CN101747196A - 一种用菊芋制备绿原酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及菊芋提取绿原酸的方法，该方法是将菊芋杀青酶灭活处理后，在超声波或微波作用下，用溶剂对原料进行浸提，经固液分离后即得绿原酸提取液，再经聚酰胺或大孔树脂吸附分离洗脱精制后得到绿原酸纯品。其中所说溶剂为水、有机溶剂或有机溶剂与水的混合液。将菊芋经过杀青处理，超声或微波辅助有机溶剂或水浸提，可以提高绿原酸的得率，减少提取时间。以菊芋提取绿原酸纯品，不仅可以扩大绿原酸的原料来源，而且是对菊芋更具价值的开发利用，有着更好的经济效益与社会效益。

Description

一种用菊芋制备绿原酸的方法

技术领域

本发明涉及从菊芋中提取绿原酸的方法，以聚酰胺或大孔树脂对提取液进行分离纯化，并结合水或有机溶剂重结晶法精制绿原酸，属于生物化学产品的分离纯化领域。

背景技术

菊芋，俗名洋姜，拉丁名为Helianthus tuberosus L.，属菊科向日葵属一年生草本植物，原产于北美洲。17世纪被引种到欧洲。我国大部分省区也有栽培。菊芋以块茎繁殖为主，叶卵圆形或长圆形。叶片表面微小突起均匀分布，背面较为平滑。菊芋茎高一般在2m左右，在肥地高度可达3.5m以上。茎上遍布茸毛，一般叶腋内都生出分枝。菊芋根系为须根系，无主根。须根入土较深。菊芋的花为头状花序，生于分枝顶端，花盘外围为舌状花，内为两性筒状花，黄色，在日平均温度22℃时现蕾开花，花期50-60d。块茎形似马铃薯，皮黄白色或淡紫红色，肉白色多汁(东晓凤等，菊芋的特征特性及高产栽培技术，2008(4)：38，41)。

目前对菊芋的研究多集中在其经济和生态价值上(王丽芳等，菊芋植物利用研究，2006，9：15)。菊芋块茎约含有18％-20％的固形物，其中70％-80％是可溶性低聚果糖，另含有9％的蛋白质、6％的矿物质、少量淀粉及果胶类物质(隆小华等，耐寒抗旱治沙之星菊芋，2003(3)：23-24)，可用来制糖、酿酒，是重要的能源植物之一(丁红梅等，菊芋的综合利用及发展前景，2006(5)：5-8)。菊芋适应性强，可耐寒、耐旱、耐贫瘠、耐盐碱，能够经受霜打和抵御多种植物疾病(隆小华等，不同浓度海水胁迫对菊芋幼苗生长发育及磷吸收的影响，2004，24(3)：331-334)。在生态方面，菊芋其根系发达具有抗风沙及保持水土的作用，适于粗放种植。在治理沙漠和利用海涂方面的研究较多，并且初具规模(鹿天阁等，优良的防沙治沙植物——菊芋，2007(2)：58-60)。然而国内外对其生物活性研究较少，仅见于菊糖生物活性研究，菊芋叶片提取物的杀虫抑菌活性研究(刘海伟等，菊芋叶片提取物抑菌活性与化学成分的研究，2007，19：405-409)，菊芋叶片提取物过氧化物酶的研究(陈燕珍等，不同生育期菊芋叶片过氧化物酶同工酶表达特点的研究，2007，24(1)：25-27)和菊芋多酚氧化酶特性的研究(杨政水等，菊芋多酚氧化酶特性研究，2006，27(2)：24-25，43)，因此具有较大的研究潜力。

菊芋中含有绿原酸，绿原酸类化合物除具有抗氧化、利胆、抗菌、增高白血球、清除自由基的功能，还具有抗艾滋病毒、抗过敏、抗肿瘤、预防心血管疾病和糖尿病等功能(袁晓艳等，高效液相色谱-质谱法分析菊芋叶中的绿原酸类化合物，2008，26(3)：335-338)。绿原酸是一种具有良好开发前景的精细化学品，在国际上有“植物黄金”之称，国内外的研究认为它是很有希望抗艾滋病毒(HIV)的先导化合物(Holliday R，Holliday R，Phillips K.Health benefits ofthesunflower kernel.Cereal Foods World，2001，46(5)：205-208)。使用菊芋作为提取绿原酸的原料，可以有效利用菊芋这一大量的生物质，实现了菊芋的资源化利用，另外由于可以减少有害物质去除等一系列纯化的繁杂步骤，这对于用作药物的提取原料来说是非常重要的。菊芋中的绿原酸有很重要的价值，作为抗氧化剂、自由基消除剂有着更大的用途，本发明以菊芋为原料制取并分离绿原酸。

