CN110438198B - 基于草粉提取物制备抗生素的苎麻品种及器官筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于草粉提取物制备抗生素的苎麻品种及器官筛选方法，通过对苎麻不同品种的不同器官干燥、粉碎、萃取、过滤和洗涤后，可以得出其草粉提取物可安全、有效地替代抗生素的苎麻品种及器官，对苎麻干粉绿原酸提取技术的转化、推广，推动我国抗生素替代方面的发展具有十分重要的现实意义。

Description

基于草粉提取物制备抗生素的苎麻品种及器官筛选方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于草粉提取物制备抗生素的苎麻品种及器官筛选方法。
背景技术
医药领域最伟大的成就包括抗生素与合成抗菌药物的发明应用，但细菌耐药现象也成为不可忽视的事实。据统计，我国每年有8万人直接或间接死于滥用抗生素，因此，该问题成为人们关注的焦点。最受人们关注的是,长期采食添加抗生素饲料的动物，其体内的微生物产生抗药性后通过食物链进入人体，所导致人类医学中使用该抗生素时也发生抗药性的问题。中草药作为一种绿色无害的天然添加剂，可直接或间接作用于细菌，病原体等有害微生物，而且不产生耐药性。绿原酸(Chlorogenic acid)，又名咖啡鞣酸，即3-咖啡酰奎宁酸，分子式：C16H18O9，分子量：354.31。人们对绿原酸生物活性的研究已深入到食品、保健、医药和日用化工等多个领域，而且它是一种重要的生物活性物质，具有抗菌、抗病毒、增高白血球、保肝利胆、抗肿瘤、降血压、降血脂、清除自由基和兴奋中枢神经系统等作用。目前，我国提取绿原酸的主要原料是金银花和杜仲。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明旨在提供一种基于草粉提取物制备抗生素的苎麻品种及器官筛选方法，通过对苎麻不同品种的不同器官干燥、粉碎、萃取、过滤和洗涤，可以得出其草粉提取物可安全、有效地替代抗生素的苎麻品种及器官。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
基于草粉提取物制备抗生素的苎麻品种及器官筛选方法，包括如下步骤：
S1、收获乐业灰绿苎、桐木苎麻、湘饲纤兼用苎麻1号、红尖麻、芦竹青的头麻；
S2、将步骤S1中收获的各个苎麻品种收获后的头麻均分为叶片、萝卜根和繁殖根三部分器官并置于烘箱中，105℃杀青0.5h后，65℃烘干至恒重，粉碎，过筛备用；
S3、对步骤S2中粉碎过筛后得到的各个苎麻品种的不同器官的苎麻干粉分别进行绿原酸提取液的提取：取苎麻干粉加入pH值调为4的50％的乙醇浸泡24h，40℃下超声波辅助萃取30min，过滤，洗涤；如此重复2次，合并滤液，110℃常压蒸馏至乙醇挥发完全，得到苎麻干粉的绿原酸提取液；
S4、筛选：
(1)对步骤S3中得到的各个苎麻品种的不同器官的苎麻干粉的绿原酸提取液分别进行如下操作：在无菌工作台上将细菌的菌悬液分别加入至苎麻干粉的绿原酸提取液、pH值调为4的50％的乙醇、灭菌水形成三个处理组并放置于37℃，170r/min的摇床培养48h，以50％的乙醇菌液为空白，在600nm处测定吸光度；获得不同苎麻品种的不同器官干粉绿原酸的含量，每个苎麻品种均显示叶片干粉的绿原酸含量最高；
(2)对各个苎麻品种的叶片干粉的绿原酸提取液分别进行如下操作：取普通肉汤琼脂培养基融化于平板上，待凝固后加入细菌的菌悬液，均匀涂抹；将无菌滤纸片浸泡于叶片干粉的绿原酸提取液中，贴在有菌的平板上，37℃恒温培养箱培养24h,游标卡尺测量抑菌圈直径大小，三组重复，抑菌圈直径大小取三组平均；获得不同苎麻品种的叶片干粉的绿原酸提取液对细菌的抑菌效果；
采用KB-滤纸片法测量不同浓度抗生素抑菌圈直径大小，每个浓度的药敏片三组重复，抑菌圈直径取平均值；药物对细菌抑制作用标准：无抑菌圈为无敏，抑菌圈直径＜10mm，低度敏感；10mm≤抑菌圈直径≤15mm,中度敏感；抑菌圈直径＞15mm，高度敏感；获得抗生素对细菌的抑菌效果；
