步骤(1)中，黄芪药材粉末与水的重量比为1～5:1，更优选为1.5～3:1，再优选为2～2.5:1。采用上述比例，有利于使接种的蝉拟青霉与黄芪药材粉末充分接触，取得更佳的发酵效果。特别是黄芪药材粉末与水的重量比为2～2.5:1范围内，获得的黄芪固态培养基更适合蝉拟青霉的生长，蝉拟青霉的生长率和黄芪-蝉拟青霉发酵菌质的得率更高。
步骤(1)中，所述灭菌操作可以采用常规灭菌条件，不做特别限制。根据本发明的一个实施方式，所述灭菌操作为于90℃高压蒸汽灭菌锅中灭菌60min。
本发明中，优选地，步骤(2)中，所述蝉拟青霉为将蝉拟青霉菌种经过活化培养后得到的。所述蝉拟青霉菌种为已知菌种，优选为中国林业微生物保藏中心保藏的编号为cfcc81169的菌种。活化培养方法可以为本领域常规活化方法，不做任何限制。根据本发明的一个实施方式，活化培养方法为：将蝉拟青霉菌种接种于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)斜面培养基上，置于27℃、相对湿度80％的恒温恒湿箱活化培养5天，得到活化后的蝉拟青霉；然后用接种环挑取活化后的蝉拟青霉置于马铃薯葡萄糖液体培养基中，于25℃、140r·min-1的摇床条件下培养7天，得到蝉拟青霉和蝉拟青霉种子液。所得的蝉拟青霉即可直接接种于所述黄芪固态培养基中。
本发明中，优选地，步骤(2)中，所述蝉拟青霉的接种量为所述黄芪药材粉末重量的5～20wt％，更优选为8～15wt％，再优选为8～12wt％。采用上述接种量，蝉拟青霉的生长率和黄芪-蝉拟青霉发酵菌质的得率更高，且节约蝉拟青霉的用量。
本发明中，优选地，步骤(2)中，所述培养温度为25～29℃，更优选为26～28℃；所述相对湿度为60～90％，更优选为70～90％。培养时间为优选为14～24天，更优选为20～24天。根据本发明一个优选的实施方式，培养温度为26～28℃，相对湿度为70％～90％，培养时间为20～24天。所述培养条件可达到更优的发酵效果。所述培养可以在恒温恒湿培养箱内进行。
本发明中，优选地，步骤(2)中，还将所述蝉拟青霉种子液接种于所述黄芪固态培养基中。
本发明还提供上述制备方法制得的黄芪-蝉拟青霉发酵菌质。所述黄芪-蝉拟青霉发酵菌质多糖含量显著高于黄芪药材。
与黄芪药材相比，本发明的黄芪-蝉拟青霉发酵菌质中多糖含量显著提高，且本发明的黄芪-蝉拟青霉发酵菌质具有显著的治疗高尿酸血症和/或高甘油三酯血症的作用。
附图说明
图1为高尿酸血症大鼠血清UA水平对比图。
图2为高尿酸血症大鼠血清BUN水平对比图。
图3为高尿酸血症大鼠血清CRE水平对比图。
图4为高尿酸血症大鼠TG水平对比图。
注：与正常组相比，***表示具有极显著差异(P<0.001)，**表示具有显著差异(P<0.01)；与模型组相比，+++表示具有极显著差异(P<0.001)，++表示具有显著差异(P<0.01)，+表示具有统计学差异(P<0.05)。
具体实施方式
本发明提供了一种黄芪-蝉拟青霉发酵菌质的新的制药用途，下面对本发明的实施方式作具体说明。
以下通过具体实施例对本发明的实施方式做进一步说明。
以下实施例中，蝉拟青霉菌种由中国林业微生物保藏中心提供，编号cfcc81169。将该蝉拟青霉菌种接种于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)斜面培养基上，置于27℃、相对湿度80％的恒温恒湿箱活化培养5天，得到活化后的蝉拟青霉。用接种环挑取活化后的蝉拟青霉置于马铃薯葡萄糖液体培养基中，于25℃、140r·min-1的摇床条件下培养7天，得到蝉拟青霉和蝉拟青霉种子液。
试剂：氧嗪酸钾盐(Potassium oxonate)购自美国Sigma公司；苯溴马隆片(Narcarin)购自德国Excella GmbH公司。定标液、质控液和检测试剂盒均购于北京利德曼生化技术有限公司。甘油三酯测定试剂盒，批号：112293K。尿酸测定试剂盒，批号：00275。尿素氮测定试剂盒，批号：01049；肌酐测定试剂盒，批号：04210。
动物：Sprague Dawley(SD)大鼠，雄性，体质量220～250g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号为SCXK(京)2016-0006。