目前制备绿原酸的主要原料为金银花、杜仲叶等资源有限的高价原料，造成绿原酸产品价格很高。烟草提取绿原酸的专利(陈育如等，烟草作为制备绿原酸原料的应用及用烟草制备绿原酸的方法，CN1634853)，将烟草作为制备绿原酸的原料，但是由于烟草中含有烟碱等有害物质，且不易分离纯化，所以存在着许多技术问题。从一枝黄花中提取分离绿原酸的专利中(陈育如等，从一枝黄花中提取分离绿原酸的方法，CN101445456A)，以一枝黄花为原料制取绿原酸，但一枝黄花侵染力非常强，会对环境带来威胁。

菊芋作为一种低成本，来源广泛的原材料，用于提取绿原酸纯品不仅可以扩大绿原酸的原料来源，而且是对菊芋更具价值的开发利用，有着更好的经济效益与社会效益。

发明内容

本发明提供了一种以菊芋为原料生产绿原酸的方法。

本发明方法是将菊芋杀青处理后，在超声或微波作用下，用溶剂对原料进行浸提，经固液分离后得到绿原酸提取液，其中所说溶剂为水、有机溶剂或有机溶剂-水混合液。用微波或超声波方法辅助有机溶剂浸提，是有效的提取方法。

根据对产品质量的不同需要，可将绿原酸提取液按常规方法进一步浓缩得到高浓度产品，更好的技术方案是将绿原酸提取液经聚酰胺柱等分离纯化方法得到精制绿原酸产品。

本发明制备方法中所说的提取溶剂可以是水、甲醇、乙醇、丙酮或乙酸乙酯等单组分，或其中二种或多种的混合液，优选水、甲醇水溶液、乙醇水溶液，其中体积比推荐甲醇或乙醇∶水＝1∶0.1～1∶10，优选1∶0.2～1∶5，最好为1∶1.5。

本发明制备方法中原料与提取溶剂的固液比以重量计推荐为1∶4～1∶30，优选1∶8～1∶25，最好为1∶20。

上述方法中，超声波处理时浸提的时间推荐30秒至6小时，优选60秒至3小时，最好为90秒至2小时，温度为10～100℃，超声波频率为20KHz。微波处理时温度为10～100℃，时间为30秒至4小时。

上述方法中，原料在杀青处理时条件优选温度100～300℃，处理时间5秒～60分钟。杀青处理用烘烤法或用蒸汽或热水或热有机溶剂处理。

本发明的有机溶剂的pH值推荐用酸或碱调节为pH＜10，优选pH＜7，最好是pH 2～4。将菊芋作为原料制备绿原酸，除采用本发明公开的制备方法外，也可采用现有技术进行制备。

本发明中所得绿原酸提取液须聚酰胺或大孔树脂分离后得到绿原酸含量70％～98％的产品，再经水或氯仿或乙酸乙酯溶液重结晶，可得到含量90％～98％的纯品。

菊芋原料为菊科向日葵属植物，可以是菊芋的全草，最好是叶和茎。

分析方法：Thermo公司Hypersil ODS C18(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱；流动相A为磷酸氢二钠缓冲溶液(10mmol/L)，流动相B为甲醇。将绿原酸标准溶液(0.44mg/mL)进样，得到图1的HPLC图；各处理样品浸提液经滤膜精密过滤后，进行HPLC测定的操作与标准溶液相同。

图1是绿原酸标准品的HPLC图。用本发明的杀青工艺对菊芋进行提取，所得绿原酸提取液成分见HPLC图2和图3所示。图2为未杀青的菊芋绿原酸提取液HPLC图，而从图3可见，杀青处理使绿原酸分解酶失活，因此最终提取液中绿原酸含量比未经杀青处理的原料提取量大为增加(图3中主峰绿原酸的峰高481.6mAU值远高于图2中主峰绿原酸的峰高218.5mAU)，经杀青处理的菊芋，其浸提液中绿原酸含量为不经杀青处理的2.2倍。

提取绿原酸可按下列方案进行：

称取1.0g菊芋粉末加20mL、pH4.0的40％甲醇水溶液，50℃超声辅助浸提80min所分离的浸提液用HPLC分析；

称取1.0g菊芋粉末加20mL、pH为4.0的40％乙醇水溶液，50℃超声辅助浸提80min所分离的浸提液用HPLC分析；

分别用40％甲醇溶液(V/V)和40％乙醇溶液(V/V)对菊芋中绿原酸进行提取，所得提取液的HPLC分析结果见图5和图6所示。由图5和图6可见，使用甲醇溶液的浸提液中，绿原酸含量要比以乙醇溶液浸提的量多，但甲醇有一定的毒性，因此在工业生产上受到一定的限制。

