CN113637615B - 一种融合魏斯氏菌、培养方法及其应用 - Google Patents

一种融合魏斯氏菌、培养方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种具有辅助消化能力的融合魏斯氏菌Weissella confusa WSG1，涉及微生物技术领域。所述菌株于2021年6月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.22697，核酸序列如SEQ:NO.1所示。本发明的菌株克服了现有技术中抗生素等药物治疗效果差的问题，具有良好的安全性，能够在胃肠道环境中生存，且对抗生素的耐药性良好，对常见引起腹泻病原菌具有显著抑制效果，具有辅助消化的能力，且口服无毒性。为维持犬类机体肠道健康能力益生菌开发提供了一种新的可选菌株。

Description

一种融合魏斯氏菌、培养方法及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种融合魏斯氏菌、培养方法及其应用。
背景技术
在犬类未被家养驯化前，他们在自然环境中摄取各类的生食，通过生食来补充自己体内的益生菌。但是宠物犬早就脱离了自然环境，在家中豢养，长期吃狗粮、罐头之类的加工食品，可能没法从这些食品中获得适量益生菌的补充，甚至这些食品中额外的添加剂会破坏宠物犬体内的菌落平衡，使宠物犬发生腹泻、呕吐等问题。某些犬类的消化系统未发育完全，消化能力较弱，腹泻、呕吐等现象更为常见。现有技术中常用抗生素等药物进行治疗，使得病原菌产生抗药性，甚至出现病情反复的情况。
发明内容
本发明的目的在于提供一株能提高犬类消化能力、抑制常见引起腹泻的病原菌的益生菌菌株，为维持犬类机体肠道健康能力益生菌的开发提供新的可选菌株。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种融合魏斯氏菌，所述融合魏斯氏菌为融合魏斯氏菌Weissellaconfusa WSG1，于2021年6月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.22697。
优选的，所述融合魏斯氏菌的16S rRNA的核苷酸序列如SEQ:NO.1所示。
本发明还提供了一种融合魏斯氏菌的培养方法，将所述融合魏斯氏菌Weissellaconfusa WSG1接种于培养基中进行培养，所述培养的初始pH为5.0～6.5、所述培养的温度为35～38℃，所述培养的时间15～17h；
所述培养基包括碳源和氮源，所述培养基中碳源和氮源的含量独立地为1.0～3.0％。
优选的，所述碳源为葡萄糖、蔗糖、淀粉中的一种或几种。
优选的，所述氮源为蛋白胨、牛肉膏、酵母粉中的一种或几种。
本发明还提供了一种融合魏斯氏菌在制备辅助消化的药物中的应用。
优选的，所述药物为兽药。
优选的，所述兽药为犬类专用药。
本发明还提供了一种融合魏斯氏菌在制备饲料中的应用。
本发明还提供了一种融合魏斯氏菌在制备治疗腹泻的药物中的应用。
本发明的技术效果和优点：
本发明提供了一种具有辅助消化能力的融合魏斯氏菌Weissella confusa WSG1，通过溶血性评价和耐药性评价证实了菌株的安全性，能够在胃肠道环境中生存，且对抗生素的耐药性良好，对常见引起腹泻的病原菌具有显著抑制效果，具有辅助消化的能力，且口服无毒性。为维持犬类机体肠道健康能力益生菌开发提供了一种新的可选菌株。
附图说明
图1为中国科学院微生物研究所鉴定报告封面；
图2为中国科学院微生物研究所鉴定报告内容1；
图3为中国科学院微生物研究所鉴定报告内容2；
图4为菌株WSG1产生溶蛋白圈。
保藏说明
融合魏斯氏菌Weissella confusa WSG1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2021年6月11日，保藏编号为CGMCC NO.22697。
具体实施方式
本发明提供了一种融合魏斯氏菌，所述融合魏斯氏菌为融合魏斯氏菌Weissellaconfusa WSG1，于2021年6月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.22697。本发明中融合魏斯氏菌的16S rRNA的核苷酸序列优选如SEQ:NO.1所示。
本发明还提供了一种融合魏斯氏菌的培养方法，将所述融合魏斯氏菌Weissellaconfusa WSG1接种于培养基中进行培养。
在本发明中，所述培养的初始pH优选为5.0～6.5，进一步优选为5.5～6.2，还优选为5.8～6.0；本发明所述培养的温度优选为35～38℃，进一步优选为36～37℃；本发明所述培养的时间优选为15～17h，进一步优选为15.5～16.5h，还优选为15.8～16.2h；