仪器：CX-4Pro型全自动生化分析仪为美国Beckman公司产品；R200D型电子分析天平(十万分之一)为德国Sartorius公司产品；Millipore Synergy UV型超纯水机为美国Millipore公司产品；BXM-30R高压蒸汽灭菌锅为西安仪创实验室仪器设备有限公司产品；UV-2000紫外可见分光光度计为北京瑞利分析仪器公司产品；FW-100高速粉碎机为天津市泰斯特仪器有限公司产品；LHS-80HC-Ⅱ型恒温恒湿培养箱为上海一恒科技有限公司产品。
以下实施例1～2、对比例1～3的发酵培养是平行进行的，采用的黄芪药材及其用量、培养过程操作方法完全相同。
实施例1
将黄芪药材粉碎，过8目筛，得到黄芪药材粉末。将黄芪药材粉末与蒸馏水按2.5:1的重量比混合均匀，置于90℃蒸汽灭菌锅中灭菌60min，冷却至室温，得到黄芪固态培养基。将蝉拟青霉均匀接种至黄芪固态培养基中，接种量为黄芪药材的10wt％，在培养温度26℃、相对湿度80％条件下恒温恒湿培养24天，得到黄芪-蝉拟青霉发酵菌质A(以下简称“菌质A”)。
实施例2
将黄芪药材粉碎，过8目筛，得到黄芪药材粉末。将黄芪药材粉末与蒸馏水按2.5:1的重量比混合均匀，置于90℃蒸汽灭菌锅中灭菌60min，冷却至室温，得到黄芪固态培养基。将蝉拟青霉均匀接种至黄芪固态培养基中，接种量为黄芪药材的10wt％；并将蝉拟青霉种子液均匀接种于黄芪固态培养基中，接种量为黄芪药材粉末的4wt％，在培养温度26℃、相对湿度80％条件下恒温恒湿培养24天，得到黄芪-蝉拟青霉发酵菌质B(以下简称“菌质B”)。
对比例1
将黄芪药材粉碎，过8目筛，得到黄芪药材粉末。将黄芪药材粉末与蒸馏水按1:1.5的重量比混合均匀，置于90℃蒸汽灭菌锅中灭菌60min，冷却至室温，得到黄芪固态培养基。将蝉拟青霉均匀接种至黄芪固态培养基中，接种量为黄芪药材的10wt％，在培养温度26℃、相对湿度80％条件下恒温恒湿培养24天，得到黄芪-蝉拟青霉发酵菌质C(以下简称“菌质C”)。
对比例2
将黄芪药材粉碎，过8目筛，得到黄芪药材粉末。将黄芪药材粉末与蒸馏水按2.5:1的重量比混合均匀，置于90℃蒸汽灭菌锅中灭菌60min，冷却至室温，得到黄芪固态培养基。将蝉拟青霉均匀接种至黄芪固态培养基中，接种量为黄芪药材的4wt％，在培养温度26℃、相对湿度80％条件下恒温恒湿培养24天，得到黄芪-蝉拟青霉发酵菌质D(以下简称“菌质D”)。
对比例3
将黄芪药材粉碎，过8目筛，得到黄芪药材粉末。将黄芪药材粉末与蒸馏水按2.5:1的重量比混合均匀，置于90℃蒸汽灭菌锅中灭菌60min，冷却至室温，得到黄芪固态培养基。将蝉拟青霉均匀接种至黄芪固态培养基中，接种量为黄芪药材的20wt％，在培养温度26℃、相对湿度80％条件下恒温恒湿培养24天，得到黄芪-蝉拟青霉发酵菌质E(以下简称“菌质E”)。
对比例4
将黄芪药材粉碎，过8目筛，得到黄芪药材粉末。
实验例1菌质生长消耗率测定
黄芪-蝉拟青霉发酵菌质A～E均于发酵第24天取样，发酵基质底部及表面铺满浓密的菌丝体，测定菌丝湿重，菌丝体用蒸馏水冲洗3次，然后置60℃烘箱中烘干至恒重，称重，计算发酵前后的重量变化，计算消耗率。消耗率越高，说明培养条件越适合菌丝生长。
消耗率＝(原药材重量－干燥发酵后菌质重量)/原药材重量×100％。
结果如表1所示。
表1
Figure BDA0002275163850000081
实验例2有效成分含量测定
分别提取实施例1的菌质A和对比例4的黄芪药材粉末中的总多糖，并采用硫酸-苯酚比色法(方法同如下文献：杨莉等，黄芪中黄芪多糖含量测定方法的比较，中国医药工业杂志[J]，2005，36(9)：562-563页)分别测定总多糖的含量。
采用乙酸乙酯萃取实施例1的菌质A和对比例4的黄芪药材粉末中的总黄酮，并采用NaNO2-A1(NO3)3比色法(方法同如下文献：房树标等，紫外分光光度法测定蒙古黄芪中总黄酮的含量，中国药物与临床[J]，2007，7(12)：899-901)分别测定总黄酮的含量。
以上测定均平行取三份样品，测定含量，取平均值。
测定结果见表2。
表2
Figure BDA0002275163850000082
注：***表示与黄芪药材粉末组相比，有极显著差异(P<0.001)
与黄芪药材粉末组相比，菌质A中的总多糖含量极显著增加，为黄芪药材粉末组的1.32倍；而黄酮的含量则极显著下降，仅为黄芪药材粉末组的1/2。黄芪多糖成分的变化可能是导致黄芪-蝉拟青霉发酵菌质相对于黄芪药材药效变化的重要原因。
实验例3药效试验
1.造模及给药
取SD大鼠，按体质量随机分为正常组、高尿酸血症(HUA)模型组、阳性药对照组、黄芪药材组及菌质A组，每组8只，动物房适应性饲养1周后用于实验。
