CN103120200A

CN103120200A - 一种对肉制品具有抑菌保鲜活性的水溶性油橄榄多酚制备方法

Info

Publication number: CN103120200A
Application number: CN2013100279405A
Authority: CN
Inventors: 王成章; 叶建中; 吉清
Original assignee: Institute of Chemical Industry of Forest Products of CAF
Current assignee: Institute of Chemical Industry of Forest Products of CAF
Priority date: 2013-01-24
Filing date: 2013-01-24
Publication date: 2013-05-29

Abstract

本发明公开一种对肉制品具有抑菌保鲜活性的水溶性油橄榄多酚制备方法，筛选新鲜油橄榄叶干燥，破碎成0.5cm以下的粉末。油橄榄干叶与不同提取溶剂固液比为1∶6～30，50～100℃，沸腾时间为10～60min，提取2次，过滤，合并提取液，减压浓缩，再进行真空冷冻干燥，固体粉未含水量低于10％，制备不同提取物；再经过树脂纯化和溶剂萃取，萃取物中加入1～5％水溶性β-环糊精，真空干燥，制备60％～90％油橄榄多酚粉未。本发明制备的油橄榄叶提取物在1％～20％浓度下对于金黄色葡萄球菌的抑菌圈平均值为1.5cm～3.50cm，对大肠杆菌的抑菌圈平均值为1.20cm～3.20cm；处理生鲜肉和卤肉，油橄榄提取物与肉制品质量比为0.1％～5％，在空气中保鲜的货架期在0～15℃下延长3～5天，在真空包装下保鲜的货架期在0～15℃下延长10～30天。

Description

一种对肉制品具有抑菌保鲜活性的水溶性油橄榄多酚制备方法

一、技术领域

本发明涉及一种对肉制品具有抑菌保鲜活性的水溶性油橄榄多酚制备方法，属于生物医药和食品应用领域。

二、技术背景

国际微生物学会(IAMS)研究提出，优良的食品用防腐剂具有以下特性：①不仅仅抑制微生物生长和繁殖，最好能将其杀灭。如果添加后防腐剂能分解更佳；②具有抑制微生物的作用，若能残存而延续其作用至食品被消费之前或第二次加工之前亦可用；③与加热处理同时使用者，应具有对热的抵抗性；④其适应条件与在同样条件下食品可生长的微生物一致。目前很少有在pH5～7范围有效的防腐剂；⑤在其适用条件下，应同时对食物中毒病原性细菌及腐败性细菌均具有抑制效果；⑥为取代热处理的全部或一部分而使用的防腐剂应有如一般热处理一样的防制肉毒杆菌的安全措施；⑦不与食品产生反应以致消失，不因食品中相反作用的药剂而失去活性，在实际浓度下，不会被可能增殖到一定数量的微生物或其代谢物所破坏；⑧食品用防腐剂不应促进抗药性微生物的生长，能促进的应限用于这些抗药性微生物无法侵入的食品中。这两种情形应考虑互抗性；⑨用于药品中或饲料添加物中的防腐剂，应排除其使用于食品中。

我国对防腐剂的使用有着严格的规定，明确防腐剂应该符合以下要求：①限量内合理使用对人体健康无害；②不影响消化道菌群；③在消化道内可降解为食物的正常成分；④不影响药物抗菌素的使用；⑤对食品热处理时不产生有害成分。

目前有不少天然防腐剂开发利用并投放市场，但目前使用的大部分都是粗制品，其有效成分含量常随季节和地理环境而改变，有些天然防腐剂中到底是何种物质起作用还不甚清楚，更不用说分离出纯品进行毒理学评价。另外，各种防腐剂的作用机理、抗菌谱和可应用的范围等研究得也不够深刻。而且，天然防腐剂在实际应用中也存在很多问题，某些天然防腐剂用量少时达不到防腐效果，用量大时可能影响食品的风味和品质，甚至产生毒副作用，例如黄酮类作为防腐剂使用时，质量分数过高会使人感到苦涩味，还会由于氧化而使食品变色。部分现已开发的天然防腐剂普遍存在抗菌谱较窄的缺点，仅使用某一种不能完全抑制所有病菌的生长，同时使用多种，也可能对人体产生毒害等等，以上都是制约天然防腐剂开发利用进程的主要因素。