在本发明中，所述培养基优选包括碳源和氮源，本发明所述碳源优选为葡萄糖、蔗糖、淀粉中的一种或几种，所述碳源的含量优选为1.0～3.0％，进一步优选为1.5～2.5％，还优选为1.7～2.0％。本发明所述氮源优选为蛋白胨、牛肉膏、酵母粉中的一种或几种，所述蛋白胨优选为酪蛋白胨，所述氮源的含量优选为1.0～3.0％，进一步优选为1.4～2.8％，还优选为1.9～2.5％；。
本发明还提供了一种融合魏斯氏菌在制备辅助消化的药物中的应用，所述药物优选为兽药，进一步优选为犬类专用药。在本发明中，所述药物中融合魏斯氏菌的活菌浓度为1×108～6×108CFU/kg，进一步优选为2×108～5×108CFU/kg，还优选为3×108～4×108CFU/kg；所述药物优选的以融合魏斯氏菌为唯一活性成分；进一步优选的，所述药物还包括其它辅助消化的活性成分；所述药物包括辅料，本发明对所述辅料的种类没有特殊限定，采用本领域常规的药物辅料即可。
本发明还提供了一种融合魏斯氏菌在制备饲料中的应用，所述饲料优选为犬类饲料，进一步优选为犬类专用饲料。在本发明中，所述饲料中融合魏斯氏菌的活菌浓度为1×108～6×108CFU/kg，进一步优选为2×108～5×108CFU/kg，还优选为3×108～4×108CFU/kg；所述饲料优选的以融合魏斯氏菌为唯一辅助消化的活性成分；进一步优选的，所述饲料还包括其它辅助消化的活性成分；所述饲料包括营养组分，本发明对所述营养组分的种类没有特殊限定，采用本领域常规的营养组分即可。
本发明还提供了一种融合魏斯氏菌在制备治疗腹泻的药物中的应用，所述药物优选为兽药，进一步优选为犬类专用药。在本发明中，所述药物中融合魏斯氏菌的活菌浓度为1×108～6×108CFU/kg，进一步优选为2×108～5×108CFU/kg，还优选为3×108～4×108CFU/kg；所述药物优选的以融合魏斯氏菌为唯一活性成分；进一步优选的，所述药物还包括其它治疗腹泻的活性成分；所述药物包括辅料，本发明对所述辅料的种类没有特殊限定，采用本领域常规的药物辅料即可。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
从幼犬粪便中分离得到融合魏斯氏菌Weissella confusa WSG1，于2021年6月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.22697；所述融合魏斯氏菌的核酸序列如SEQ:NO.1所示。
使用MRS培养基进行培养，进行相关性能测定。
实施例2
将活化好的菌株WSG1(保藏编号CGMCC NO.22697)以2％接种量接种至培养基中，37℃培养16h。
培养基初始pH为6.0；
培养基具体配方如下：
MRS培养基：
Figure BDA0003285281110000041
用平板法进行活菌计数，测得浓度为5.52×1011CFU/mL。
实验例1安全性评价-溶血性评价
实验过程:将菌株WSG1的新鲜培养物划线接种到含5％绵羊血的固体培养基上，观察是否有溶血现象产生，不产生溶血现象的判断为安全菌株。
实验结果：并未产生溶血现象。
实验例2安全性评价-耐药性评价
实验过程:通过K-B法和MIC法研究菌株WSG1对常见抗生素的耐药性，包括：万古霉素、氯霉素、头孢噻吩、阿莫西林、克林霉素、恩诺沙星、青霉素、头孢氨苄、头孢拉定、阿奇霉素、苯唑西林、头孢唑林、四环素、环丙沙星、马波沙星(MIC法)。
实验结果：抑菌圈直径(mm)及MIC值如表1、表2所示。
表1菌株WSG1对抗生素的抑菌圈直径(mm)
Figure BDA0003285281110000051
表2菌株WSG1的MIC(马波沙星)
MIC
WSG1 1.024mg/ml
可见，WSG1对抗生素的耐药性良好。
实验例3菌株鉴定
样品送至中国科学院微生物研究所进行鉴定，鉴定报告如图1～3所示。
实验例4耐酸耐胆盐能力评价
实验过程：模拟胃肠道环境，将菌株WSG1接种于含不同pH和胆盐浓度的培养基中，研究菌含量变化以确定菌株对酸碱的耐受性(pH2.0，3.0，4.0，5.0和胆盐浓度0.1％，0.3％，0.5％)。
实验结果：菌株WSG1在不同条件下的生存率如表3所示。
表3菌株WSG1在不同条件下的生存率
Figure BDA0003285281110000052
Figure BDA0003285281110000061
可见，WSG1具有在胃肠道环境中生存的能力。
实验例5对常见引起腹泻病原菌的抑制作用
实验过程：指示菌：大肠杆菌ATCC 25922，鼠伤寒沙门菌ATCC 14028，产气荚膜梭菌ATCC 13124。将菌株WSG1培养24小时，离心获得上清液并用0.22μm滤膜过滤，通过打孔法研究上清液对3种指示菌的抑制作用。
实验结果:菌株WSG1的上清液对3种指示菌的抑菌圈(mm)如表4所示，具有显著抑菌效果。
