CN101003557A - 富含高纯度橄榄苦苷的油橄榄叶提取物的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种富含高纯度橄榄苦苷的油橄榄叶提取物的制备方法，包括以下步骤：先用极性溶剂对油橄榄叶进行提取，再碱性离心沉降，获得离心清液和沉淀物，接着进行膜藕合分离，得到通过纳滤膜的浓缩液，再介质吸附，对吸附介质进行洗脱得到洗脱液，真空浓缩，再进行真空冷冻干燥或喷雾干燥，获得橄榄苦苷含量大于50％的富含高纯度橄榄苦苷的油橄榄叶提取物。首次采用不同类型膜分离藕合技术和介质吸附耦合技术代替传统溶剂萃取法，不仅能提高橄榄苦苷的纯度，其中橄榄苦苷＞50％，而且节省能源、清洁环保。采用极性溶剂能最有效提取橄榄苦苷；而采用非极性溶剂能有效除去脂溶性，制备油橄榄叶软膏，有利于提高橄榄苦苷的产率和纯度。
Description
技术领域
本发明涉及一种油橄榄叶提取物的制备方法，尤其涉及一种富含高纯度橄榄苦苷的油橄榄叶提取物的制备方法。
背景技术
油橄榄(Olea europaea L)又名洋橄榄，是世界名贵常绿木本油料和果用树种，在植物分类上属于木犀科木犀榄属。油橄榄原产地中海沿岸国家，是亚热带作物，它的栽培历史逾6000年。油橄榄的果肉含油，用于榨取橄榄油。
中国橄榄(Canarium album Raeusch)，在植物分类上属于橄榄科橄榄属，中国橄榄又名青果，其果肉中不含油，在亚热带和热带广泛分布，我国南方将橄榄青果用于制作蜜饯、果脯等。因此，本发明专利所用的油橄榄与中国青果不是同一属植物。
我国于1964年在周总理的积极倡导下开始大规模引种，广泛种植于长江以南15个省区。由于我国是潜在的橄榄油消费大国，尤其近两年进口量以50％速度猛增，其中初榨橄榄油以150％速度增涨，因此，联合国粮农组织与我国农业部有着良好的合作，积极推广油橄榄在中国的发展。
就我国现有资源而言，每年因采收和修剪而废弃的油橄榄叶估计在数千至万吨(干重)。目前国内尚没有利用油橄榄叶进行橄榄苦苷的提取和利用，本发明专利的目的是充分利用油橄榄叶资源，提供一种富含高纯度橄榄苦苷的油橄榄叶提取物的制备方法。
研究表明：油橄榄叶中含有的抗氧化活性成分较之油橄榄果更为突出，尤其是橄榄苦苷、橄榄内酯和黄酮等多酚类化合物在叶中的含量明显高于果子和树皮。橄榄苦苷在临床上作为药品，能抑制病毒、细菌、微生物及其引起的毒素，对LDL胆固醇具有抗氧化作用，改善高血压、高血脂等心血管疾病，提高T淋巴细胞、NK细胞、吞噬细胞等的再生能力，加强细胞对病毒和感染的免疫能力。
国内有报道采用中国橄榄叶(青果叶)制备橄榄叶提取物，但含量均在15％以下，目前没有任何报道制备高纯度橄榄苦苷的方法。颜贻谦利用中国橄榄青果和叶制备橄榄多酚，申报了专利(CN1333203A)，其提取工艺是水提取、醇沉淀、乙酸乙酯萃取法制备80％橄榄多酚提取物，该工艺不仅溶剂损耗大，成本高，而且提取物中无橄榄苦苷。杨寅柯的专利(200410023233)报道一种橄榄叶提取物提取方法，该方法采用水漂洗、二氧化氯消毒、醇提取、浓缩和干燥，制备的提取物有效成分含量低于35％，不仅没有明确有效成分是什么，而且含量低，其药用受到限制。因此，从油橄榄叶中提取分离富含高纯度橄榄苦苷的油橄榄叶提取物，国内没有任何报道。
国外有专利报道油榄叶提取物的制备方法，美国专利(US5714150)采用95％甲醇室温浸泡油橄榄叶，回收溶剂后真空干燥，产品中橄榄苦苷含量很低。美国专利(US98101563)用80％甲醇溶剂热提取油橄榄叶、真空浓缩、粗提取物喷雾干燥，制备油橄榄叶提取物，其中橄榄苦苷含量低于40％。
发明内容
本发明的目的是提供一种橄榄苦苷含量高于50％的富含高纯度橄榄苦苷的油橄榄叶提取物的制备方法。
本发明采用如下技术方案：
一种富含高纯度橄榄苦苷的油橄榄叶提取物的制备方法，包括以下步骤：
第一步，用极性溶剂对油橄榄叶进行提取，其中极性溶剂与油橄榄叶的质量比例为(1-30)∶1，提取温度为20℃-90℃，提取时间为0.5h-72h，
第二步，离心沉降：将提取液浓缩至比重为1.01-1.14，调节PH至8-9，将其离心沉降，获得离心清液和沉淀物，
第三步，膜藕合分离：将离心清液依次通过陶瓷膜、超滤膜及纳滤膜处理，最后得到通过纳滤膜的浓缩液，其中，陶瓷膜平均孔径为0.1-0.5μm，超滤膜截留分子量为10000-50000道尔顿，纳滤膜截留分子量200-1000道尔顿，物料膜通量1-10m3/m2·h·Mpa，
第四步，介质吸附：用氧化铝、大孔吸附树脂、聚酰胺中的一种或两种以上的混合介质为填料对纳滤膜的浓缩液进行选择性吸附，吸附介质与上述通过纳滤膜的浓缩液体积比为1∶(5-20)，再对吸附介质进行洗脱得到洗脱液，洗脱用的淋洗剂为醇类水溶液，