将不同苎麻品种的叶片干粉的绿原酸提取液对细菌的抑菌效果与抗生素对细菌的抑菌效果进行比较，筛选得到叶片干粉绿原酸提取液的抑菌效果最佳的苎麻品种。
进一步地，步骤S3中，每1g干粉加入50mL pH值调为4的50％的乙醇。
进一步地，步骤S4的第(1)部分中，细菌的菌悬液和苎麻干粉的绿原酸提取液、pH值调为4的50％的乙醇、灭菌水的体积比均为1:5。
进一步地，步骤S4的第(2)部分中，普通肉汤琼脂培养基和细菌的菌悬液的体积比为100:1。
更进一步地，普通肉汤琼脂培养基的制备过程如下：取蛋白胨10g,牛肉膏3g,氯化钠5g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，调节pH值7.2，121℃，高压灭菌20min。
进一步地，步骤S4的第(2)部分中，采用KB-滤纸片法测量不同浓度抗生素抑菌圈直径大小的具体过程为：配制1g/mL的抗生素溶液，取13支无菌小试管，除第1支外，每支试管加入3mL无菌水，取3mL 1g/mL的药液于第2支试管中，混匀后取3mL于第3支试管中，以此类推，到第13支时，弃去3mL，KB-滤纸片法测量不同浓度抗生素抑菌圈大小，每个浓度的药敏片三组重复，抑菌圈直径取平均值。
更进一步地，所述抗生素包括金霉素。
进一步地，细菌菌悬液的制备过程为：将普通营养肉汤培养基放入高压灭菌处理过的锥形瓶内，接种细菌，接种后放置于37℃，170r/min的摇床培养48h，600nm处测定吸光度值在1.1-1.2范围内，放入4℃冰箱内备用。
更进一步地，普通营养肉汤培养基的制备过程为：取蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，调节pH值7.2，121℃，高压灭菌20min制备得到。
更进一步地，所述细菌包括大肠杆菌和沙门氏菌。
本发明的有益效果在于：
本发明通过对苎麻不同品种的不同器官干燥、粉碎、萃取、过滤和洗涤后，可以得出其草粉提取物可安全、有效地替代抗生素的苎麻品种及器官，对苎麻干粉绿原酸提取技术的转化、推广，推动我国抗生素替代方面的发展具有十分重要的现实意义。
具体地，本发明通过对苎麻干燥、粉碎、萃取、过滤和洗涤后，在苎麻干粉中提取出绿原酸。苎麻各器官绿原酸含量叶片>萝卜根>繁殖根；苎麻各品种叶片绿原酸含量为乐业灰绿苎>红尖麻>桐木苎麻>湘饲纤兼用苎麻1号>芦竹青，处于0.15％-0.8％；供试的五个品种各器官绿原酸提取液都具有不同程度的抑菌效果，对大肠杆菌和沙门氏菌的抑制效果以叶片干粉绿原酸提取液>萝卜根>繁殖根；1g/mL的桐木苎麻和乐业灰绿苎叶片干粉绿原酸提取液对大肠杆菌的抑制效果与0.98mg/mL的金霉素相当,1g/mL的桐木苎麻叶片干粉绿原酸提取液对沙门氏菌的抑制效果与0.49mg/mL的金霉素相当。
附图说明
图1为本发明实施例1中苎麻各器官绿原酸含量比较结果示意图。
具体实施方式
以下将结合附图对本发明作进一步的描述，需要说明的是，本实施例以本技术方案为前提，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围并不限于本实施例。
实施例1
1、材料与方法
1.1、材料
1.1.1、苎麻品种及取样
乐业灰绿苎、桐木苎麻、湘饲纤兼用苎麻1号、红尖麻、芦竹青，2017年6月移栽至湖南省浏阳市沿溪镇，2018年6月成熟期收获头麻。
1.1.2、苎麻干燥和粉碎
将收获后的苎麻分为叶片、萝卜根和繁殖根三部分置于烘箱中，105℃杀青0.5h后，65℃烘干至恒重，用中药材粉样机粉碎，过80目筛备用。
1.1.3、苎麻干粉绿原酸提取液
称取1g粉碎过筛后的苎麻干粉，加入50mL pH值调为4的50％的乙醇并浸泡24h，40℃下超声波辅助萃取30min，过滤，洗涤。重复提取2次，并合并滤液，110℃常压蒸馏至25mL(乙醇挥发完全)。
1.1.4、细菌种类：大肠埃希氏菌、沙门氏菌
1.1.5、抗生素：盐酸金霉素(Chlortetracycline hydrochloride)
1.2、方法
1.2.1、不同苎麻品种的各器官绿原酸含量的测定：
具体采用紫外-可见分光光度法测定：