用水为溶剂浸提所得的绿原酸浸提液HPLC分析结果见图4所示，与标品绿原酸HPLC图相比较，图4主峰是绿原酸成分。以水为溶剂提取的溶剂成本低，但所提取的绿原酸量比用40％甲醇和40％乙醇为溶剂时少，而且杂质较多，后续纯化工作量较大。

称取1.0g菊芋粉末加20mL、pH为4.0的丙酮-水(1∶2)溶液，50℃超声辅助浸提80min所分离的浸提液用HPLC分析，以丙酮和水混合溶剂经超声波浸提所得的浸提液用HPLC法测定，结果如图7所示。由图7可见，所得绿原酸与以乙醇为溶剂提取时相近，由于丙酮具有一定的毒性，因此以丙酮为溶剂不可取，可以采取乙醇和水按一定的配比作为提取溶剂来提取绿原酸。

将提取的绿原酸粗提液进行蒸发浓缩，然后用聚酰胺柱(柱规格1.5cm×28.0cm)对浓缩样进行分离，10％的乙醇洗脱，收集绿原酸洗脱液，旋转蒸发除去乙醇。干燥后用乙酸乙酯对产品进行重结晶，得到高纯度的绿原酸产品。图8为处理后的绿原酸HPLC图，由图可见，只有绿原酸峰，未见杂峰，说明杂质已大为减少，从而绿原酸纯度得到提高。

本发明将菊芋经过杀青处理，超声或微波辅助有机溶剂或水浸提，可以将绿原酸的得率提高2倍，而且可以缩短提取时间，经聚酰胺柱或大孔树脂吸附后洗脱，浓缩，重结晶得到绿原酸纯品。使用本发明工艺可以扩大绿原酸的原料来源，提高绿原酸得率，使菊芋得到更具价值的开发利用，有着更好的经济效益与社会效益。

附图说明

图1绿原酸标准品HPLC图

图2菊芋(未杀青)浸提液的HPLC图

图3菊芋(杀青)浸提液的HPLC图

图4以水提取菊芋中绿原酸的HPLC图

图540％甲醇提取菊芋中绿原酸的HPLC图

图640％乙醇提取菊芋中绿原酸的HPLC图

图7丙酮-水(1∶2)提取绿原酸的HPLC图

图8聚酰胺柱分离纯化得到绿原酸HPLC图

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。举例是为说明本发明的过程而非仅限于实施例。

实施例1：

原料杀青处理：温度100～300℃，处理时间5秒～60分钟。

称取1.0g经杀青处理的菊芋粉末(过40目筛)加20mL pH4.0的蒸馏水，50℃超声辅助浸提40min，过滤，收集滤液，滤渣用20mL pH4.0的蒸馏水再次超声辅助浸提40min。再过滤收集滤液。合并两次滤液，最后将滤液定容至50mL。浸提液用HPLC分析，结果如图4所示；

分离纯化方法如实施例2和实施例3所述。以下所有实施例中所提到的分离纯化方法均以实施例2和实施例3中所述方法为准。

实施例2：

将菊芋叶按固液比1∶20(W/W)加入pH为4.0、甲醇∶水1∶1.5的甲醇水溶液中，50℃超声辅助浸提2小时，过滤所得溶液即为绿原酸粗提液。将所得浸提液旋转蒸发进行浓缩，使浓缩后体积为5～10mL，收集备用。

称取6.0g聚酰胺，湿法装柱(柱规格1.5cm×28.0cm)。将提取后浓缩的样品过聚酰胺柱分离，10％的乙醇洗脱，收集绿原酸含量较高的洗脱液组分，旋转蒸发去除乙醇。干燥后用乙酸乙酯对产品进行重结晶。待晶体出现，倒掉母液即可以得到绿原酸含量为93％的纯品。母液可回收利用。所得产品色谱图如图8所示。

实施例3：

将菊芋的叶按固液比1∶25(W/W)加pH为4.0、甲醇∶水1∶1的甲醇水溶液中，50℃超声辅助浸提3小时，固液分离后，旋转蒸发得浓缩液备用。

称取大孔树脂16.0g，按常规预处理方式处理后，湿法装柱(柱规格1.5cm×28.0cm)。将提取后浓缩液过柱分离，吸附饱和的树脂用40％乙醇洗脱，收集绿原酸含量较高的洗脱液组分，旋转蒸发去除乙醇。最后用乙酸乙酯对产品进行重结晶。待晶体出现，倒掉母液即可以得到精制绿原酸产品。产品纯度可以达到90％以上。母液可回收利用。

