CN107760758A - 博落回提取物对微生物抑制效力及最小抑菌浓度的测定 - Google Patents

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Abstract

本发明公开博落回提取物对微生物抑制效力的测定，包括以下步骤：1)博落回原料提取；2)待测样品溶液配制；3)标准样品溶液配制；4)试验用培养基配制；5)抑菌效力测定的步骤为；6)对照组分别移取0.1ml对数生长期的大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的菌液，均匀涂布于普通肉汤培养基表面，取直径6mm灭菌滤纸片浸入1.5mg/ml、3.0mg/ml、4.5mg/ml标准样品溶液中38‑42min后取出，置于37℃温箱中培养24h后观察，每种菌取3个纸片抑菌圈直径平均值记录。优点，通过研究博落回提取物的测定，为博落回在仔猪饲料中应用替代抗生素提供理论依据；采用对比试验，能更加准确的测定出博落回提取物中博落回有效成分的含量，准确把控博落回的使用。

Description

博落回提取物对微生物抑制效力及最小抑菌浓度的测定
技术领域
本发明属于养殖领域，具体涉及博落回提取物对微生物抑制效力及最小抑菌浓度的测定。
背景技术
抗生素作为饲料添加剂使用可以改善仔猪的健康和提高饲料利用率，但长期大量、重复使用和滥用抗生素则导致细菌产生耐药性和畜产品残留问题，严重危害人类健康。长期大量使用抗生素大量导致细菌耐药性和药物残留已引起社会极大关注，而禁止使用抗生素对生猪养殖业的不利影响已逐渐体现出来，许多细菌性疾病卷土重来，导致生猪健康水平下降、饲料利用率降低。目前还没有任何添加剂能像抗生素那样有效地提高猪的生产性能和改善饲料利用率，若在猪饲料中不使用抗生素，就会导致饲料消耗增加和猪的生长速度下降，因此，停止使用抗生素类饲料添加剂，就必须具有新的抗生素替代品，以保证生猪健康和生产效率，目前常用的酶制剂、微量元素添加剂、有机酸均可不同程度改善猪的生产性能和饲料利用率，但并不能完全替代抗生素使用。
目前，对仔猪生产现行常用方法是在仔猪日粮中直接应用特殊饲料如血浆蛋白粉来增加仔猪血液抗体IgG水平，而使用特殊活性物质可诱导动物体内IgG含量上升的研究和应用相对较弱。
因此，寻求安全高效的抗生素替代品已成为改善生猪健康和提高生产性能的重要需求。
发明内容
针对上述现有技术存在的问题，本发明提出博落回提取物对微生物抑制效力及最小抑菌浓度的测定，能快速检测博落回提取物的功效。
其技术方案为：
博落回提取物对微生物抑制效力的测定，包括以下步骤：
1)博落回原料提取：取博落回干燥之后的地上部分，粉碎至40-50目粗细之后，加入pH为5的80％乙醇，回流2小时之后过滤，合并滤液并且浓缩至乙醇回收完全，加入等体积的水，静置，得沉淀，去上清液，滤渣真空干燥之后得到橙色粉末状博落回提取物；
2)待测样品溶液配制：取步骤1)所述的博落回提取物20.0m于250ml容量瓶中，加约200ml0.1％磷酸水溶液超声处理26-32min，冷却至室温，用0.1％磷酸水溶液稀释至刻度，摇匀，得供试样品溶液；
3)标准样品溶液配制：准确称取血根碱、白屈菜红碱标准品各25.0mg于250mL容量瓶中，用0.1％磷酸水溶液定容，配制成混合标准品储备液；
4)试验用培养基配制：普通肉汤培养基：蛋白胨10g，牛肉膏5g,氯化钠5g,磷酸氢二钾1g，蒸馏水1000ml，加热溶解，调pH7.4-7.6，再加热12-18min，补足水分，121℃灭菌；
5)提取物药敏纸片的制备：将定性滤纸用直径6mm的打孔器大成6mm的圆片，经高压灭菌处理后，置100℃烘干，保存备用，每一部分配制成合适的浓度后，把灭好菌的直径为6mm的滤纸片放入溶剂中浸泡4h以上后取出，待溶剂挥发干后使用，对照为灭菌后的蒸馏水纸片；