现在市场上的防腐剂大多是合成的防腐剂而天然防腐剂越来越受到大众的欢迎。橄榄叶中主要含有裂环烯醚萜及其苷、黄酮及其苷、低分子单宁等多酚类化合物，具有很好的防腐杀菌能力，是理想的天然防腐剂及食品添加剂。橄榄多酚能与蛋白质、生物碱、多糖结合，与多种金属离子发生络合或静电作用，具有还原性和捕捉自由基活性等，具有抗氧化、抗高血压、降血糖、加强免疫系统以及抑菌等作用。

本专利从油橄榄叶中提取分离多酚类抑菌物质，经过改善其溶解性、耐热耐酸性、增效剂配伍、色泽与风味，从而成为广泛应用于食品及其它工业的廉价天然防腐剂，取代部分目前常用的合成防腐剂。

三、发明内容

为实现上述目的，发明了一种对肉制品具有抑菌保鲜活性的水溶性油橄榄多酚制备方法，由以下步骤组成：

第一步，原料预处理

筛选新鲜油橄榄叶低温干燥，破碎成0.5cm以下的粉末；

第二步，不同油橄榄提取物制备

A水提取物：油橄榄干叶与去离子水质量比为1∶15～30，90～100℃提取2～4小时，提取2次，过滤，合并提取液，减压浓缩，浓缩液进行真空冷冻干燥，固体粉未含水量低于10％；

B醇提取物：油橄榄干叶与醇溶剂质量比为1∶6～20，70～80℃提取2～4小时，提取2次，过滤，合并提取液，减压浓缩，浓缩液进行真空冷冻干燥，固体粉未含水量低于10％；

C碱水提取物：油橄榄干叶与pH9～12碱水溶液质量比为1∶15～30，90～100℃提取2～4小时，提取2次，过滤，合并提取液，减压浓缩，浓缩液进行真空冷冻干燥，固体粉未含水量低于10％；

D碱性醇提取物：pH8～10醇-水质量百分浓度为30～80％，油橄榄干叶与pH8～10醇-水溶液质量比为1∶1∶6～20，提取温度为50～85℃，提取真空度300～740mmHg，沸腾时间为10～60min，浸提次数1～3次，过滤，合并碱性醇提取液，减压浓缩，浓缩液进行真空冷冻干燥，固体粉未含水量低于10％；

第三步，树脂精制

用碱调节第二步中不同油橄榄提取液至pH8～9，在5000转/分以上离心机离心过滤，滤液经过树脂吸附，用30～80％醇溶液解附，收集橄榄多酚洗脱部位，低温真空浓缩，回收醇溶剂，得到橄榄多酚浓缩液；第四步，溶剂萃取

用乙酸乙酸等体积萃取橄榄多酚浓缩液1～4次，合并有机层，低温真空浓缩，回收有机溶剂，得到橄榄多酚萃取液；

第五步，水溶性油橄榄多酚粉E未制备

在第四步油橄榄多酚萃取液中加入1～5％水溶性β-环糊精，真空干燥，制备60％～90％油橄榄多酚粉未，在水中溶解度10～40％

油橄榄叶中含有大量多酚、黄酮等抗氧化多酚化合物。本发明首先用不同提取溶液，如水、乙醇和PH9～11碱水，热回流提取，固液比1∶10～30，提取温度75℃～100℃，时间2～4小时，提取2次，水提取物中黄酮含量的平均值为1.5761mg·g^-1，多酚含量平均值为0.1584mg·g-¹；醇提取物中黄酮含量的平均值为4.7181mg·g^-1，多酚含量平均值为0.1257mg·g^-1；碱水提取物中黄酮含量的平均值为1.395mg·g^-1，多酚含量平均值为0.2703mg·g^-1。结果表明，不同提取液中黄酮和多酚含量存在差异，主要含有大量的杂质，黄酮和多酚的提取率10％～30％。

为了提高油橄榄叶黄酮和多酚的提取率，本发明采用减压沸腾碱性提取方式，提取方式为热提取、超声波提取和微波提取中任一种。热回流提取温度50℃～95℃，优选50℃～85℃，超声波提取功率300W～3KW，温度40℃～70℃，优选50℃～65℃，微波提取功率200～1000w，提取剂为醇-水质量百分浓度为30～80％提取溶液，所选用的醇为甲醇、乙醇中任一种，也可以用30～80％丙酮提取溶液，提取温度50～60℃，提取真空度300～700mmHg，沸腾时间为10～60min，提取2～3次，在减压沸腾状态下制备碱性醇提取物中黄酮含量的平均值为12.5724mg·g^-1，多酚含量平均值为32.3388mg·g^-1；多酚和黄酮提取率大于90％。与A、B和C提取方式相比，D提取方式黄酮提取率提高3倍，多酚提取率提高4倍。