第五步，干燥：将上述洗脱液真空浓缩至比重为1.03-1.14，进行真空冷冻干燥或喷雾干燥，获得橄榄苦苷含量大于50％的富含高纯度橄榄苦苷的油橄榄叶提取物。
本技术方案中，第一步中的极性溶剂为碳原子数为1-3的脂肪醇、丙酮、水中的一种或者两种以上的混合物。上述极性溶剂优选为质量浓度为40％-95％的乙醇水溶液、质量浓度为40％-100％的甲醇水溶液或质量浓度为40％-100％的丙酮水溶液中的一种。可在沉淀物中加入去离子水后离心沉降，除去沉淀物，合并两次离心的清液作为第三步膜耦合分离的物料。
本发明中第一步中的提取方式可选择热回流、室温浸泡、微波提取、超声波提取中的一种。热回流提取温度50℃-100℃，时间为0.5-10小时；室温浸泡提取24-72小时；微波提取功率100-2000W，时间10-120分钟，温度20℃-70℃；超声波提取功率300W-3KW，时间10-120分钟，温度20℃-70℃。从工业化角度、投资成本和提取效果综合分析，本发明优选热回流提取方式，提取温度50℃-70℃，时间为0.5-10小时。
在本发明方案中，用极性溶剂提取前，先用非极性溶剂对油橄榄叶进行提取，获得油橄榄叶软膏，再将提取后的残叶作为原料，提取橄榄苦苷，其中，非极性溶剂与油橄榄叶质量比例为(1-20)∶1，提取温度50℃-80℃，时间为0.5-5小时，非极性溶剂为C5-C7的脂肪烷烃或石油醚，优选石油醚。本技术方案中，所述油橄榄叶为3-20年树龄的叶子，而且叶子采集时间在每年的2月份或5月份，采集的鲜叶在30℃-50℃烘干，再阴干，获得所需油橄榄叶，其中含水量小于5％，橄榄苦苷含量大于1.0％以上。本技术方案中用HPLC分析方法分析橄榄苦苷的含量，步骤为，采用等梯度高效液相色谱法，HPLC分析要求：色谱柱为十八烷基化学键合固定相为填充剂，即ODS C18柱，规格为200×4.6mm；紫外检测波长为280nm，室温，流动相为甲醇和质量浓度为0.5％磷酸水溶液按体积比为1∶1-1∶3的混合液，流动相的流速为1mL/min。
本发明获得如下技术效果：
1.根据相似相溶原理，采用极性溶剂能最有效的提取橄榄苦苷，获得高纯度高收率的油橄榄叶提取物；而采用非极性溶剂能最有效的除去脂溶性，不仅制备油橄榄叶软膏，而且有利于提高极性溶剂提取橄榄苦苷的产率和纯度。
2.首次采用不同类型膜分离藕合技术和介质吸附藕合技术代替传统的溶剂萃取法，不仅能提高橄榄苦苷纯度，橄榄苦苷＞50％，而且节能、清洁环保。
3.首次采用PH沉降离心法纯化，不仅能除去高分子蛋白、胶质、叶绿素、高分子单宁等杂质，提高橄榄苦苷的纯度，而且有利于藕合膜组件的保护和再生，延长其寿命。
4.首次选择介质吸附橄榄苦苷，能有效的提高橄榄苦苷的含量大于50％.
5.本发明不仅能制备橄榄苦苷＞50％，还同时通过先用非极性溶剂提取实现对油橄榄叶软膏的提取，此外，提取物中总多酚＞80％。本发明专利的创新点在于采用PH沉降离心法纯化、不同类型膜分离藕合技术和介质吸附精制，制备富含高纯度橄榄苦苷的油橄榄叶提取物，其中橄榄苦苷＞50％总多酚＞80％。其技术优点在于用膜分离和介质吸附藕合技术代替传统的溶剂萃取法，制备高含量的橄榄苦苷的油橄榄叶提取物，本发明节省能源、清洁环保。
此外，本发明方法对于原料进行了特定的筛选和规定，才能有效的达到高含量高收率的油橄榄叶提取物。本发明中所述油橄榄(Olea europaea L)在植物分类上属于木犀科木犀榄属，又名洋橄榄，不包括橄榄科橄榄属中国橄榄(Canarium album Raeusch)品种。本发明原料要求用3-20年树龄的叶子，通过科学试验分析油橄榄叶中橄榄苦苷的季节性变化，首次阐明橄榄苦苷的富集规律，规定最佳采集月份为2月或5月，鲜叶通过热风烘干和阴干处理，热风烘干温度小于50℃，其中含水量小于5％，才能最有效的保证橄榄苦苷不分解，确保橄榄苦苷含量大于1.0％以上。否则叶子原料含水率高，极易引起酶解，破坏橄榄苦苷，降低橄榄苦苷的含量，阳光曝晒也引起橄榄苦苷含量下降，因此产物收率下降。若不采纳本发明规定的原料，生产高含量的橄榄苦苷提取物(橄榄苦苷＞50％总多酚＞80％)，不仅很难取得本发明的技术效果，而且收率低。生产成本大大提高。
本发明首先建立了油橄榄叶中橄榄苦苷的HPLC分析方法，其HPLC分析要求：色谱柱为十八烷基化学键合固定相为填充剂，即ODS C18柱，规格为200×4.6mm；紫外检测波长为280nm，室温，流动相为甲醇-0.5％磷酸溶液为1∶1-1∶3，优选1∶1(50∶50，v/v)，流动相的流速为1mL/min。本发明通过实验首次公开我国不同品种不同月份油橄榄叶中橄榄苦苷的含量，阐明了橄榄苦苷含量的季节性变化规律，公开了油橄榄叶的最佳采集时间，为油橄榄叶加工高纯度橄榄苦苷提供了科学的发现。