6)抑菌效力测定的步骤为：分别移取0.1ml处于对数生长期的大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的菌液，均匀涂布于普通肉汤培养基表面，取直径6mm灭菌滤纸片浸入1.5mg/ml、3.0mg/ml、4.5mg/ml待测博落回提取物溶液中38-42min后取出，待干放入接种平板中，将平板置于37℃温箱中培养24h后观察，每种菌取3个纸片抑菌圈直径平均值记录；
7)对照组分别移取0.1ml处于对数生长期的大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的菌液，均匀涂布于普通肉汤培养基表面，取直径6mm灭菌滤纸片浸入1.5mg/ml、3.0mg/ml、4.5mg/ml标准样品溶液中38-42min后取出，待干放入接种平板中，将平板置于37℃温箱中培养24h后观察，每种菌取3个纸片抑菌圈直径平均值记录；
8)对照步骤5)及步骤6)的反应结果，得出结论。
博落回提取物对微生物最小抑菌浓度的测定，包括以下步骤：
1)博落回原料提取：取博落回干燥之后的地上部分，粉碎至40-50目粗细之后，加入pH为5的80％乙醇，回流2小时之后过滤，合并滤液并且浓缩至乙醇回收完全，加入等体积的水，静置，得沉淀，去上清液，滤渣真空干燥之后得到橙色粉末状博落回提取物；
2)试验用培养基配制：普通肉汤培养基：蛋白胨10g，牛肉膏5g,氯化钠5g,磷酸氢二钾1g，蒸馏水1000ml，加热溶解，调pH7.4-7.6，再加热12-18min，补足水分，121℃灭菌；
3)菌悬液制备：将各供试菌种接种于步骤2)所述的培养基上，进行活化，恒温37℃培养18-24h,用接种环挑取一环菌体放入装有玻璃珠的生理盐水里，充分振荡，用血球计数板计数；
4)所述最小抑菌浓度测定的步骤为：采用微量肉汤稀释法测定博落回提取物对不同微生物的最小抑菌浓度，取无菌试管13支，除第1管加入1.6ml肉汤外，其余每管加入肉汤1ml，在第1管加入2560μg/ml博落回提取物0.4ml混匀，然后吸取1ml至第2管，混匀后再吸取1ml至第3管，如此连续倍比稀释至第11管，并从第11管中吸取1ml弃去，第12管为不含药物的生长对照，然后在每管内加入上述制备好的菌液各1ml，将试管置于37℃温箱中培养23-25h后，肉眼观察不浑浊试管浓度即为受试菌的最小抑菌浓度。
优选地，步骤4)所述121℃灭菌，灭菌时间为18-23min。
优选地，步骤5)所述的菌悬液调至107-108个/ml。
本发明有益效果：
1、博落回调节剂对致病微生物具有明显抑菌效果：博落回调节剂对革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌均有抑菌效果，博落回调节剂对病原微生物抗菌谱检测结果为：金黄色葡萄球菌＞枯草芽孢杆菌＞大肠杆菌＞沙门氏菌，应用博落回调节剂对断奶仔猪肠道病原微生物大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌均有抑菌效果，尤其对对金黄色葡萄球菌抑菌效果最显著。
2、以肠道主要致病微生物为研究对象，体外研究博落回提取对微生物抑制效力，为体内研究博落回对动物肠道生物影响，肠道健康提供理论依据；
3、通过研究博落回提取物的测定，为博落回在仔猪饲料中应用替代抗生素提供理论依据；
4、采用对比试验，能更加准确的测定出博落回提取物中博落回有效成分的含量，准确把控博落回的使用。
具体实施方式
实施例1
博落回提取物对微生物抑制效力的测定，包括以下步骤：
1)博落回原料提取：取博落回干燥之后的地上部分，粉碎至40目粗细之后，加入pH为5的80％乙醇，回流2小时之后过滤，合并滤液并且浓缩至乙醇回收完全，加入等体积的水，静置，得沉淀，去上清液，滤渣真空干燥之后得到橙色粉末状博落回提取物；