为了制备60％～90％油橄榄多酚粉未，本专利采用树脂精制和溶剂萃取工艺，由于油橄榄叶含有大量的有机酸和酚酸类成分，本发明创新性用碱调节提取液PH8～9，所用的碱为为氢氧化钠、氢氧化钾、氨水中任一种。但提取液中含有大量水溶性蛋白、多糖、单宁等杂质，用碱调节提取液PH8～9，产生大量絮状沉淀物，用大于5000r/min离心机离心，分离沉淀，得到清液。本专利采用树脂吸附多酚，树脂为氧化铝、大孔吸附树脂、聚酰胺等中任一种。大孔吸附树脂优选D101、D201、D730、D130、AB-8、XAD-7等中任一种。解附所用的洗脱液用脂肪族低级醇和水的混合溶剂，醇与水的比例为10％～80％，优选乙醇。解附后的溶液进行浓缩，其中固溶物为10％～40％，5000转/分以上离心机离心，得到橄榄多酚水溶液；用乙酸乙酸等体积萃取橄榄多酚水溶液1～4次，合并有机层，低温真空浓缩，回收有机溶剂，浓缩液为水溶性油橄榄多酚。目前国际市场上油橄榄多酚提取物含量低于60％，尤其是水溶性不好。为了提高多酚的纯度和改善油橄榄多酚提取物中水中的溶解度，本专利在油橄榄多酚浓缩液中加入1～5％水溶性β-环糊精，真空干燥，制备60％～90％油橄榄多酚粉未，在水中溶解度10～40％。

油橄榄多酚具有很好的抗菌防腐功能，本发明专利比较不同油橄榄提取物(A-D)及高纯度水溶性油橄榄多酚(E)对于金黄色葡萄球菌(Sa.)和大肠杆菌(Ec.)抑制作用，培养结束后，观察抑菌圈情况，用刻度尺测量抑菌圈直径。直径＜10mm为较弱活性，直径＞15mm为较强活性，10mm～15mm之间为中等活性，大于25mm为超强活性。水提取物A、醇提取物B、碱水提取物C、碱性醇提取物D和水溶性油橄榄多酚粉末E中任一种提取物在1％～20％浓度下对于金黄色葡萄球菌的抑菌圈平均值为1.5cm～3.50cm，对大肠杆菌的抑菌圈平均值为1.20cm～3.20cm，抑菌作用大小依次为E＞D＞B＞C＞A，其中水溶性油橄榄多酚E对于金黄色葡萄球菌(Sa.)和大肠杆菌(Ec.)抑制作用最强，在1％～20％浓度下对于金黄色葡萄球菌的抑菌圈平均值为2.2cm～3.50cm，对大肠杆菌的抑菌圈平均值为2.60cm～3.20cm，并且随着油橄榄多酚浓度越高，抑菌的效果更好。

本发明制备油橄榄叶水提取物A、醇提取物B、碱水提取物C、碱性醇提取物D和水溶性油橄榄多酚粉末E中任一种提取物在1％～20％浓度下处理生鲜肉和卤肉，油橄榄提取物与肉制品质量比为0.1％～5％，生鲜肉和卤肉在空气中保鲜的货架期在0～15℃下延长3～5天，在真空包装下保鲜的货架期在0～15℃下延长10～30天。

本发明的有益效果表现为：

1.首次采用碱性醇溶液减压沸腾提取，与传统常规热回流提取比较，提取温度降低了30～50℃，提取时间缩短3～5倍，黄酮和多酚提取率高于90％，与传统提取方式相比，D提取方式黄酮提取率提高3倍，多酚提取率提高4倍。

2.采用碱性条件下树脂吸附多酚，有效除去杂质，采用乙酸乙酯再萃取多酚，加入1～5％水溶性β-环糊精，制备60％～90％油橄榄多酚粉未，在水中溶解度10～40％，产品水溶性好。本工艺简单，生产易行。

3.制备油橄榄叶水提取物、醇提取物、碱水提取物、碱性醇提取物和水溶性油橄榄多酚，对金黄色葡萄球菌(Sa.)和大肠杆菌(Ec.)具有抑制作用，对生鲜肉和卤肉在空气中保鲜的货架期在0～15℃下延长3～5天，在真空包装下保鲜的货架期在0～15℃下延长10～30天。