由表1可以看出，橄榄苦苷的含量有两个高峰期，分别是在2月份和5月份，其中2月份的含量最高。一年中油橄榄叶中橄榄苦苷含量的两个低谷期则是11月份和4月份，橄榄苦苷含量最高的为2月份的叶子，阿斯中达到了17.39％，皮削利的为16.67％，连莱星的橄榄苦苷的含量也达到了14.10％。橄榄苦苷含量最低时，是11月份，阿斯最低含量为0.33％，皮削利为1.09％，莱星为0.24％。因此本发明专利规定了叶子最佳采集时间，在每年的2月份或5月份采集，切忌在11月份和4月份采集，否则很难达到本发明的效果。
表1.不同品种不同月份油橄榄叶中橄榄苦苷的含量(％)
| 品种 | 阿斯 | 皮削利 | 莱星 |
| 2005.09 | 5.92 | 3.82 | 4.67 |
| 2005.10 | 2.10 | 1.35 | 1.24 |
| 2005.11 | 0.33 | 1.09 | 0.24 |
| 2005.12 | 13.32 | 10.44 | 4.03 |
| 2006.01 | 13.59 | 12.42 | 11.17 |
| 2006.02 | 17.39 | 16.67 | 14.10 |
| 2006.03 | 14.39 | 13.19 | 12.54 |
| 2006.04 | 0.37 | 2.13 | 0.31 |
| 2006.05 | 15.91 | 8.99 | 9.90 |
| 2006.06 | 14.35 | 5.56 | 10.08 |
| 2006.07 | 14.0 | 8.44 | 9.95 |
| 2005.08 | 7.49 | 5.43 | 6.76 |
在本发明中，权利要求对鲜叶的预处理方法，采用低于50℃热风烘干或自然阴干的方式，否则高于50℃热风烘干或日光曝晒都会引起橄榄苦苷分解，从而橄榄苦苷含量减少，达不到本发明的效果。表2是不同预处理方式的结果。
表2 不同干燥方式油橄榄叶中橄榄苦苷的含量(％)
| 干燥方式 | 烘干＜50℃ | 烘干＞50℃ | 自然阴干 | 日光曝晒干燥 |
| 20年生大树叶 | 3.50 | 0.86 | 3.97 | 1.12 |
| 3年生小树叶 | 2.98 | 0.37 | 3.23 | 0.54 |
在本发明中，采用不同极性的溶剂依次提取油橄榄叶中脂溶性物、水和醇溶物。先用亲脂性溶剂例如石油醚、正己烷、6号溶剂油对油橄榄叶进行提取后，回收溶剂制备油橄榄叶脂溶性软膏。非极性溶剂与油橄榄叶的质量比例为1-20∶1，优选5-10∶1；提取温度50℃-80℃，时间为0.5-5小时，优选3小时。
在本发明中，用亲水性溶剂例如40％-95％乙醇或40％-100％甲醇或40％-100％丙酮提取。提取剂与油橄榄叶的质量比例为1-30∶1，优选3-10∶1；提取方式包括热回流、微波提取、超声波提取。热提取温度5℃-100℃，时间为0.5-10小时；微波提取功率100-2000W，时间10-120分钟，温度20℃-70℃；超声波提取功率300W-3KW，时间10-120分钟，温度20℃-70℃。
从工业角度和生产成本分析，优选热回流浸提，提取温度50℃-70℃。不仅橄榄苦苷浸出率超过90％，而且可以设备投资少，运行成本低，可以满足工业化生产，达到高含量高收率的效果。表3是不同提取工艺的结果。
表3.不同浸提方式下橄榄苦苷的含量(原料中橄榄苦苷5.6％)
| 序号 | 浸提方式 | 浸提条件 | 投料量(g) | 固体抽提率(％) | 橄榄苦苷含量(％) | 橄榄苦苷浸出率(％) |
| 1 | 热回流 | 2h-5h80-100℃ | 300 | 30.5 | 12.2 | 65.8 |
| 2 | 热回流 | 4h-6h50-70℃ | 300 | 25.06 | 20.3 | 90.8 |
| 3 | 室温冷泡 | 4天/1天 | 300 | 16.4 | 27.1 | 79.4 |
| 4 | 微波提取 | 300-1500w/0.5-1h | 300 | 20.3 | 24.7 | 89.5 |
| 5 | 超声波提取 | 0.5h-1h | 300 | 22.6 | 22.8 | 92 |
本发明中，制备离心清液时，先将亲水性溶剂对油橄榄叶的提取液浓缩至比重为1.01-1.14，再加去离子水稀释，再用0.5％-5％碱液调节PH8-9，有大量的沉淀产生。选择转速3000-10000转/分离心机离心沉降，沉淀物中加入去离子水，沉淀物和去离子水的质量比例是1∶1-10，优选1∶4，除去沉淀物，合并两次的清液。本方法不仅除掉大量不溶性固体、胶质及叶绿素等杂质，提高提取液中橄榄苦苷的含量，而且保护膜组件和树脂，有利于提高生产效果。