2)待测样品溶液配制：取步骤1)所述的博落回提取物20.0m于250ml容量瓶中，加约200ml0.1％磷酸水溶液超声处理26min，冷却至室温，用0.1％磷酸水溶液稀释至刻度，摇匀，得供试样品溶液；
3)标准样品溶液配制：准确称取血根碱、白屈菜红碱标准品各25.0mg于250mL容量瓶中，用0.1％磷酸水溶液定容，配制成混合标准品储备液；
4)试验用培养基配制：普通肉汤培养基：蛋白胨10g，牛肉膏5g,氯化钠5g,磷酸氢二钾1g，蒸馏水1000ml，加热溶解，调pH7.4，再加热12min，补足水分，121℃灭菌；
5)提取物药敏纸片的制备：将定性滤纸用直径6mm的打孔器大成6mm的圆片，经高压灭菌处理后，置100℃烘干，保存备用，每一部分配制成合适的浓度后，把灭好菌的直径为6mm的滤纸片放入溶剂中浸泡4h以上后取出，待溶剂挥发干后使用，对照为灭菌后的蒸馏水纸片；
6)抑菌效力测定的步骤为：分别移取0.1ml处于对数生长期的大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的菌液，均匀涂布于普通肉汤培养基表面，取直径6mm灭菌滤纸片浸入1.5mg/ml、3.0mg/ml、4.5mg/ml待测博落回提取物溶液中38min后取出，待干放入接种平板中，将平板置于37℃温箱中培养24h后观察，每种菌取3个纸片抑菌圈直径平均值记录；
7)对照组分别移取0.1ml处于对数生长期的大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的菌液，均匀涂布于普通肉汤培养基表面，取直径6mm灭菌滤纸片浸入1.5mg/ml、3.0mg/ml、4.5mg/ml标准样品溶液中38min后取出，待干放入接种平板中，将平板置于37℃温箱中培养24h后观察，每种菌取3个纸片抑菌圈直径平均值记录；
8)对照步骤5)及步骤6)的反应结果，得出结论。
博落回提取物对微生物最小抑菌浓度的测定，包括以下步骤：
1)博落回原料提取：取博落回干燥之后的地上部分，粉碎至40目粗细之后，加入pH为5的80％乙醇，回流2小时之后过滤，合并滤液并且浓缩至乙醇回收完全，加入等体积的水，静置，得沉淀，去上清液，滤渣真空干燥之后得到橙色粉末状博落回提取物；
2)试验用培养基配制：普通肉汤培养基：蛋白胨10g，牛肉膏5g,氯化钠5g,磷酸氢二钾1g，蒸馏水1000ml，加热溶解，调pH7.4，再加热12min，补足水分，121℃灭菌；
3)菌悬液制备：将各供试菌种接种于步骤2)所述的培养基上，进行活化，恒温37℃培养18h,用接种环挑取一环菌体放入装有玻璃珠的生理盐水里，充分振荡，用血球计数板计数；
4)所述最小抑菌浓度测定的步骤为：采用微量肉汤稀释法测定博落回提取物对不同微生物的最小抑菌浓度，取无菌试管13支，除第1管加入1.6ml肉汤外，其余每管加入肉汤1ml，在第1管加入2560μg/ml博落回提取物0.4ml混匀，然后吸取1ml至第2管，混匀后再吸取1ml至第3管，如此连续倍比稀释至第11管，并从第11管中吸取1ml弃去，第12管为不含药物的生长对照，然后在每管内加入上述制备好的菌液各1ml，将试管置于37℃温箱中培养23h后，肉眼观察不浑浊试管浓度即为受试菌的最小抑菌浓度。
优选地，步骤4)所述121℃灭菌，灭菌时间为18min。
优选地，步骤5)所述的菌悬液调至107个/ml。
实施例2
博落回提取物对微生物抑制效力的测定，包括以下步骤：
1)博落回原料提取：取博落回干燥之后的地上部分，粉碎至50目粗细之后，加入pH为5的80％乙醇，回流2小时之后过滤，合并滤液并且浓缩至乙醇回收完全，加入等体积的水，静置，得沉淀，去上清液，滤渣真空干燥之后得到橙色粉末状博落回提取物；