四、附图说明

图1芦丁标准曲线

图2没食子酸标准曲线

图3橄榄叶提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌效果

图4橄榄叶提取物对大肠杆菌的抑菌效果

图5水溶性油橄榄叶多酚对生鲜肉的防腐效果

图6水溶性油橄榄叶多酚(10％)对对卤肉的防腐效果

五、具体实施方式

以下实施例为本发明的一些举例，不应被看做是对本发明的限定。

实施例1对肉制品具有抑菌保鲜活性的水溶性油橄榄多酚制备

第一步，原料预处理

筛选新鲜油橄榄叶低温干燥，破碎成0.5cm以下的粉末，，如200nm，300nm，500nm，1000nm，10mm，50mm，100mm，200mm，300mm，500mm，优选500nm，1000nm，10mm，50mm，100mm；

第二步，不同油橄榄提取物制备

D碱性醇提取物：pH8～10醇～水质量百分浓度为30～80％，油橄榄干叶与pH8～10醇-水溶液质量比为1∶1∶6～20，提取温度为50～85℃，提取真空度300～740mmHg，沸腾时间为10～60min，浸提次数1～3次，过滤，合并碱性醇提取液，减压浓缩，浓缩液进行真空冷冻干燥，固体粉未含水量低于10％；

本实施例首先用不同提取溶液，如水、乙醇和pH9～11碱水，热回流提取，固液比1∶10～30，提取温度75℃～100℃，时间2～4小时，提取2次，水提取物中黄酮含量的平均值为1.5761mg·g^-1，多酚含量平均值为0.1584mg·g-¹；醇提取物中黄酮含量的平均值为4.7181mg·g^-1，多酚含量平均值为0.1257mg·g^-1；碱水提取物中黄酮含量的平均值为1.395mg·g^-1，多酚含量平均值为0.2703mg·g^-1。结果表明，不同提取液中黄酮和多酚含量存在差异，主要含有大量的杂质，黄酮和多酚的提取率10％～30％。

为了提高油橄榄叶黄酮和多酚的提取率，本实施例采用减压沸腾碱性提取方式，提取方式为热提取、超声波提取和微波提取中任一种。热回流提取温度50℃～95℃，优选50℃～85℃，超声波提取功率300W～3KW，温度40℃～70℃，优选50℃～65℃，微波提取功率200～1000w，提取剂为醇-水质量百分浓度为30～80％提取溶液，所选用的醇为甲醇、乙醇中任一种，也可以用30～80％丙酮提取溶液，提取温度50～60℃，提取真空度300～700mmHg，沸腾时间为10～60min，提取2～3次，在减压沸腾状态下制备碱性醇提取物中黄酮含量的平均值为12.5724mg·g^-1，多酚含量平均值为32.3388mg·g^-1；多酚和黄酮提取率大于90％。与A、B和C提取方式相比，D提取方式黄酮提取率提高3倍，多酚提取率提高4倍。

第三步，树脂精制

用碱调节第二步中不同油橄榄提取液至pH8～9，在5000转/分以上离心机离心过滤，滤液经过树脂吸附，用30～80％醇溶液解附，收集橄榄多酚洗脱部位，低温真空浓缩，回收醇溶剂，得到橄榄多酚浓缩液；

第四步，溶剂萃取

第五步，水溶性油橄榄多酚粉未制备

本实施例中用碱调节提取液PH8～9，所用的碱为为氢氧化钠、氢氧化钾、氨水中任一种。提取液中含有大量水溶性蛋白、多糖、单宁等杂质，用碱调节提取液pH8～9，产生大量絮状沉淀物，用大于5000r/min离心机离心，分离沉淀，得到清液。

本实施例采用树脂为氧化铝、大孔吸附树脂、聚酰胺等中任一种，优选大孔吸附树脂。大孔吸附树脂优选D101、D201、D730、D130、AB-8、XAD-7等中任一种。解附所用的洗脱液用脂肪族低级醇和水的混合溶剂，醇与水的比例为10％～80％，优选乙醇。解附后的溶液进行浓缩，其中固溶物为10％～40％，优选30～40％，5000转/分以上离心机离心，得到橄榄多酚水溶液；用乙酸乙酸等体积萃取橄榄多酚水溶液1～4次，合并有机层，低温真空浓缩，回收有机溶剂，浓缩液为水溶性油橄榄多酚。在油橄榄多酚浓缩液中加入1～5％水溶性β-环糊精，真空干燥，制备60％～90％油橄榄多酚粉未，在水中溶解度10～40％。

实施例2油橄榄提取物制备

1.样品预处理

将新鲜橄榄叶用清水冲洗干净，室温下干燥，直到叶片表面水分完全干燥，分批放入真空干燥箱中，在真空740mmHg和温度50℃下进行干燥，每隔1h打开真空干燥箱，直至叶片完全干燥，再用多功能粉碎机对干燥的橄榄叶片进行粉碎，粉碎至细小的粉末，过50目筛子，油橄榄叶粉末备用。