在本发明中，采用膜藕合分离技术，将离心沉降的清液依次通过陶瓷膜、超滤膜和纳滤膜藕合装置，最后得到纳滤膜的浓缩液。无机陶瓷膜材质为三氧化二铝，平均孔径0.1-0.5μm，超滤膜截留分子量为10000-50000Dalton，优选20000Dalton，纳滤膜截留分子量200-1000Dalton，物料膜通量1-10m3/m2h·Mpa。与传统真空转鼓过滤机、硅藻土过滤机相比，采用陶瓷膜过滤技术，不仅除去细小不溶固体、大量高分子单宁、蛋白质、多糖、胶质、纤维、细菌及叶绿素等杂质，且大大降低后续超滤膜、纳滤膜及吸附树脂污染，在一定压力下，当物料滤液流过膜表面时，只允许水及比膜孔径小的小分子物质通过，达到溶液的净化、分离、与浓缩的目的，从而提高物料中橄榄苦苷的纯度。如表4所示。
表4.膜藕合装置处理的料液中橄榄苦苷的含量
| 序号 | 浸提方式 | 浸提条件 | 投料量(g) | 处理前橄榄苷含量(％) | 处理后橄榄苦苷含量(％) |
| 1 | 热回流 | 2h-5h80-100℃ | 300 | 12.2 | 18.4 |
| 2 | 热回流 | 4h-6h50-70℃ | 300 | 20.3 | 27.7 |
| 3 | 室温冷泡 | 4天/1天 | 300 | 27.1 | 36.4 |
| 4 | 微波提取 | 300-1500w/0.5-1h | 300 | 24.7 | 34.1 |
| 5 | 超声波提取 | 0.5h-1h | 300 | 22.8 | 33.9 |
本发明中，采用介质吸附分离技术对膜藕合装置处理的料液进行精制油橄榄提取物，提高橄榄苦苷的纯度达到50％以上。只有采用此组合技术，才能达到高纯度高收率的橄榄苦苷。如果将提取液直接进行树脂吸附，不仅物料对树脂污染大，致使树脂再生和利用率低，提高了成本，且很难精制50％橄榄苦苷。
本发明是用氧化铝、大孔吸附树脂、聚酰胺等中一种或几种介质为填料对纳滤膜的浓缩液进行选择性吸附，吸附介质与纳滤膜的浓缩液体积比为1∶5-20。大孔吸附树脂优选D101、D201、D130、AB-8、XAD-7等。解附所用的洗脱液用脂肪族低级醇和水的混合溶剂，醇与水的比例为10％-80％，优选乙醇。解附后的溶液进行浓缩，其中固溶物为30％-40％，然后真空干燥或喷雾干燥，产品为淡黄色油橄榄叶提取物，其中橄榄苦苷＞50％.如表5所示。
表5 膜藕合装置和介质吸附处理后油橄榄叶提取物精制产品
| 序号 | 吸附介质 | 产品得率(％) | 橄榄苦苷含量(％) |
| 1 | 聚酰胺树脂 | 1.0～2.0 | ＞70 |
| 2 | 氧化铝 | 0.7～1.5 | ＞70 |
| 3 | D101 | 3.0～4.5 | ＞50 |
| 4 | D130 | 3.0～3.5 | ＞60 |
| 5 | AB-8 | 2.0～3.5 | ＞60 |
| 6 | XAD-7 | 2.0～3.5 | ＞65 |
该制备方法可以直接用亲水性溶剂对油橄榄叶进行提取、离心沉降、膜分离、介质吸附和干燥，制备富含高纯度橄榄苦苷的油橄榄叶提取物，具有很好的稳定性和抗氧化性，用于治疗化学性肝损伤和糖尿病，抑制肿瘤和肿瘤的辅助化疗。本发明的制备方法同时包括橄榄苦苷的HPLC分析方法。
具体实施方式
实施例1
一种富含高纯度橄榄苦苷的油橄榄叶提取物的制备方法，包括以下步骤：
第一步，用极性溶剂对油橄榄叶进行提取，其中极性溶剂与油橄榄叶的质量比例为(1-30)∶1，例如比例可以选取为：1∶1，4∶1，7∶1，8∶1，10∶1，14∶1，17∶1，20∶1，22∶1，24∶1，27∶1，28∶1，29∶1，29.5∶1，30∶1，提取温度为20℃-90℃，例如可以选取为：25℃，35℃，40℃，50℃，60℃，70℃，75℃，80℃，85℃，提取时间为0.5h-72h，提取时间为0.5h，1h，3h，5h，6h，8h，9.5h，12h，14h，15h，16h，17h，18h，20h，30h，35h，40h，55h，60h，70h，71h，
提取方式可以为热回流、微波提取、超声波提取中的一种，热回流提取温度50℃-70℃，例如温度可以选取为：55℃，62℃，65℃，68℃，69℃，时间为0.5-10小时，例如可以选取为0.5h，1h，3h，5h，6h，8h，9.5小时；微波提取功率100-2000W，例如选取为200W，500W，1000W，1800W，时间10-120分钟，时间可以选取为15分钟，30分钟，35分钟，50分钟，60分钟，80分钟，110分钟，温度20℃-70℃，温度可以选取为25℃，40℃，50℃，60℃；超声波提取功率300W-3KW，例如可以选取为500W，1000W，1200W，1800W，2600W，时间10-120分钟，可以选取为15分钟，30分钟，35分钟，50分钟，60分钟，80分钟，110分钟，温度20℃-70℃，温度可以选取为25℃，40℃，50℃，60℃，优选热回流提取，