各组均给予正常饲料喂养。此外，正常组灌胃给予蒸馏水；其余各组每天首先灌胃给予300mg·kg-1氧嗪酸钾盐进行造模，1小时后，阳性药对照组灌胃给予20mg·kg-1苯溴马隆，黄芪药材组灌胃给予300mg·kg-1黄芪药材粉末溶液，菌质A组灌胃给予300mg·kg-1菌质A溶液，连续给药14天，每天两次，灌胃量均为10mL·kg-1。
2.血清样品的收集
最后一天给药处理后4小时，对大鼠进行眼眶静脉丛取血，血样4℃条件下静置过夜后，离心取血清，用于生化指标的测定。
3.生化指标的测定
采用全自动生化分析仪在常规定标、质量控制后，检测血清中尿酸(uric acid，UA)、尿素氮(urea nitrogen，BUN)、肌酐(creatinine，CRE)和甘油三酯(triglyceride，TG)的含量。
4.数据分析
所有试验结果以“均值±标准差”的形式表示。采用Excel和SPSS17.0软件进行计算和统计，所有数据经正态分布和方差齐性检验后，进行单因素方差分析，两组均数间的差异采用t检验，P<0.05时认为差异具有统计学意义。
5.结果
5.1对高尿酸血症大鼠血清UA水平的影响
如图1所示，与正常组相比，氧嗪酸钾盐诱导的高尿酸血症模型组大鼠的血清UA水平极显著升高(P<0.001)，提示大鼠高尿酸血症模型塑造成功；与模型组相比，阳性药苯溴马隆组、黄芪组均显著地降低了模型大鼠血清UA水平，菌质A组极显著地降低了模型大鼠血清UA水平，菌质A组降尿酸效果优于黄芪组。
5.2对高尿酸血症大鼠血清BUN水平的影响
如图2所示，与正常组相比，氧嗪酸钾盐诱导的高尿酸血症模型组大鼠的血清BUN水平显著升高(P<0.01)；与模型组相比，菌质A组显著降低了模型大鼠血清BUN水平，黄芪组极显著降低了模型大鼠血清BUN水平。
5.3对高尿酸血症大鼠血清CRE水平的影响
如图3所示，与正常组相比，氧嗪酸钾盐诱导的高尿酸血症模型组大鼠的血清CRE水平极显著升高(P<0.001)；与模型组相比，阳性药苯溴马隆组极显著地降低了模型大鼠血清CRE水平，菌质A组显著降低了模型大鼠血清CRE水平，降血清CRE效果优于黄芪组。
5.4对高尿酸血症大鼠TG水平的影响
高尿酸血症通常并发高甘油三脂血症。如图4所示，与正常组相比，氧嗪酸钾盐诱导的高尿酸血症模型组大鼠的血清TG水平极显著升高(P<0.001)；与模型组相比，阳性药苯溴马隆组、菌质A组均显著降低了模型大鼠血清TG水平，黄芪明显降低了模型大鼠血清TG水平，菌质A组的效果优于黄芪组。
本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员可以想到的任何变形、改进、替换均落入本发明的范围。

Claims (4)

1.一种黄芪-蝉拟青霉发酵菌质用于制备治疗高尿酸血症或高甘油三酯血症的药物的用途，所述黄芪-蝉拟青霉发酵菌质以黄芪药材粉末作为发酵底物，以蝉拟青霉作为发酵菌种，通过固体发酵途径制备得到；所述黄芪-蝉拟青霉发酵菌质的制备方法如下：
(1)将黄芪药材粉末加水混合均匀，灭菌，得到黄芪固态培养基；所述黄芪药材粉末与水的重量比为1.5～3:1；
(2)将蝉拟青霉接种于所述黄芪固态培养基中，于培养温度为26～28℃，相对湿度为70％～90％，培养时间为20～24天，得到黄芪-蝉拟青霉发酵菌质；其中，所述蝉拟青霉的接种量为所述黄芪药材粉末重量的5～20wt％；
其中，所述蝉拟青霉为将蝉拟青霉菌种经过活化培养后得到的；蝉拟青霉菌种的活化培养方法为：将蝉拟青霉菌种接种于马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，置于27℃、相对湿度80％的恒温恒湿箱活化培养5天，得到活化后的蝉拟青霉；然后用接种环挑取活化后的蝉拟青霉置于马铃薯葡萄糖液体培养基中，于25℃、140r·min-1的摇床条件下培养7天，得到蝉拟青霉和种子液。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，步骤(1)中，所述黄芪药材粉末的粒度为过6～20目筛；所述黄芪药材粉末与水的重量比为2～2.5:1。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，步骤(2)中，所述蝉拟青霉的接种量为所述黄芪药材粉末重量的8～15wt％。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，步骤(2)中，还将所述种子液接种于所述黄芪固态培养基中。
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