(1)绿原酸标准曲线的制作：绿原酸标准溶液(生化试剂，≥98％，合肥博美生物科技有限公司)：0.040mg/mL，将20mg绿原酸标准品用50％乙醇在试剂瓶中溶解，用100mL定容瓶定容。量取20.00mL，用50％乙醇再次稀释至100mL。准确吸取绿原酸标准溶液0.00，1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00、8.00、9.00mL分别置于10支10mL的具塞试管中，加50％乙醇定容至刻度，摇匀。在选定的波长组合下，测定苎麻样品中绿原酸含量的回归方程。
(2)绿原酸含量的测定：对不同品种的苎麻的各个器官，均作如下操作：称取0.1g粉碎过筛后的样品，加入5mL pH值调为4的50％的乙醇,浸泡24h后，40℃下超声波辅助萃取30min，过滤，洗涤。重复提取2次，并合并滤液，用50％的乙醇定容至10mL，离心3000r/min，15min，紫外分光光度计在386nm处测定吸光度。
1.2.2、不同品种各器官干粉绿原酸提取液体外抑菌试验：
比浊法测定：
(1)普通营养肉汤培养基制备：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，调节pH值7.2，121℃，高压灭菌20min；
(2)大肠杆菌与沙门氏菌的菌悬液制备：将1000mL的普通营养肉汤培养基分装到10个高压灭菌处理过的锥形瓶内，5个接种大肠杆菌，5个接种沙门氏菌，接种后放置于37℃，170r/min的速度摇床培养48h，600nm处测定吸光度值在1.1-1.2范围内，放入4℃冰箱内备用；
(3)对不同苎麻品种的各器官的干粉提取所得绿原酸提取液对大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌效果均进行如下测试：在无菌工作台上取1mL将细菌的菌悬液分别加入至5mL绿原酸提取液、5mL 50％的乙醇、5mL灭菌水形成三个处理组放置于37℃，170r/min的摇床培养48h，以50％的乙醇菌液为空白，在600nm处测定吸光度；
1.2.3、不同苎麻品种的叶片干粉提取液体外替代抗生素试验：
KB-滤纸片法测定：
(1)普通肉汤琼脂培养基制备：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，调节pH值7.2，121℃，高压灭菌20min；
(2)对从不同苎麻品种的叶片干粉提取的绿原酸提取液对大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌效果均作如下实验：称取10g过筛后的苎麻叶粉于烧杯中，加入pH值调为4的50％的乙醇(固液比1:50)浸泡24h后，40℃下超声波辅助萃取30min，过滤，洗涤，重复提取2次，并合并滤液，常压蒸馏至10mL(相当于生药1g/mL),将普通肉汤琼脂培养基融化，取10mL于平板上，待凝固后加入0.1mL细菌的菌悬液，用三角耙均匀涂抹，用无菌镊子将6mm无菌滤纸片浸泡于提取液中，贴在有菌的平板上，37℃恒温培养箱培养24h,游标卡尺测量抑菌圈大小；进行三组重复，抑菌圈直径取平均值；
(2)对金霉素对大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌效果进行实验：配制1g/mL的金霉素溶液，取13支无菌小试管，除第1支外，每支试管加入3mL无菌水，取3mL 1g/mL的药液于第2支试管中，混匀后取3mL于第3支试管中，以此类推，到第13支时，弃去3mL，滤纸片法测量不同浓度抗生素抑菌圈大小，每个浓度的药敏片三组重复，抑菌圈直径取平均值；
(3)药物对细菌抑制作用标准：无抑菌圈为无敏，抑菌圈直径＜10mm为低度敏感；10mm≤抑菌圈直径≤15mm为中度敏感；抑菌圈直径＞15mm为高度敏感。
1.3、数据统计与分析方法
该试验所得数据用Excel 2010进行数据统计，用SPSS 22.0软件的一般线性模型和比较平均值的LSD法和SNK法进行方差分析。
2、结果与分析
2.1、不同品种各器官绿原酸含量的分析