第二步，离心沉降：将提取液浓缩至比重为1.01-1.14，例如1.08，1.11，1.12，调节PH至8-9，例如8或者9，将其离心沉降，离心机的转速为3000-10000转/分，可以选取为5000转/分，7000转/分，8000转/分，获得离心清液和沉淀物，本实施例中可直接将该清液进行耦合分离，也可再在沉淀物中加入去离子水离心沉降，除去沉淀物，合并两次的离心清液，其中，离心机的转速为3000-10000转/分，可以选取为5000转/分，7000转/分，8000转/分，沉淀物和去离子水的质量比例是1∶(1-10)，可以选取为1∶1.5，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5，1∶6，1∶7，1∶8，1∶9，
第三步，膜藕合分离：将离心沉降清液依次通过陶瓷膜、超滤膜及纳滤膜藕合装置处理，最后得到通过纳滤膜的浓缩液，其中，无机陶瓷膜材质可以为三氧化二铝，陶瓷膜平均孔径0.1-0.5μm，可以为，0.2微米，0.4微米，超滤膜截留分子量为10000-50000Dalton(道尔顿)，纳滤膜截留分子量200-1000Dalton(道尔顿)，物料膜通量1-10m3/m2h·Mpa，可以选取为2m3/m2.h.Mpa，3m3/m2·h.Mpa，5m3/m2.h·Mpa，8m3/m2·h.Mpa，
第四步，介质吸附：用氧化铝、大孔吸附树脂、聚酰胺中一种或两种以上的混合介质为填料对纳滤膜的浓缩液进行选择性吸附，吸附介质与上述通过纳滤膜的浓缩液体积比为1∶(5-20)，例如可以选取为：1∶7，1∶9，1∶12，1∶14，1∶15，1∶18，1∶19，再对吸附介质进行洗脱得到洗脱液，洗脱用的淋洗剂为醇类水溶液，例如可以为10％-90％醇类水溶液，优选甲醇和乙醇水溶液，淋洗剂洗脱体积为吸附柱体积1-2倍，可以为1.2，1.5倍，1.7倍，
第五步，干燥：将上述洗脱液真空干燥浓缩，干燥温度为30℃-75℃，温度可以选取为40℃，55℃，60℃，65℃，70℃，真空度为500-760mmHg，例如可以选取为600mmHg，浓缩至比重1.03-1.14，例如为1.05，1.08，1.12，再进行真空冷冻干燥或喷雾干燥，冷冻干燥的温度为-40℃--20℃，可以为：-40℃，-30℃，-20℃，喷雾干燥温度为80℃-120℃，可以为80℃，90℃，100℃，110℃，120℃，获橄榄苦苷含量大于50％的富含高纯度橄榄苦苷的油橄榄叶提取物。
本实施例中，本技术方案中，第一步中的极性溶剂为碳原子数为1-3的脂肪醇、丙酮、水中的一种或者两种以上的混合物。上述极性溶剂优选为质量浓度为40％-95％的乙醇水溶液(浓度可以选取为50％，70％，85％)、质量浓度为40％-100％(浓度可以选取为50％，70％，85％)的甲醇水溶液或质量浓度为40％-100％(浓度可以选取为50％，70％，85％)的丙酮水溶液中的一种。可在沉淀物中加入去离子水后离心沉降，除去沉淀物，合并两次离心的清液作为第三步膜耦合分离的物料。第一步中的提取方式优选为热回流提取，提取温度50℃-70℃(例如可以选取为60℃)，时间为0.5-10小时，时间可以为0.8小时，2小时，4小时，5小时，6小时，8小时，9小时。在用极性溶剂提取前，先用非极性溶剂对油橄榄叶进行提取，获得油橄榄叶软膏，再将提取后的残叶作为原料，提取橄榄苦苷，其中，非极性溶剂与油橄榄叶质量比例为(1-20)∶1，提取温度50℃-80℃，温度可以选取为60℃，65℃，70℃，75℃，78℃，时间为0.5-5小时，时间可以为0.8小时，1小时，1.2小时，2.4小时，3小时，3.5小时，4小时，4.2小时，4.8小时，非极性溶剂为C5-C7(碳原子数为5-7，可以为5，6，7)的脂肪烷烃或石油醚，优选石油醚。本技术方案中，所述油橄榄叶为3-20年树龄的叶子，而且叶子采集时间在每年的2月份或5月份，采集的鲜叶在30℃-50℃烘干，例如温度为35℃，40℃，再阴干，获得所需油橄榄叶，其中含水量小于5％，橄榄苦苷含量大于1.0％以上。本技术方案中用HPLC分析方法分析橄榄苦苷的含量，步骤为，采用等梯度高效液相色谱法，HPLC分析要求：色谱柱为十八烷基化学键合固定相为填充剂，即ODS C18柱，规格为200×4.6mm；紫外检测波长为280nm，室温(可以为25℃)，流动相为甲醇和质量浓度为0.5％磷酸水溶液按体积比为1∶1-1∶3的混合液，如1∶1，1∶2，1∶3，流动相的流速为1mL/min。
实施例2
选择10-20年树龄的油橄榄树，取2月份收集的油橄榄鲜叶15kg，放通风阴凉处干燥，然后在烘箱中50℃以下鼓风3-20hr，测含水率低于5.0％，橄榄苦苷2.9％。取5kg干燥叶，破碎成细粉，加40kg石油醚(60℃-90℃)，70℃热回流提取，时间4小时，第二次提取加30kg石油醚(60℃-90℃)，重复以上操作。合并提取液，50℃下减压回收尽溶剂，得石油醚抽提物240g，为油橄榄叶软膏，收率4.8％。