2)待测样品溶液配制：取步骤1)所述的博落回提取物20.0m于250ml容量瓶中，加约200ml0.1％磷酸水溶液超声处理32min，冷却至室温，用0.1％磷酸水溶液稀释至刻度，摇匀，得供试样品溶液；
3)标准样品溶液配制：准确称取血根碱、白屈菜红碱标准品各25.0mg于250mL容量瓶中，用0.1％磷酸水溶液定容，配制成混合标准品储备液；
4)试验用培养基配制：普通肉汤培养基：蛋白胨10g，牛肉膏5g,氯化钠5g,磷酸氢二钾1g，蒸馏水1000ml，加热溶解，调pH7.6，再加热18min，补足水分，121℃灭菌；
5)提取物药敏纸片的制备：将定性滤纸用直径6mm的打孔器大成6mm的圆片，经高压灭菌处理后，置100℃烘干，保存备用，每一部分配制成合适的浓度后，把灭好菌的直径为6mm的滤纸片放入溶剂中浸泡4h以上后取出，待溶剂挥发干后使用，对照为灭菌后的蒸馏水纸片；
6)抑菌效力测定的步骤为：分别移取0.1ml处于对数生长期的大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的菌液，均匀涂布于普通肉汤培养基表面，取直径6mm灭菌滤纸片浸入1.5mg/ml、3.0mg/ml、4.5mg/ml待测博落回提取物溶液中42min后取出，待干放入接种平板中，将平板置于37℃温箱中培养24h后观察，每种菌取3个纸片抑菌圈直径平均值记录；
7)对照组分别移取0.1ml处于对数生长期的大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的菌液，均匀涂布于普通肉汤培养基表面，取直径6mm灭菌滤纸片浸入1.5mg/ml、3.0mg/ml、4.5mg/ml标准样品溶液中42min后取出，待干放入接种平板中，将平板置于37℃温箱中培养24h后观察，每种菌取3个纸片抑菌圈直径平均值记录；
8)对照步骤5)及步骤6)的反应结果，得出结论。
博落回提取物对微生物最小抑菌浓度的测定，包括以下步骤：
1)博落回原料提取：取博落回干燥之后的地上部分，粉碎至50目粗细之后，加入pH为5的80％乙醇，回流2小时之后过滤，合并滤液并且浓缩至乙醇回收完全，加入等体积的水，静置，得沉淀，去上清液，滤渣真空干燥之后得到橙色粉末状博落回提取物；
2)试验用培养基配制：普通肉汤培养基：蛋白胨10g，牛肉膏5g,氯化钠5g,磷酸氢二钾1g，蒸馏水1000ml，加热溶解，调pH7.6，再加热18min，补足水分，121℃灭菌；
3)菌悬液制备：将各供试菌种接种于步骤2)所述的培养基上，进行活化，恒温37℃培养24h,用接种环挑取一环菌体放入装有玻璃珠的生理盐水里，充分振荡，用血球计数板计数；
4)所述最小抑菌浓度测定的步骤为：采用微量肉汤稀释法测定博落回提取物对不同微生物的最小抑菌浓度，取无菌试管13支，除第1管加入1.6ml肉汤外，其余每管加入肉汤1ml，在第1管加入2560μg/ml博落回提取物0.4ml混匀，然后吸取1ml至第2管，混匀后再吸取1ml至第3管，如此连续倍比稀释至第11管，并从第11管中吸取1ml弃去，第12管为不含药物的生长对照，然后在每管内加入上述制备好的菌液各1ml，将试管置于37℃温箱中培养25h后，肉眼观察不浑浊试管浓度即为受试菌的最小抑菌浓度。
优选地，步骤4)所述121℃灭菌，灭菌时间为23min。
优选地，步骤5)所述的菌悬液调至108个/ml。

Claims (4)

1.博落回提取物对微生物抑制效力的测定，其特征在于，包括以下步骤：
1)博落回原料提取：取博落回干燥之后的地上部分，粉碎至40-50目粗细之后，加入pH为5的80％乙醇，回流2小时之后过滤，合并滤液并且浓缩至乙醇回收完全，加入等体积的水，静置，得沉淀，去上清液，滤渣真空干燥之后得到橙色粉末状博落回提取物；