由图1可知，该5个品种苎麻的不同器官绿原酸含量具有差异性，叶片中的绿原酸含量最高，其次是繁殖根，萝卜根最低。叶片绿原酸含量最高的品种是乐业灰绿苎，其次是红尖麻，桐木苎麻，含量处于0.4％ˉ0.8％；萝卜根中绿原酸含量差异不大，处于0.10％ˉ0.16％，繁殖根含量最高的品种为乐业灰绿苎，而芦竹青，红尖麻，桐木苎麻含量无明显差异，处于0.22％ˉ0.30％，湘饲纤兼用苎麻1号繁殖根绿原酸含量最低。
2.2、不同品种各器官干粉绿原酸提取液的杀菌效果
由表1可知，添加了苎麻各器官干粉绿原酸提取液的培养液OD值均比对照组降低，在试验组中，添加叶片干粉的绿原酸提取液对大肠杆菌和沙门氏菌浓度影响较萝卜根和繁殖根的大。
表1苎麻各器官绿原酸提取液对大肠杆菌和沙门氏菌浓度的影响
注:同列小写字母不同表示有显著差异(P<0.05)
2.2.1、苎麻各器官干粉的绿原酸提取液对大肠杆菌OD值的影响
通过SPSS软件LSD法和SNK法进行方差分析，发现该5个品种苎麻，除了湘饲纤兼用苎麻1号、芦竹青、桐木苎麻的繁殖根与无菌水对照无明显差异，其余品种的器官与无菌水对照均有差异，桐木苎麻的叶片、乐业灰绿苎的叶片、红尖麻的叶片差异最明显，所测大肠杆菌OD值相比无菌水对照下降了57.11％ˉ69.29％。在同一品种中，相比萝卜根与繁殖根，叶片的抑菌效果最好，即叶片>萝卜根>繁殖根(P<0.05)。
2.2.2、苎麻各器官干粉绿原酸提取液对沙门氏菌OD值的影响
通过SPSS软件LSD法和SNK法进行方差分析，发现该5个品种的萝卜根与无菌水对照无明显差异，但是它们的叶片和繁殖根对沙门氏菌的抑菌情况与无菌水对照具有显著差异，其中乐业灰绿苎、红尖麻、桐木苎麻的叶片与无菌水对照差异最明显，所测沙门氏菌OD值相比无菌水对照下降了62％左右。在同一品种中，相比萝卜根与繁殖根，叶片的抑菌效果最好，即叶片>繁殖根>萝卜根(P<0.05)。
2.3、不同品种的叶片干粉的绿原酸提取液体外替代抗生素试验：
通过测量不同浓度抗生素对大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌圈直径，发现抗生素浓度在31.25ˉ500mg/mL对大肠杆菌的抑制效果为高度敏感，在3.91ˉ15.63mg/mL对大肠杆菌的抑制效果为中度敏感，低于3.91mg/mL为低度敏感，低于0.98mg/mL为无敏；抗生素浓度在7.81ˉ500mg/mL对沙门氏菌的抑制效果为高度敏感，在3.91ˉ7.81mg/mL区间的抑制效果为中度敏感，低于3.91mg/mL的抑制效果为低度敏感，低于0.49mg/mL为无敏。
由表2可知，将1g/mL乐业灰绿苎、红尖麻、桐木苎麻的叶片干粉的绿原酸提取液与抗生素对大肠杆菌的杀菌效果进行比较发现，桐木苎麻和乐业灰绿苎的叶片提取液与0.98mg/mL抗生素对大肠杆菌的抑制效果差异不明显，红尖麻的叶片干粉的绿原酸提取液与该浓度抗生素差异明显(P<0.05)。
将1g/mL乐业灰绿苎、红尖麻、桐木苎麻的叶片干粉的绿原酸提取液与抗生素对沙门氏菌的抑菌效果进行比较发现,桐木苎麻的叶片干粉的绿原酸提取液与0.49mg/mL抗生素对沙门氏菌的抑菌效果无明显差异，而乐业灰绿苎和红尖麻与该浓度抗生素差异明显(P<0.05)。
表2苎麻叶片干粉绿原酸提取液对大肠杆菌和沙门氏菌的抑制效果
注:同列小写字母不同表示有显著差异(P<0.05)
对于本领域的技术人员来说，可以根据以上的技术方案和构思，给出各种相应的改变和变形，而所有的这些改变和变形，都应该包括在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (8)

1.基于绿原酸提取液制备抗生素的苎麻品种及器官筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、收获乐业灰绿苎、桐木苎麻、湘饲纤兼用苎麻1号、红尖麻和芦竹青的头麻；
S2、将步骤S1中收获的各个苎麻品种收获后的头麻均分为叶片、萝卜根和繁殖根三部分器官并置于烘箱中，105 ℃杀青0.5 h后，65℃烘干至恒重，粉碎，过筛备用；