将石油醚提取后的油橄榄叶，加50kg60％乙醇水溶液，70℃热提取，时间3小时，过滤，第二次提取加30kg50％乙醇水溶液，时间2小时，合并滤液。65℃下减压浓缩至比重为1.10，加水稀释至50kg，用碱调节PH8-9，离心沉淀，离心机的转速6000转/分；沉淀物中再加入去离子水，沉淀物和去离子水的质量比例是1∶1-10，除去沉淀物，合并两次的离心清液。澄清液依次通过陶瓷膜、超滤膜及纳滤膜藕合装置处理，最后得到纳滤膜的浓缩液10kg。无机陶瓷膜材质为三氧化二铝，平均孔径0.1-0.5μm，超滤膜截留分子量为40000Dalton(道尔顿)，纳滤膜截留分子量600Dalton(道尔顿)，物料膜通量6m3/m2h·Mpa。
再将纳滤膜的浓缩液10kg加水稀释到20kg，用5kgD130大孔树脂吸附后，分别用10kg水、10kg20％乙醇-水、5kg70％乙醇-水洗脱，65℃下减压浓缩回收溶剂至无醇味，高浓度醇洗脱液的浓缩物固含量为40％，再进行喷雾干燥，温度105℃，得到棕黄色粉末，即富含高纯度橄榄苦苷的油橄榄叶提取物，收率3.4％，其中橄榄苦苷68.9％，总多酚83.4％。
实施例3
选择3-10年树龄的油橄榄树，取5月份收集的油橄榄鲜叶20kg，放通风阴凉处干燥，然后在烘箱中50℃以下鼓风3-20hr，测含水率低于5.0％，橄榄苦苷5.6％。取3kg干燥叶，破碎成细粉，加25kg80％乙醇水溶液，70℃热提取，时间3小时，过滤，第二次提取加20kg 40％乙醇水溶液，时间2小时，合并滤液。65℃下减压浓缩至比重为1.10，加水稀释至30kg，用碱调节PH8-9，离心沉淀，离心机的转速4000转/分；沉淀物中再加入去离子水，沉淀物和去离子水的质量比例是1∶5，除去沉淀物，合并两次的离心清液。澄清液依次通过陶瓷膜、超滤膜及纳滤膜藕合装置处理，最后得到纳滤膜的浓缩液5kg。无机陶瓷膜材质为三氧化二铝，平均孔径0.1-0.5μm，超滤膜截留分子量为40000Dalton(道尔顿)，纳滤膜截留分子量600Dalton(道尔顿)，物料膜通量3m3/m2h·Mpa。
再将纳滤膜的浓缩液5kg加水稀释到10kg，用4kg聚酰胺树脂吸附后，分别用10kg水和5kg 80％乙醇-水洗脱，65℃下减压浓缩回收溶剂至无醇味，高浓度醇洗脱液的浓缩物固含量为35％，再进行真空冷冻干燥，温度-30℃，得到棕黄色粉末，即富含高纯度橄榄苦苷的油橄榄叶提取物，收率1.4％，其中橄榄苦苷72.9％，总多酚84.1％。
实施例4
选择3-10年树龄的油橄榄树，取5月份收集的油橄榄鲜叶20kg，放通风阴凉处干燥，然后在烘箱中50℃以下鼓风3-20hr，测含水率低于5.0％，橄榄苦苷5.6％。取5kg干燥叶，破碎成细粉，放入30L微波提取器中，加20kg 80％乙醇水溶液，微波提取功率100-2000W，微波频率2000MHz，搅拌器速度200r/min，时间45分钟，温度50℃。重复三次，合并提取液，65℃下减压浓缩至比重为1.10，加水稀释至30kg，用碱调节PH8-9，离心沉淀，离心机的转速8000转/分；沉淀物中再加入去离子水，沉淀物和去离子水的质量比例是1∶6，除去沉淀物，合并两次的离心清液。澄清液依次通过陶瓷膜、超滤膜及纳滤膜藕合装置处理，最后得到纳滤膜的浓缩液5kg。无机陶瓷膜材质为三氧化二铝，平均孔径0.1-0.5μm，超滤膜截留分子量为30000Dalton(道尔顿)，纳滤膜截留分子量400Dalton(道尔顿)，物料膜通量2m3/m2h·Mpa。
再将纳滤膜的浓缩液5kg加水稀释到10kg，用6kg XAD-7树脂吸附后，分别用30kg水和15kg 80％乙醇-水洗脱，65℃下减压浓缩回收溶剂至无醇味，高浓度醇洗脱液的浓缩物固含量为35％，再进行真空干燥，真空度650mmHg，温度55℃，得到棕黄色粉末，即富含高纯度橄榄苦苷的油橄榄叶提取物，收率3.0％，其中橄榄苦苷66.2％，总多酚85.7％。
实施例5
选择20年树龄油橄榄树，取5月份收集的油橄榄鲜叶20kg，放通风阴凉处干燥，然后在烘箱中50℃以下鼓风3-20hr，测含水率低于5.0％，橄榄苦苷2.6％。
取5kg干燥叶，破碎成细粉，放入50L超声波提取器中，加20kg 60％乙醇水溶液，微波提取功率2000W，搅拌器速度200r/min，时间30分钟，温度50℃。重复三次，合并提取液，65℃下减压浓缩至比重为1.10，加水稀释至30kg，用碱调节PH8-9，离心沉淀，离心机的转速5000转/分；沉淀物中再加入去离子水，沉淀物和去离子水的质量比例是1∶4，除去沉淀物，合并两次的离心清液。澄清液依次通过陶瓷膜、超滤膜及纳滤膜藕合装置处理，最后得到纳滤膜的浓缩液5kg。无机陶瓷膜材质为三氧化二铝，平均孔径0.1-0.5μm，超滤膜截留分子量为30000Dalton(道尔顿)，纳滤膜截留分子量400Dalton(道尔顿)，物料膜通量2m3/m2h·Mpa。