2.不同溶剂提取

1)水浸提法

分别称取20g橄榄叶粉末于8个三角瓶中，各加入400ml蒸馏水，制成1∶20的固液比，放入恒温摇床中，在振荡频率130r/s、90℃提取，提取时间分别于2h、3h、4h、6h、8h、10h、12h、18h、24h各个时间段测量橄榄叶中总黄酮及多酚类物质含量，以此确定最佳提取时间。结果表明，提取3小时，2次，提取效果最好。提取液过滤，提取液减压浓缩，浓缩液进行真空冷冻干燥，得固体粉未0.52g，含水量8.5％，q总多酚含量5.6％。

2)醇提法

分别称取20g橄榄叶粉末于8个三角瓶中，各加入40％乙醇溶液，制成固液比1∶6～20，70～80℃放入恒温摇床中，在振荡频率130r/s下进行震荡浸提。分别于2h、4h、6h、8h、10h、12h、18h、24h各个时间段测量橄榄叶中总黄酮及多酚类物质含量，以此确定最佳提取时间。结果表明：固液比1∶10，80℃提取2，提取2次，过滤，合并提取液，减压浓缩，浓缩液进行真空冷冻干燥，固体粉未含水量8.8％，总多酚含量7.8％。

3)碱提法

分别称取20g橄榄叶粉末于8个三角瓶中，各加入pH9～12氢氧化钠水溶液，固液比1∶15～30，提取温度90～100℃，放入恒温摇床中，在振荡频率130r/s进行震荡浸提。分别于2h、4h、6h、8h、10h、12h、18h、24h各个时间段测量橄榄叶中总黄酮及多酚类物质含量，以此确定最佳提取时间。结果表明油橄榄干叶与PH9～12碱水溶液质量比为1∶20，提取2～4小时，提取2次，过滤，合并提取液，减压浓缩，浓缩液进行真空冷冻干燥，固体粉未含水量低于10％，总多酚含量5.2％。

4)减压沸腾提取

分别称取20g橄榄叶粉末于8个三角瓶中，用氢氧化钾或氢氧化钠或氨水溶液加入甲醇中调节PH10，配制70％醇溶液，固液比1∶6～20，提取温度50～100℃，优选65℃，提取真空度300～740mmHg，沸腾时间为10～60min，放入恒温摇床中，在振荡频率130r/s进行震荡浸提，每10min取样分析提取液中总黄酮及多酚类物质含量，以此确定最佳提取时间。结果表明，浸提次数2次，提取时间25min，合并提取液，减压浓缩，浓缩液进行真空冷冻干燥，固体粉未含水量低于8.0％，总多酚含量9.3％。

实施例3油橄榄叶提取物多酚和黄酮的检测

1.样品预处理

将不同提取方式的提取液用低速离心机，在转速3000r/s下离心分离10min，取上清液20ml用于黄酮及多酚含量的测定，其余上清液收集备用。

2.黄酮的检测

a)黄酮类化合物标准曲线的制备

精确称取已恒重的芦丁4.8mg，用95％乙醇溶解，用30％乙醇定容于50mL容量瓶中，配成浓度为0.096mg/mL的芦丁标准溶液。

精密量取芦丁标准液(96.0μg/ml)0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0ml分别置于已校正的10ml试管中，然后加入0.3ml5％NaNO₂，摇匀，静置6min。再加入0.3ml10％Al(NO₃)₃，摇匀，静置6min，加4ml4％NaOH，摇匀，静置10min，加蒸馏水稀释至10ml刻度，摇匀。

以0.0ml的标准液管作空白对照，在510nm处测吸光度。以吸光度为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。

b)黄酮含量测定

准确量取样品溶液2mL，然后加入0.3mL5％NaNO₂，摇匀，静置6min，再加入0.3mL10％Al(NO₃)₃摇匀，静置6min，加4mL4％NaOH，摇匀，静置10min，以芦丁标准溶液为对照在510nm处测定吸光度。

c)黄酮的标准曲线

黄酮的标准曲线如图1，芦丁标准曲线方程为Abs＝0.00971*(C)+0.00275，C为测量物的浓度，说明吸光度与测量物浓度成正相关，由此可计算出所测量提取物中黄酮的含量。

