CN109053385A - 一种提取木犀草素和白藜芦醇的方法 - Google Patents

一种提取木犀草素和白藜芦醇的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种操作简单、工艺合理、快速同时提取木犀草素和白藜芦醇的方法,对新鲜花生藤进行微生物处理，采用乙醚回流提取，过滤，浓缩；滤渣加入复合菌发酵，乙醇回流提取，过滤，浓缩，加乙醚萃取，萃取液浓缩上大孔吸附树脂柱纯化，结晶，加乙醇溶解后脱色，再结晶得白藜芦醇纯品；下层液体加乙醇溶解，过滤，滤液上大孔吸附树脂柱，醇洗脱液浓缩，结晶得木犀草素纯品。

Description

一种提取木犀草素和白藜芦醇的方法
技术领域
本发明涉及一种从花生植物中提取分离木犀草素和白藜芦醇的方法，属于天然产物化学的技术领域。
背景技术
花生是我国第二大食用植物油源和蛋白质资源，其废弃物花生藤含有大量生物活性物质，以木犀草素和白藜芦醇为主，现已被作为木犀草素的提取原料，得到了充分利用。木犀草素属于黄色针状结晶，具弱酸性，可溶于碱性溶液中，溶于乙醇、甲醇等有机溶剂中,难溶于冷水,微溶于热水,木犀草素具有最强的抗氧化活性，其抗氧化性可用来抑制含油食品的酸败。药理及临床实验的结果表明木犀草素在体内具有抗菌、抗病毒、降低血脂和胆固醇、预防心血管疾病的作用；近年来，大量的国内外文献报道了木犀草素的抗肿瘤活性，结果表明它对多种肿瘤有显著抑制作用，能够干扰肿瘤细胞代谢、抑制细胞生长、诱导细胞凋亡。
白藜芦醇为(E)-3，5，4-三羟基二苯乙烯，为非黄酮类的多酚化合物，为白色针状晶体，难溶于水，易溶于乙醚、氯仿、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸、乙酯等有机溶剂，在波长365nm的紫外光照射下能产生荧光，并能和三氯化铁-铁氰化钾起显色反应，pH>10时，稳定性较差。
公开号为CN102040579A的中国专利介绍了一种利用花生根、茎、叶提取木犀草素的方法，步骤包括：(1)花生根、茎、叶的收集：在花生成熟采收期选晴天采收，将花生摘下后，去除根茎叶上的泥土，在太阳下晒干或在40～50℃下烘干；(2)粉碎原料至20～40目，按料液比1∶15加入75％乙醇，加热回流提取3h，过滤获得提取液，滤渣按料液比1∶10加入75％乙醇提取1.5h，过滤，合并滤液，减压浓缩至糖浆状；(3)将浓缩液按体积加入5份开水，搅拌，冷却至10℃以下，过滤，滤液加热至50℃，活性炭脱色，过滤，减压浓缩；(4)浓缩液用KLFC-150大孔树脂吸附，75％乙醇洗脱，收集含木犀草素的组分；(5)减压浓缩洗脱液得到木犀草素粗产品；(6)木犀草素粗产品重复(4)(5)步骤，得到较高纯度的木犀草素产品；(7)将(6)得到的木犀草素产品用75％乙醇溶解，加入与乙醇等体积的热水，减压蒸馏回收乙醇，余液冷却后至4℃下静置48h，得到木犀草素结晶；余液浓缩至1/3体积，至4℃下静置24h，进行结晶，得到木犀草素结晶，合并收集木犀草素结晶；(8)结晶按照(7)的方法重结晶1～2次，余液浓缩至1/3体积，在4℃下静置24h重结晶一次，合并2次结晶，真空干燥，得到高纯木犀草素。