再将纳滤膜的浓缩液5kg加水稀释到10kg，用6kgAB-8树脂吸附后，分别用30kg水和15kg80％乙醇-水洗脱，65℃下减压浓缩回收溶剂至无醇味，高浓度醇洗脱液的浓缩物固含量为35％，再进行喷雾干燥，温度102℃，得到棕黄色粉末，即富含高纯度橄榄苦苷的油橄榄叶提取物，收率2.7％，其中橄榄苦苷60.2％，总多酚82.4％。
实施例6
选择15年树龄油橄榄树，取5月份收集的油橄榄鲜叶20kg，放通风阴凉处干燥，然后在烘箱中50℃以下鼓风3-20hr，测含水率低于5.0％，橄榄苦苷3.6％。
取3kg干燥叶，破碎成细粉，加25kg80％乙醇水溶液，70℃热提取，时间3小时，过滤，第二次提取加20kg 40％乙醇水溶液，时间2小时，合并滤液。65℃下减压浓缩至比重为1.10，加水稀释至30kg，用碱调节PH8-9，离心沉淀，离心机的转速大于3000转/分；沉淀物中再加入去离子水，沉淀物和去离子水的质量比例是1∶5，除去沉淀物，合并两次的离心清液。澄清液依次通过陶瓷膜、超滤膜及纳滤膜藕合装置处理，最后得到纳滤膜的浓缩液5kg。无机陶瓷膜材质为三氧化二铝，平均孔径0.1-0.5μm，超滤膜截留分子量为40000Dalton(道尔顿)，纳滤膜截留分子量600Dalton(道尔顿)，物料膜通量3m3/m2·h·Mpa。
再将纳滤膜的浓缩液5kg加水稀释到10kg，用4kg D101树脂吸附后，分别用10kg水和5kg80％乙醇-水洗脱，65℃下减压浓缩回收溶剂至无醇味，高浓度醇洗脱液的浓缩物固含量为35％，再进行真空干燥，温度60℃，真空度750mmHg，得到棕黄色粉末，即富含高纯度橄榄苦苷的油橄榄叶提取物，收率3.6％，其中橄榄苦苷56.3％，总多酚80.7％。
实施例7
选择3-10年树龄的油橄榄树，取5月份收集的油橄榄鲜叶20kg，放通风阴凉处干燥，然后在烘箱中50℃以下鼓风3-20hr，测含水率低于5.0％，橄榄苦苷5.6％。
取5kg干燥叶，破碎成细粉，放入30L微波提取器中，加20kg80％乙醇水溶液，微波提取功率100-2000W，微波频率2000 MHz，搅拌器速度200r/min，时间45分钟，温度50℃。重复三次，合并提取液，65℃下减压浓缩至比重为1.10，加水稀释至30kg，用碱调节PH8-9，离心沉淀，离心机的转速3000转/分；沉淀物中再加入去离子水，沉淀物和去离子水的质量比例是1∶6，除去沉淀物，合并两次的离心清液。澄清液依次通过陶瓷膜、超滤膜及纳滤膜藕合装置处理，最后得到纳滤膜的浓缩液5kg。无机陶瓷膜材质为三氧化二铝，平均孔径0.1-0.5μm，超滤膜截留分子量为30000Dalton(道尔顿)，纳滤膜截留分子量400Dalton(道尔顿)，物料膜通量2m3/m2h·Mpa。
再将纳滤膜的浓缩液5kg加水稀释到10kg，用6kg氧化铝吸附后，分别用30kg水和15kg 80％乙醇-水洗脱，65℃下减压浓缩回收溶剂至无醇味，高浓度醇洗脱液的浓缩物固含量为35％，再进行喷雾干燥，得到棕黄色粉末，即富含高纯度橄榄苦苷的油橄榄叶提取物，收率2.0％，其中橄榄苦苷78.6％，总多酚90.4％。
实施例8
选择20年树龄的油橄榄树，取2月份收集的油橄榄鲜叶15kg，放通风阴凉处干燥，然后在烘箱中50℃以下鼓风3-20hr，测含水率低于5.0％，橄榄苦苷2.9％。
取5kg干燥叶，破碎成细粉，加40kg石油醚(60℃-90℃)，70℃热回流提取，时间4小时，第二次提取加30kg石油醚(60℃-90℃)，重复以上操作。合并提取液，50℃下减压回收尽溶剂，得石油醚抽提物240g，为油橄榄叶软膏，收率4.8％。
将石油醚提取后的油橄榄叶，加50kg 60％乙醇水溶液，70℃热提取，时间3小时，过滤，第二次提取加30kg 50％乙醇水溶液，时间2小时，合并滤液。65℃下减压浓缩至比重为1.10，加水稀释至50kg，用碱调节PH8-9，离心沉淀，离心机的转速5000转/分；沉淀物中再加入去离子水，沉淀物和去离子水的质量比例是1∶1-10，除去沉淀物，合并两次的离心清液。澄清液依次通过陶瓷膜、超滤膜及纳滤膜藕合装置处理，最后得到纳滤膜的浓缩液10kg。无机陶瓷膜材质为三氧化二铝，平均孔径0.1-0.5μm，超滤膜截留分子量为40000Dalton(道尔顿)，纳滤膜截留分子量600Dalton(道尔顿)，物料膜通量6m3/m2h·Mpa。
再将纳滤膜的浓缩液10kg加水稀释到20kg，用5kgD201大孔树脂吸附后，分别用10kg水、10kg 20％乙醇-水、5kg 70％乙醇-水洗脱，65℃下减压浓缩回收溶剂至无醇味，高浓度醇洗脱液的浓缩物固含量为40％，再进行喷雾干燥，得到棕黄色粉末，即富含高纯度橄榄苦苷的油橄榄叶提取物，收率3.2％，其中橄榄苦苷56.9％，总多酚81.7％。
Claims (10)
1.一种富含高纯度橄榄苦苷的油橄榄叶提取物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