3.多酚类物质的检测

a)多酚类化合物标准曲线的制备

精确称取0.0140g的干燥没食子酸，用蒸馏水溶解，定容至100ml的容量瓶中，配成140mg/l的标准溶液。

精密吸取0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0ml没食子酸标准溶液分别定容于10ml容量瓶内，配成不同浓度的标准溶液。然后从各溶液中吸取1ml加入25ml容量瓶内，加10ml蒸馏水，摇匀，再加1.5mlFolin-Ciocalteu试剂，充分摇匀30s后，前加入6ml10％Na₂CO₃溶液，混匀，加水定容，摇匀，然后在30℃下避光放置反应2h。以0ml样品为空白，在765nm处测定吸光值，以吸光值为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。

b)多酚含量的测定

取1mL待测液加入25ml容量瓶内，加10ml蒸馏水，摇匀。再加1.5mlFolin-Ciocalteu试剂，充分摇匀30s后，加入6ml10％Na2CO3溶液，混匀，加水定容，再混匀。在30℃下避光反应2h，以没食子酸标准溶液为对照在765nm处测定吸光值。

c)没食子酸的标准曲线(如图2)Abs＝0.11872*(C)+0.00372，C为测量物的浓度，说明吸光度与测量物浓度成正相关，由此可计算出所测量提取物中多酚的含量。

4.结果计算

试样中黄酮及多酚含量按下式进行计算。

M = \frac{c \times n \times v}{2 \times m}

式中：

c——分光光度计所测得浓度(mg·L^-1)；

n——试样稀释倍数；

v——待测液的总体积(mL)；

m待测样品粉末的质量(g)；

计算结果保留四位有效数。

实施例4油橄榄叶提取物抑菌活性作用

1.橄榄叶抑菌液样品的制备

分别取油橄榄叶水提取物、乙醇提取物、碱水提取物、减压沸腾提取醇碱提取物及水溶性油橄榄多酚粉末，置于无菌烧杯中，再分别加入10ml无菌水，配制成5％、10％、20％的溶液，备用。

2.抑菌试验的准备

其中供试菌种大肠杆菌(Ec.)、金黄色葡萄球菌(Sa.)为实验室保留菌种。生鲜肉、卤猪肉为超市当天购买。实验所用试剂如表1所示，所用仪器如表2所示

表1试剂规格与厂家

表2仪器名称和厂家

1)培养基

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂、蒸馏水。热溶解，冷却后，调节pH至7.0～7.2，此为液体培养基，在其中添加2.0g琼脂粉，此为固体培养基，121℃灭菌20min。

2)海绵制备

将海绵打成直径、高都为1cm的圆柱形，高压蒸汽灭菌，烘干备用。

3)含菌平板制作

将新鲜配制的培养基置于121℃高温湿热灭菌20min，冷却到50～60℃时，在无菌操作台上倒平板，每个培养皿中倒15～20mL培养基，待平板冷却后，用划线法分别接种金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，制备含菌平板。

4)仪器的灭菌

倒平板所用培养皿和装有8mm滤纸片的培养皿用牛皮纸包好，塞好胶塞的试管、装有移液枪头的盒子分别用牛皮纸包好，将配制好的生理盐水、固体培养基分别用纱布和牛皮纸封好。将其在121℃，100Pa下高压灭菌20min。

5)调节菌落浓度

将溶化的固体培养基倒入20mL左右于培养皿中，置于净化操作台上，自流平冷却。

取7支试管，依次稀释活化好的菌悬液，1号试管为原液经生理盐水稀释10倍后的菌悬液，2号试管为稀释100倍的菌悬液，依次稀释后，第七号试管为稀释107倍的菌悬液。

移取100μL1～7号试管中的菌悬液涂布固体培养基，静置使其渗透于培养基中，后倒置培养皿，于生化培养箱中37℃培养24h。

根据菌落计算法则：菌落形成单位cfu×稀释倍数＝菌落数，计数可数菌落平皿，推算每皿菌落数，选择菌落涂布浓度为10⁵cfu/mL。

3.滤纸片法测定供试样品的抑菌活性

将无菌的海绵圆柱体浸入配制好的各个浓度的样品中。每一个含菌平板背面用记号笔划分成三个区域，标上1，2，3。在这三个区域分别打孔，将浸入5％浓度的海绵圆柱体置于1号孔中，10％的置于2号孔，20％的置于3号孔中。贴上标明平板内菌种和提取物类别的标签，将平板放到37℃的恒温培养箱中培养24h后，测量样品对Sa.和Ec.的抑菌圈直径。