公开号为CN104546997A的中国专利介绍了一种用于提取纯化花生壳有效部位的方法，包括如下步骤：(1)提取：将花生壳放入多功能提取罐中，加入85％乙醇水溶液，微压提取，提取两次，得提取液；(2)浓缩：对提取液旋蒸浓缩，静置收集沉淀；(3)重结晶：加入适量高浓度乙醇，搅拌直至沉淀中的木犀草素完全溶解，过滤得上清液；上清液加水至乙醇浓度约为40％时，过滤得上清液；继续对上清液加水至乙醇浓度约为20％时，过滤得沉淀；重复上述步骤数次；(4)柱洗脱：用一定浓度的乙醇溶液溶解上一步得到的沉淀，溶液通过D-101大孔树脂直接收集洗脱液，浓缩至干即得花生壳有效部位，其木犀草素纯度超过60％。
公开号为CN105130939A的中国专利介绍了一种从花生壳中提取木犀草素的方法，包括如下步骤：1)浸泡处理：将花生壳装入编织袋，扎好口，放在水池里，水池加满水，并在水池上面压上重物，浸泡；2)原料处理：将步骤1)得到的花生壳粉碎，加入相当于原料2-3倍重量的纯净水，加热至50-60℃维持5-10分钟，得到膏状浆液；3)酶解：将步骤2)得到的膏状浆液，调pH为4-5，加入膏状浆液0.05-0.1％重量份的果胶-纤维素复合酶和0.001重量份的甘露醇进行酶解40-60分钟，得到酶解液；4)去油：将步骤3)得到的酶解液，加入2-3倍重量的纯净水，加热至60-70℃浸提60-120分钟，得上层浮油液与下层液、渣混合物，分离；5)碱提：将步骤4)得到的下层液、渣混合物浓缩得浸膏，向浸膏中加入碱液，进行提取；6)萃取：向步骤5)得到混合溶液加入乙酸乙酯进行萃取，得到不含有乙酸乙酯的水溶液，加酸调pH至5.5以下，再加入石油醚进行萃取得萃取液；7)重结晶：将步骤6)得到的萃取液浓缩得浸膏，用75％乙醇水溶液溶解，加入等体积的50-60℃热水，浓缩回收乙醇，余液4℃下静置24h，得到木犀草素结晶，重结晶一次得到高纯度的木犀草素。
公开号为CN104710391A的中国专利介绍了一种利用花生壳提取木犀草素和β-谷甾醇的方法，步骤包括：(1)花生壳的收集：将花生壳晒干或烘干粉碎原料至20～40目，加入70～85％乙醇水溶液，加热至35～55℃回流提取2～5h，陶瓷膜过滤一次得滤液，滤渣重复提取一次，合并滤液；(2)向滤液中加入颗粒活性碳进行脱色，陶瓷膜过滤得脱色滤液；(3)将脱色滤液在40～50℃下进行减压浓缩至干，得干燥物，再加入质量比为7～12％的氢氧化钠水溶液，混合均匀后静置20～30min；(4)向第(3)步所得混合溶液加入乙酸乙酯进行萃取，得含有乙酸乙酯的萃取液和不含有乙酸乙酯的水溶液；(5)将含有乙酸乙酯的萃取液减压浓缩至干得到β-谷甾醇产品；(6)将不含有乙酸乙酯的水溶液加入盐酸调节pH，使pH小于5.5以下，加入两倍至三倍体积的石油醚进行萃取得萃取液；(7)将萃取液40℃下减压浓缩至干得到木犀草素粗品用75％乙醇水溶液溶解，加入等体积的45～70℃热水，减压浓缩回收乙醇，余液放入冰箱冷却至4℃下静置48h，得到木犀草素结晶，重结晶一次得到高纯度的木犀草素。
公开号为CN1709846的中国专利介绍了一种花生根提取白藜芦醇的生产方法，包括下列步骤：①原料预处理：将干花生根用乙醇和氢氧化钠的混合液浸泡处理；②用溶剂提取：将经步骤①处理的花生根用乙醇为溶剂进行浸泡提取，得提取液；③将步骤②得到的提取液经高压层析洗脱、精制得白藜芦醇产品。