表4菌株WSG1的上清液对3种指示菌的抑菌圈
大肠杆菌 鼠伤寒沙门菌 产气荚膜梭菌
9.5 7.5 10.5
实验例6辅助消化能力-产蛋白酶能力研究
实验过程：将菌株WSG1过夜培养后离心并过滤，得到无细胞上清液，打孔法接入到1％脱脂奶平板中，通过观察其是否产生溶蛋白圈，判断其产蛋白酶能力，有蛋白溶解现象即为有降解蛋白能力。
实验结果：能够产生溶蛋白圈，如图4所示。
实验例7对小鼠的口服毒性试验
菌液制备：将菌株WSG1接种到MRS培养基中，培养24小时，平板计数，菌含量达4.75×1011CFU/mL。
7周龄ICR小鼠20只，经一周适应饲养后，随机分成2组，实验组小鼠按2.5×109CFU/Kg体重/天的量给予口服用无菌生理盐水稀释的菌悬液，对照组小鼠给予生理盐水口服处理，剂量为1mL，口服1次。10d内连续观察小鼠的活动状态，毒性迹象以及死亡情况。
实验结果：菌株WSG1口服急性毒性实验期间，未出现小鼠死亡情况，小鼠皮毛、饮水、躯体活动和行为模式均表现正常，未发现急性中毒体征和相关的毒性反应。
实验组小鼠体重增加与对照组相比有所下降，但无明显差异。
实验例8对犬的口服毒性试验
菌液制备：在酒精灯旁进行操作，用100μL移液枪吸取90μLWSG1菌液，注入至50mL离心管中，之后向离心管中加入30mL的10％葡萄糖溶液，混匀。
20只实验犬(4只幼年比格，4只成年比格，4只成年法斗，4只成年泰迪，4只成年中华田园犬)
将实验犬只平均分为两组(对照组与实验组)。对照组犬只每日正常饲喂，不限制饮水。实验组犬只每日正常饲喂，不限制饮水，并每只犬只每日按0.5mL/kg的剂量饲喂步骤1中配置的WSG1菌液(最终等同于每只犬只每日饲喂1.5μL的益生菌原液：按7×108CFU/Kg体重/天)，分2次饲喂。持续饲喂10日，每日观察每只犬只的粪便情况，并按照威豪粪便评分系统对每只犬的粪便进行评分。饲喂前后对每只犬只进行称重。
实验结果：
实验组：
①幼年比格：其中1只喂食益生菌后第1天粪便不成型；第3、4天粪便粘稠；另一只在2、3天粪便粘稠不成型；其余时间粪便良好。
②成年比格：其中一只第7天粪便较软，但基本成型；其余时间粪便良好。
③成年中华田园犬：全程未见明显粪便异常。
④成年泰迪：其中一只第6天粪便粘稠不成型；其余时间粪便良好。
⑤成年法斗：其中一只第3天粪便较软，但基本成型；其余时间粪便良好。
对照组：
①幼年比格：其中第1、4天粪便粘稠不成型；第3天粪便较软，但基本成型；其余时间粪便良好。另一只第1、3天粪便粘稠不成型，其余时间粪便良好。
②成年比格：其中一只第1天粪便粘稠，基本不成型；其余时间粪便良好。
③成年中华田园犬：全程未见明显粪便异常。
④成年泰迪：全程未见明显粪便异常。
⑤成年法斗：全程未见明显粪便异常。
采用曼-惠特宁检验再次对第九日数据进行分析，差异不显著，如表5所示，两组的粪便评分在十天内并无显著性差异。
表5
Figure BDA0003285281110000081
体重在实验期内实验组与对照组有所增加，但无组间差异性，如表6所示。
表6
Figure BDA0003285281110000091
因此，WSG1对犬并无毒性。
由以上实施例可知，本发明提供了一株能促进消化、抑制常见引起腹泻病原菌的融合魏斯氏菌Weissella confusa WSG1，溶血性评价和耐药性评价证实了菌株的安全性，能够在胃肠道环境中生存，且对抗生素的耐药性良好，对常见引起腹泻病原菌具有显著抑制效果，具有辅助消化的能力，且口服无毒性。为维持犬类机体肠道健康能力益生菌开发提供了一种新型可选菌株。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 上海信元宠物食品有限公司
<120> 一种融合魏斯氏菌、培养方法及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1429
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aggttacccc accggctttg ggtgttacaa actctcatgg tgtgacgggc ggtgtgtaca 60
agacccggga acgtattcac cgcggcgtgc tgatccgcga ttactagcga ttccgacttc 120
atgtaggcga gttgcagcct acaatccgaa ctgagacgta ctttaagaga ttagctcacc 180
ctcgcgggtt ggcaactcgt tgtatacgcc attgtagcac gtgtgtagcc caggtcataa 240
ggggcatgat gatttgacgt catccccacc ttcctccggt ttgtcaccgg cagtctcact 300