4.样品MIC值的测定

1)按上法配制培养基、液体培养基接种与活化菌种，调节菌落浓度和配制测试样品，将样品溶液配置成120mg/mL，在1号平皿中加入样品溶液和生理盐水各1mL，混匀后从中取出1mL于2号皿中，后加1mL生理盐水，每皿2倍稀释，后在培养皿中倒入14mL的固体培养基。

2)各样品的MIC值的测定

将混合了样品的培养基倒平皿，自流平冷却凝固，以Sa.和Ec.为检测菌种，涂布平板，放置一段时间待菌悬液渗入，37℃下倒置生化培养24h。观察无菌生长的最低浓度平皿，记为此浓度为样品对于该菌种的MIC值。

5.橄榄叶多酚抑菌剂对生鲜肉的防腐效果研究

将超市买回来的生鲜肉切成3cm*3cm*1cm左右的长方块，分别涂上不同油橄榄多酚提取物梯度浓度的样品，放置于室温下让其自然腐败变质，每24h做一次感官鉴评，直至腐败为止，同时做空白对照。通过对肉质的外观、气味、弹性的鉴评来确定橄榄叶提取物是否有防腐作用。对生鲜肉的防腐还需要观察：提取物对于生鲜肉的颜色、味道是否有影响，用以评价提取物适不适合做生鲜肉的防腐剂。

6.结果

橄榄叶提取物对鲜肉的抑菌效果如表3。由表3可以看出：醇提取物和水提取物对于鲜肉的色泽有明显影响，乙醇提取物和水提取物对于鲜肉的防腐都有明显的作用，醇提取物的防腐效果好于水提取物。

表3橄榄叶提取液对鲜肉的抑菌实验感官鉴评结果

表4橄榄叶提取液对卤肉的抑菌实验感官鉴评结果

橄榄叶提取液对卤肉的抑菌实验感官鉴评结果如表4。由表4可以得出：乙醇提液和水提液，对于卤肉的色泽没有任何影响，反而加深了卤肉的棕红色，使卤肉更有色泽。提液本身具有的类似茶叶的清香味，但是没有影响卤肉本身的卤味。对卤肉的防腐效果较好，乙醇提液的防腐效果比水提液效果好。

肉和肉制品由于其高蛋白及较高水分特性，而易于腐败，尤其是在贮存过程中易于腐败变质而失去食用价值。其腐败源是微生物和酶类，尤其是微生物可导致肉蛋白质和脂肪分解而腐烂和酸败。传统肉类防腐保鲜的技术有低温冷藏、高温灭菌、调节aw值、调节pH值等，如果在传统防腐技术上，如真空包装、充惰性气体、肉类辐射保鲜技术等方法再添加天然防腐剂，则可进一步延长熟肉制品等的保持期。

表5橄榄叶提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌效果

表6橄榄叶提取物对大肠杆菌的抑菌效果

橄榄叶提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌效果，如表5，对大肠杆菌的抑菌效果，如表6。从表5～6知，油橄榄多酚具有很好的抗菌防腐功能，本实施例不同油橄榄提取物(A～D)及高纯度水溶性油橄榄多酚对于金黄色葡萄球菌(Sa.)和大肠杆菌(Ec.)抑制作用，培养结束后，观察抑菌圈情况，用刻度尺测量抑菌圈直径。直径＜10mm为较弱活性，直径＞15mm为较强活性，10mm～15mm之间为中等活性，大于20mm为超强活性。研究发现不同油橄榄提取物在1％～20％浓度下对于金黄色葡萄球菌的抑菌圈平均值为1.5cm～3.30cm，对大肠杆菌的抑菌圈平均值为1.20cm～3.15cm。抑菌作用大小依次为：E＞D＞B＞C＞A，其中水溶性油橄榄多酚对于金黄色葡萄球菌(Sa.)和大肠杆菌(Ec.)抑制作用最好，在1％～20％浓度下对于金黄色葡萄球菌的抑菌圈平均值为2.2cm～3.30cm，对大肠杆菌的抑菌圈平均值为2.60cm～3.150cm，并且随着油橄榄多酚浓度越高，抑菌的效果更好。

本实例制备油橄榄叶水提取物、醇提取物、碱水提取物、碱性醇提取物和水溶性油橄榄多酚粉末，与去离子水配制1％～20％浓度，如5％，10％和20％分别处理生鲜肉和卤肉，油橄榄提取物与肉制品质量比为0.1％～5％，优先3％，结果表明生鲜肉和卤肉在空气中保鲜的货架期在0～15℃下延长3～5天，在真空包装下保鲜的货架期在0～15℃下延长10～30天。结果见图4～5。