公开号为CN103012071A的中国专利介绍了一种从花生粕中提取纯化白黎芦醇的方法，如下操作方法：(1)花生粕粉碎细化，加入10倍重量的95％乙醇，浸泡2～4h；(2)浸泡后将混合物进行超声波提取；(3)将提取液进行真空抽滤，得粗提取液，再进一步将滤渣与75％～95％乙醇溶剂混合，重复提取2次后，合并粗提取液进行浓缩；(4)将浓缩提取液上聚酰胺树脂，使用25％乙醇溶剂除杂；使用75％-95％乙醇溶剂洗脱；过程中使用薄层色谱法跟踪监测，收集富含白藜芦醇段洗脱液合并；将洗脱液浓缩得到粗结晶；将粗结晶用乙醇重结晶4～5次，真空冷冻干燥得到白藜芦醇。
公开号为CN103172498A的中国专利介绍了一种白藜芦醇的提取方法。本发明的花生白藜芦醇提取方法，包括如下步骤：(1)清洗浸提罐和浓缩罐；(2)浸提罐内加入花生壳和浸提溶剂；(3)投料完成，进行浸渍：密封浸提罐，打开压力阀，使浸提罐内压力保持在-0.01～-0.1MPa，保持10～150min；(4)将浸提罐内的浸提液提取到浓缩罐中浓缩；(5)浓缩完成，取出浓缩液，趁热取浓缩液上层部分溶液；(6)清洗浓缩罐，洗出浓缩罐中残留的有效成分；(7)将取出的上层部分溶液放入喷雾干燥设备中干燥、将有效成分的沉淀放入真空干燥设备中干燥；(8)待水分含量降低至10％以下，取出，粉碎。
公开号为CN104163754A的中国专利介绍了一种从花生根中提取分离高纯度白藜芦醇的方法，包括如下步骤：(1)花生根粉碎成细粉，用乙醇超声震荡提取，提取温度为20℃-60℃，提取时间为30-60分钟，提取两次，合并提取液；(2)提取液回收乙醇，浓缩至相对密度为1.18-1.22的清膏，冷却；(3)上述(2)的清膏上大孔吸附树脂柱吸附，分别以水、70％乙醇洗脱至洗脱液无色，然后用95％乙醇洗脱，收集95％洗脱的流分，回收乙醇至无醇味，再用聚酰胺树脂柱吸附分离，以醇-酸的混合液为洗脱液进行层析分离；(4)薄层色谱跟踪检测，收集白藜芦醇流分，用活性炭脱色后，过滤，滤液于50℃-70℃在通氮气保护下，低温减压浓缩至相对密度为1.15-1.18，冷冻干燥；(5)用乙醇重结晶，即得95％以上的高纯度白藜芦醇。
综上所述，木犀草素和白藜芦醇均具有较强的药理作用，在医药学领域的应用前景广阔。目前花生藤未得到综合开发利用，探索从花生藤中同时提取木犀草素和白藜芦醇意义非凡。
发明内容
针对花生藤的活性成分未综合开发利用问题，本发明提供一种操作简单、工艺合理、快速同时提取木犀草素和白藜芦醇的方法,对新鲜花生藤进行微生物处理，采用乙醚回流提取，过滤，浓缩；滤渣加入复合菌发酵，乙醇回流提取，过滤，浓缩，加乙醚萃取，萃取液浓缩上大孔吸附树脂柱纯化，结晶，加乙醇溶解后脱色，再结晶得白藜芦醇纯品；下层液体加乙醇溶解，过滤，滤液上大孔吸附树脂柱，醇洗脱液浓缩，结晶得木犀草素纯品。
因此，本发明提供一种提取木犀草素和白藜芦醇的方法，具体步骤包括如下：
A、将新鲜未去根的花生藤每天喷洒(1)号营养液一次，室温暗培养10～20天，再加入5～15％酵母菌液，继续培养3～5天，在40～50℃下干燥，再粉碎至80目～120目，加入乙醚回流提取80～100min，过滤，滤液(1)在55℃～65℃减压浓缩至原有体积的1/50～1/80，得浓缩液(1)，其中加入乙醚体积L与干花生藤重量kg比为3～5:1。