2)待测样品溶液配制：取步骤1)所述的博落回提取物20.0m于250ml容量瓶中，加约200ml0.1％磷酸水溶液超声处理26-32min，冷却至室温，用0.1％磷酸水溶液稀释至刻度，摇匀，得供试样品溶液；
3)标准样品溶液配制：准确称取血根碱、白屈菜红碱标准品各25.0mg于250mL容量瓶中，用0.1％磷酸水溶液定容，配制成混合标准品储备液；
4)试验用培养基配制：普通肉汤培养基：蛋白胨10g，牛肉膏5g,氯化钠5g,磷酸氢二钾1g，蒸馏水1000ml，加热溶解，调pH7.4-7.6，再加热12-18min，补足水分，121℃灭菌；
5)提取物药敏纸片的制备：将定性滤纸用直径6mm的打孔器大成6mm的圆片，经高压灭菌处理后，置100℃烘干，保存备用，每一部分配制成合适的浓度后，把灭好菌的直径为6mm的滤纸片放入溶剂中浸泡4h以上后取出，待溶剂挥发干后使用，对照为灭菌后的蒸馏水纸片；
6)抑菌效力测定的步骤为：分别移取0.1ml处于对数生长期的大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的菌液，均匀涂布于普通肉汤培养基表面，取直径6mm灭菌滤纸片浸入1.5mg/ml、3.0mg/ml、4.5mg/ml待测博落回提取物溶液中38-42min后取出，待干放入接种平板中，将平板置于37℃温箱中培养24h后观察，每种菌取3个纸片抑菌圈直径平均值记录；
7)对照组分别移取0.1ml处于对数生长期的大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的菌液，均匀涂布于普通肉汤培养基表面，取直径6mm灭菌滤纸片浸入1.5mg/ml、3.0mg/ml、4.5mg/ml标准样品溶液中38-42min后取出，待干放入接种平板中，将平板置于37℃温箱中培养24h后观察，每种菌取3个纸片抑菌圈直径平均值记录；
8)对照步骤5)及步骤6)的反应结果，得出结论。
2.博落回提取物对微生物最小抑菌浓度的测定，其特征在于，包括以下步骤：
1)博落回原料提取：取博落回干燥之后的地上部分，粉碎至40-50目粗细之后，加入pH为5的80％乙醇，回流2小时之后过滤，合并滤液并且浓缩至乙醇回收完全，加入等体积的水，静置，得沉淀，去上清液，滤渣真空干燥之后得到橙色粉末状博落回提取物；
2)试验用培养基配制：普通肉汤培养基：蛋白胨10g，牛肉膏5g,氯化钠5g,磷酸氢二钾1g，蒸馏水1000ml，加热溶解，调pH7.4-7.6，再加热12-18min，补足水分，121℃灭菌；
3)菌悬液制备：将各供试菌种接种于步骤2)所述的培养基上，进行活化，恒温37℃培养18-24h,用接种环挑取一环菌体放入装有玻璃珠的生理盐水里，充分振荡，用血球计数板计数；
4)所述最小抑菌浓度测定的步骤为：采用微量肉汤稀释法测定博落回提取物对不同微生物的最小抑菌浓度，取无菌试管13支，除第1管加入1.6ml肉汤外，其余每管加入肉汤1ml，在第1管加入2560μg/ml博落回提取物0.4ml混匀，然后吸取1ml至第2管，混匀后再吸取1ml至第3管，如此连续倍比稀释至第11管，并从第11管中吸取1ml弃去，第12管为不含药物的生长对照，然后在每管内加入上述制备好的菌液各1ml，将试管置于37℃温箱中培养23-25h后，肉眼观察不浑浊试管浓度即为受试菌的最小抑菌浓度。
3.根据权利要求1所述的博落回提取物对微生物抑制效力的测定，其特征在于，步骤4)所述121℃灭菌，灭菌时间为18-23min。
4.根据权利要求2所述的博落回提取物最小抑菌浓度的测定，其特征在于，步骤5)所述的菌悬液调至107-108个/ml。
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