Claims

1.一种对肉制品具有抑菌保鲜活性的水溶性油橄榄多酚制备方法，其特征在于由以下步骤组成：

第一步，原料预处理

筛选新鲜油橄榄叶低温干燥，破碎成0.5cm以下的粉末；

第二步，不同油橄榄提取物制备

A水提取物：油橄榄干叶与去离子水质量比为1∶15-30，90-100℃提取2-4小时，提取2次，过滤，合并提取液，减压浓缩，浓缩液进行真空冷冻干燥，固体粉未含水量低于10％；

B醇提取物：油橄榄干叶与醇溶剂质量比为1∶6-20，70-80℃提取2-4小时，提取2次，过滤，合并提取液，减压浓缩，浓缩液进行真空冷冻干燥，固体粉未含水量低于10％；

C碱水提取物：油橄榄干叶与PH9-12碱水溶液质量比为1∶15-30，90-100℃提取2-4小时，提取2次，过滤，合并提取液，减压浓缩，浓缩液进行真空冷冻干燥，固体粉未含水量低于10％；

D碱性醇提取物：PH8-10醇-水质量百分浓度为30-80％，油橄榄干叶与PH8-10醇-水溶液质量比为1∶1∶6-20，提取温度为50-85℃，提取真空度300-740mmHg，沸腾时间为10-60min，浸提次数1-3次，过滤，合并碱性醇提取液，减压浓缩，浓缩液进行真空冷冻干燥，固体粉未含水量低于10％；

第三步，树脂精制

用碱调节第二步中不同油橄榄提取液至PH8-9，在5000转/分以上离心机离心过滤，滤液经过树脂吸附，用30-80％醇溶液解附，收集橄榄多酚洗脱部位，低温真空浓缩，回收醇溶剂，得到橄榄多酚浓缩液；第四步，溶剂萃取

用乙酸乙酸等体积萃取橄榄多酚浓缩液1-4次，合并有机层，低温真空浓缩，回收有机溶剂，得到橄榄多酚萃取液；

第五步，水溶性油橄榄多酚粉未E制备

在第四步油橄榄多酚萃取液中加入1～5％水溶性β-环糊精，真空干燥，制备60％～90％油橄榄多酚粉未，在水中溶解度10～40％。

2.根据权利要求1所述一种对肉制品具有抑菌保鲜活性的水溶性油橄榄多酚制备方法，其特征在于油橄榄叶的水提取物A、醇提取物B、碱水提取物C、碱性醇提取物D和水溶性油橄榄多酚粉末E中任一种提取物在1％～20％浓度下对于金黄色葡萄球菌的抑菌圈平均值为1.5cm～3.50cm，对大肠杆菌的抑菌圈平均值为1.20cm～3.20cm，抑菌作用大小依次为E＞D＞B＞C＞A，其中水溶性油橄榄多酚E对于金黄色葡萄球菌(Sa.)和大肠杆菌(Ec.)抑制作用最强，在1％～20％浓度下对于金黄色葡萄球菌的抑菌圈平均值为2.2cm～3.50cm，对大肠杆菌的抑菌圈平均值为2.60cm～3.20cm。

3.根据权利要求1所述一种对肉制品具有抑菌保鲜活性的水溶性油橄榄多酚制备方法，其特征在于油橄榄叶的水提取物、醇提取物、碱水提取物、碱性醇提取物和水溶性油橄榄多酚粉末中任一种提取物在1％-20％浓度下处理生鲜肉和卤肉，油橄榄提取物与肉制品质量比为0.1％～5％，生鲜肉和卤肉在空气中保鲜的货架期在0～15℃下延长3～5天，在真空包装下保鲜的货架期在0～15℃下延长10～30天。

4.根据权利要求1所述一种对肉制品具有抑菌保鲜活性的水溶性油橄榄多酚制备方法，其特征在于第二步D碱性醇提取物提取方式是超声波和微波中任一种。

5.根据权利要求1所述一种对肉制品具有抑菌保鲜活性的水溶性油橄榄多酚制备方法，其特征在于第二步醇溶剂为甲醇和乙醇中任一种。

6.根据权利要求1所述一种对肉制品具有抑菌保鲜活性的水溶性油橄榄多酚制备方法，其特征在于第二步和第三步中碱为氢氧化钠、氢氧化钾、氨水中任一种。

7.根据权利要求1所述一种对肉制品具有抑菌保鲜活性的水溶性油橄榄多酚制备方法，其特征在于第三步中树脂为聚酰胺、大孔树脂、氧化铝中任一种。