实施例4：

将菊芋叶按固液比1∶4(W/W)加pH为2.0、甲醇∶水1∶0.1的甲醇水溶液中，在微波作用下浸提4小时，固液分离后，浓缩，分离纯化得精制绿原酸产品。

实施例5：

将菊芋的叶按固液比1∶30(W/W)加pH为7.0、甲醇∶水1∶10的甲醇水溶液中，100℃超声辅助浸提30秒，固液分离后，浓缩，经大孔树脂分离得精制绿原酸产品。

实施例6：

将菊芋的叶按固液比1∶12(W/W)加pH为8.0、甲醇∶水1∶0.2的甲醇水溶液中，10℃超声辅助浸提6小时，固液分离后，浓缩，经大孔树脂分离得精制绿原酸产品。

实施例7：

将菊芋的叶按固液比1∶8(W/W)加pH为6.0、甲醇∶水1∶5的甲醇水溶液中，20℃超声辅助浸提90s，固液分离后，浓缩，经聚酰胺分离得精制绿原酸产品。

实施例8：

将菊芋的叶按固液比1∶20(W/W)加pH为4.0、甲醇∶水1∶1.5的甲醇水溶液中，100℃微波辅助浸提30秒，固液分离后，浓缩，分离纯化得精制绿原酸产品。

实施例9：

将菊芋的叶按固液比1∶15(W/W)加pH为4.0、甲醇∶水1∶1.5的甲醇水溶液中，50℃超声辅助浸提1.5小时，固液分离后，浓缩，经聚酰胺分离得精制绿原酸产品。

实施例10：

与实施例9基本相同，不同之处在于有机溶剂为乙醇。

实施例11：

与实施例9基本相同，不同之处在于有机溶剂为乙酸乙酯。

实施例12：

与实施例9基本相同，不同之处在于有机溶剂为丙酮。

实施例13：

与实施例9基本相同，不同之处在于有机溶剂为50％乙醇。

实施例14：

与实施例9基本相同，不同之处在于有机溶剂为50％甲醇。

实施例15：

与实施例9基本相同，不同之处在于有机溶剂为丙酮-水(1∶2)。

Claims (10)

1.一种用菊芋制备绿原酸的方法，其特征在于：将菊芋经杀青处理后，用超声波或微波辅助溶剂浸提，经固液分离后即得到含绿原酸提取液，其中所说溶剂为水、有机溶剂或有机溶剂-水混合液，提取液经浓缩，柱分离纯化后得绿原酸纯品。

2.根据权利要求1所述的用菊芋制备绿原酸的方法，其特征在于：原料在杀青处理时的温度为100～300℃，处理时间5秒～60分钟，杀青处理用烘烤法或用蒸汽或热水或热有机溶剂处理。

3.根据权利要求1所述的用菊芋制备绿原酸的方法，其特征在于：超声波处理时温度为10～100℃，时间为30秒至6小时；微波处理时温度为10～100℃，时间为30秒至4小时。

4.根据权利要求1所述的用菊芋制备绿原酸的方法，其特征在于：所用溶剂是水、甲醇、乙醇、丙酮或乙酸乙酯单组分，或其中二种或多种的混合液。

5.根据权利要求1所述的用菊芋制备绿原酸的方法，其特征在于：菊芋原料与提取溶剂的固液比按重量计为1∶4～1∶30；提取溶剂pH＜10，在微波或超声波作用下浸提30秒至6小时，经固液分离后浓缩，分离纯化得绿原酸纯品。

6.根据权利要求5所述的用菊芋制备绿原酸的方法，其特征在于：菊芋与提取溶剂固液比为1∶8～1∶25，提取溶剂为甲醇、乙醇或丙酮与水的混合液，混合液中甲醇、乙醇或丙酮与水的体积为1∶0.1～1∶10，pH 1～6，在微波或超声波作用下浸提30秒至2小时，经固液分离后浓缩，分高纯化得绿原酸产品。

7.根据权利要求6所述的用菊芋制备绿原酸的方法，其特征在于：将菊芋按固液比1∶12～1∶20加入到甲醇∶水为1∶0.2～1∶5、pH 1～6的溶液中。

8.根据权利要求1所述的用菊芋制备绿原酸的方法，其特征在于：原料为菊芋的叶或茎或全草。

9.根据权利要求1-8之一所述的用菊芋制备绿原酸的方法，其特征在于：所得绿原酸提取液须聚酰胺或大孔树脂分离后得到绿原酸含量70％～98％的产品。

10.根据权利要求9所述的用菊芋制备绿原酸的方法，其特征在于：经聚酰胺或树脂分离后所得绿原酸产品再经水或氯仿或乙酸乙酯溶液重结晶，可得到含量90％～98％的纯品。

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