S3、对步骤S2中粉碎过筛后得到的各个苎麻品种的不同器官的苎麻干粉分别进行绿原酸提取液的提取：取苎麻干粉加入pH值调为4的50 %的乙醇浸泡24 h，40 ℃下超声波辅助萃取30 min，过滤，洗涤；如此重复2次，合并滤液，110 ℃常压蒸馏至乙醇挥发完全，得到苎麻干粉的绿原酸提取液；每1g苎麻干粉加入50 mL pH值调为4的50%的乙醇;
S4、筛选：
（1）对步骤S3中得到的各个苎麻品种的不同器官的苎麻干粉的绿原酸提取液分别进行如下操作：在无菌工作台上将细菌的菌悬液分别加入至苎麻干粉的绿原酸提取液、pH值调为4的50%的乙醇、灭菌水形成三个处理组并放置于37 ℃，170 r/min的摇床培养48 h，以50%的乙醇菌液为空白，在600 nm处测定吸光度；获得不同苎麻品种的不同器官干粉绿原酸的含量，每个苎麻品种均显示叶片干粉的绿原酸含量最高；
（2）对各个苎麻品种的叶片干粉的绿原酸提取液分别进行如下操作：取普通肉汤琼脂培养基融化于平板上，待凝固后加入细菌的菌悬液，均匀涂抹；将无菌滤纸片浸泡于叶片干粉的绿原酸提取液中，贴在有菌的平板上，37℃恒温培养箱培养24h,游标卡尺测量抑菌圈直径大小，三组重复，抑菌圈直径大小取三组平均；获得不同苎麻品种的叶片干粉的绿原酸提取液对细菌的抑菌效果；
采用KB-滤纸片法测量不同浓度抗生素抑菌圈直径大小，每个浓度的药敏片三组重复，抑菌圈直径取平均值；药物对细菌抑制作用标准：无抑菌圈为无敏，抑菌圈直径＜10mm，低度敏感；10mm≤抑菌圈直径≤15mm,中度敏感；抑菌圈直径＞15mm，高度敏感；获得抗生素对细菌的抑菌效果；
将不同苎麻品种的叶片干粉的绿原酸提取液对细菌的抑菌效果与抗生素对细菌的抑菌效果进行比较，筛选得到叶片干粉绿原酸提取液的抑菌效果最佳的苎麻品种为桐木苎麻；
所述细菌包括大肠杆菌和沙门氏菌。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S4的第（1）部分中，细菌的菌悬液和苎麻干粉的绿原酸提取液、pH值调为4的50 %的乙醇、灭菌水的体积比均为1:5。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S4的第（2）部分中，普通肉汤琼脂培养基和细菌的菌悬液的体积比为100:1。
4.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于，普通肉汤琼脂培养基的制备过程如下：取蛋白胨10g,牛肉膏3g,氯化钠5g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，调节pH值7.2，121℃，高压灭菌20min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S4的第（2）部分中，采用KB-滤纸片法测量不同浓度抗生素抑菌圈直径大小的具体过程为：配制1g/mL的抗生素溶液，取13支无菌小试管，除第1支外，每支试管加入3mL无菌水，取3mL 1g/mL的药液于第2支试管中，混匀后取3mL于第3支试管中，以此类推，到第13支时，弃去3mL，KB-滤纸片法测量不同浓度抗生素抑菌圈大小，每个浓度的药敏片三组重复，抑菌圈直径取平均值。
6.根据权利要求1或5所述的方法，其特征在于，所述抗生素包括金霉素。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，细菌菌悬液的制备过程为：将普通营养肉汤培养基放入高压灭菌处理过的锥形瓶内，接种细菌，接种后放置于37℃，170r/min的摇床培养48h，600nm处测定吸光度值在1.1-1.2范围内，放入4℃冰箱内备用。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，普通营养肉汤培养基的制备过程为：取蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，调节pH值7.2，121℃，高压灭菌20min制备得到。
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