第一步，用极性溶剂对油橄榄叶进行提取，其中极性溶剂与油橄榄叶的质量比例为(1-30)∶1，提取温度为20℃-90℃，提取时间为0.5h-72h，
第二步，离心沉降：将提取液浓缩至比重为1.01-1.14，调节PH至8-9，将其离心沉降，获得离心清液和沉淀物，
第三步，膜藕合分离：将离心清液依次通过陶瓷膜、超滤膜及纳滤膜处理，最后得到通过纳滤膜的浓缩液，其中，陶瓷膜平均孔径为0.1-0.5μm，超滤膜截留分子量为10000-50000道尔顿，纳滤膜截留分子量200-1000道尔顿，物料膜通量1-10m3/m2·h·Mpa，
第四步，介质吸附：用氧化铝、大孔吸附树脂、聚酰胺中的一种或两种以上的混合介质为填料对纳滤膜的浓缩液进行选择性吸附，吸附介质与上述通过纳滤膜的浓缩液体积比为1∶(5-20)，再对吸附介质进行洗脱得到洗脱液，洗脱用的淋洗剂为醇类水溶液，
第五步，干燥：将上述洗脱液真空浓缩至比重为1.03-1.14，再进行真空冷冻干燥或喷雾干燥，获得橄榄苦苷含量大于50％的富含高纯度橄榄苦苷的油橄榄叶提取物。
2.根据权利要求1所述的富含高纯度橄榄苦苷的油橄榄叶提取物的制备方法，其特征在于第一步中的极性溶剂为碳原子数为1-3的脂肪醇、丙酮、水中的一种或者两种以上的混合物。
3.根据权利要求1所述的富含高纯度橄榄苦苷的油橄榄叶提取物的制备方法，其特征在于在离心沉降得到的沉淀物中加入去离子水后离心沉降，除去沉淀物，合并两次离心的清液作为第三步膜耦合分离的物料。
4.根据权利要求1或2所述的富含高纯度橄榄苦苷的油橄榄叶提取物的制备方法，其特征在于上述极性溶剂为质量浓度为40％-95％的乙醇水溶液、质量浓度为40％-100％的甲醇水溶液或质量浓度为40％-100％的丙酮水溶液中的一种。
5.根据权利要求1所述的富含高纯度橄榄苦苷的油橄榄叶提取物的制备方法，其特征在于第一步中的提取方式为热回流提取，提取温度50℃-70℃，时间为0.5-10小时。
6.根据权利要求1所述的富含高纯度橄榄苦苷的油橄榄叶提取物的制备方法，其特征在于，在用极性溶剂提取前，先用非极性溶剂对油橄榄叶进行提取，获得油橄榄叶软膏，再将提取后的残叶作为原料，提取橄榄苦苷，其中，非极性溶剂与油橄榄叶质量比例为(1-20)∶1，提取温度50℃-80℃，时间为0.5-5小时。
7.根据权利要求1或4所述的富含高纯度橄榄苦苷的油橄榄叶提取物的制备方法，其特征在于，所述油橄榄叶为3-20年树龄的叶子，而且叶子采集时间在每年的2月份或5月份，采集的鲜叶在30℃-50℃烘干，再阴干，获得所需油橄榄叶，其中含水量小于5％，橄榄苦苷含量大于1.0％以上。
8.根据权利要求6所述的富含高纯度橄榄苦苷的油橄榄叶提取物的制备方法，其特征在于，非极性溶剂为石油醚。
9.根据权利要求6所述的富含高纯度橄榄苦苷的油橄榄叶提取物的制备方法，其特征在于，非极性溶剂为正己烷或6号溶剂油中的一种。
10.根据权利要求1所述的富含高纯度橄榄苦苷的油橄榄叶提取物的制备方法，其特征在于，用HPLC分析方法分析橄榄苦苷的含量，步骤为，采用等梯度高效液相色谱法，HPLC分析要求：色谱柱为十八烷基化学键合固定相为填充剂，即ODS C18柱，规格为200×4.6mm；紫外检测波长为280nm，室温，流动相为甲醇和质量浓度为0.5％磷酸水溶液按体积比为1∶(1-3)的混合液，流动相的流速为1mL/min。
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Assignee: Tianyuan Oil Olive Tech Development Co., Ltd., Longman Assignor: Institute of chemical industry of forest products, Chinese Academy of forestry | Research Institute of forest chemical industry, Chinese Academy of forestry Contract record no.: 2012620000006 Denomination of invention: Method for preparing extractive of olive leaves rich in oleuropein in high purity Granted publication date: 20090401 License type: Exclusive License Open date: 20070725 Record date: 20120713 |
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