agagtgccca actgaatgct ggcaactagt aataagggtt gcgctcgttg cgggacttaa 360
cccaacatct cacgacacga gctgacgaca accatgcacc acctgtcacc ttgtccccga 420
agggaacgct ccatctctgg agttgtcaag ggatgtcaag acctggtaag gttcttcgcg 480
ttgcttcgaa ttaaaccaca tgctccaccg cttgtgcggg tccccgtcaa ttcctttgag 540
tttcaacctt gcggtcgtac tccccaggcg gagtgcttaa tgcgttagct gcggcactta 600
agggcggaaa ccctcaaaca cctagcactc atcgtttacg gtgtggacta ccagggtatc 660
taatcctgtt tgctacccac actttcgagc ctcaacgtca gttacagtcc agaaagccgc 720
cttcgccact ggtgttcttc catatatcta cgcatttcac cgctacacat ggagttccac 780
tttcctctac tgcactcaag tcatccagtt tccaaagcaa ttcctcagtt gagctgaggg 840
ctttcacttc agacttaaat aaccgtctgc gctcgcttta cgcccaataa atccggataa 900
cgcttggaac atacgtatta ccgcggctgc tggcacgtat ttagccgttc ctttctggta 960
agataccgtc acacattgaa cagttactct caatgtcatt cttctcttac aacagtgttt 1020
tacgagccga aacccttcat cacacacgcg gcgttgctcc atcaggcttt cgcccattgt 1080
ggaagattcc ctactgctgc ctcccgtagg agtatgggcc gtgtctcagt cccattgtgg 1140
ccgatcagtc tctcaactcg gctatgcatc atcgccttgg taagccatta ccttaccaac 1200
tagctaatgc accgcgggac catctcttag tgatagcaga accatctttt aaataacaac 1260
catgcggttg tcattgttat acggtattag catctgtttc caaatgttat cccctgctaa 1320
gaggtaggtt tcccacgtgt tactcacccg ttcgccactc tttgcaatgt ccatcgtcat 1380
atctgagcaa gctcttcaaa tcagttgaac cacaaagcgt tcgactgca 1429

Claims (10)

1.一种融合魏斯氏菌，其特征在于，所述融合魏斯氏菌为融合魏斯氏菌Weissellaconfusa WSG1，于2021年6月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.22697。
2.根据权利要求1所述的融合魏斯氏菌，其特征在于，所述融合魏斯氏菌的16S rRNA的核苷酸序列如SEQ:NO.1所示。
3.权利要求1或2所述的融合魏斯氏菌的培养方法，其特征在于，将所述融合魏斯氏菌Weissella confusa WSG1接种于培养基中进行培养，所述培养的初始pH为5.0～6.5、所述培养的温度为35～38℃，所述培养的时间15～17h；
所述培养基包括碳源和氮源，所述培养基中碳源和氮源的含量独立地为1.0～3.0％。
4.根据权利要求3所述的融合魏斯氏菌的培养方法，其特征在于，所述碳源为葡萄糖、蔗糖、淀粉中的一种或几种。
5.根据权利要求4所述的融合魏斯氏菌的培养方法，其特征在于，所述氮源为蛋白胨、牛肉膏、酵母粉中的一种或几种。
6.权利要求1或2所述的融合魏斯氏菌在制备辅助消化的药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物为兽药。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述兽药为犬类专用药。
9.权利要求1或2所述的融合魏斯氏菌在制备饲料中的应用。
10.权利要求1或2所述的融合魏斯氏菌在制备治疗腹泻的药物中的应用。
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