B、滤渣(1)加入5～15％复合菌发酵液2～3天，加入70～90％乙醇溶液回流提取2～4h，过滤得滤液(1)，在55℃～65℃减压浓缩至原有体积的1/40～1/60，得浓缩液(2)，其中加入乙醇溶液体积L与干花生藤重量kg比为4～6:1。
C、将浓缩液(1)和浓缩液(2)合并后加两倍至四倍体积的乙醚萃取60～120min，得乙醚液(1)和下层液体(1)。
D、将乙醚液(1)在55℃～65℃减压浓缩至原有体积的1/15～1/40，上大孔吸附树脂柱，用三倍至六倍柱体积的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液(1)，在55℃～65℃减压浓缩至原有体积的1/5～1/20，室温下放置至结晶析出，过滤得滤渣(2)。
E、滤渣(2)加乙醇溶液溶解，加适量活性炭脱色，静置30～60min，过滤，浓缩至结晶析出，放冷结晶，重结晶得白藜芦醇纯品。
G、将下层液体(1)用乙醇溶液溶解，过滤，滤液上大孔吸附树脂柱，先用三倍至五倍柱体积的水进行洗柱，弃去水洗脱液，再用三倍至六倍柱体积的乙醇溶液进行洗脱，得到洗脱液(2)。
H、将洗脱液(2)在50℃～60℃减压浓缩至原有体积的1/30～1/80，结晶，过滤，重结晶得木犀草素纯品。
所述过滤优选陶瓷膜过滤1次，膜孔孔径大小为0.22μm。
所述步骤A中所述(1)号营养液优选为含有5～100mg/L的6-BA、0.02～0.1g/LGA3的Ms无糖液体培养基，其中每次使用的量L与鲜花生藤重量kg比为5～20:100。
所述步骤A中所述加入酵母菌液的量L与干花生藤重量kg比5～15：100。
所述步骤B中所述加入复合菌发酵液的量L与干花生藤重量kg比5～15：100；复合菌发酵液的制备方法为用常规木霉液体培养基培养2～4天后，再加入酵母菌按每升液体培养基加入购买的酵母菌粉50～150g，搅拌均匀即可。
所述步骤D、E和G中所述乙醇溶液优选75～85％乙醇水溶液，即为乙醇与水的混合液，90％乙醇溶液是指90mL乙醇加入10ml水进行混合即可。
所述步骤D和G中所述大孔吸附树脂柱优选HP-20、XAD-4、XAD-16等。
所述步骤E中所述加入乙醇溶液的量L与滤渣(2)重量kg比为1～10:1；活性炭的量kg与滤渣(2)重量kg比为0.2～3:1。
所述步骤G中所述加入乙醇溶液的量L与下层液体(1)体积L比为1～3:1。
技术效果
1、通过促进花生藤腋芽生长和酵母刺激预处理，有利于花生藤中白藜芦醇的转化，大大提高了花生藤中白藜芦醇和木犀草素的含量，大大提高了花生藤的利用率和附加值，这有效降低了木犀草素和白藜芦醇的生产成本。
2、本发明原料采用乙醇回流提取，同时获得木犀草素和白藜芦醇醇提物，又提高了提取率，同时缩短了提取时间，又大大节省了能耗。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以下实施例旨在说明本发明而不是对本发明的进一步限定。
实施例1
将新鲜未去根的花生藤每天喷洒一次(1)号营养液15kg/100kg花生藤，室温暗培养20天，再加入10％酵母菌液，继续培养4天，在45℃下干燥，再粉碎至120目，取200kg加入700L乙醚回流提取100min，过滤，滤液(1)在55℃减压浓缩得至8L浓缩液(1)。滤渣(1)加入25L复合菌发酵液3天，加入85％乙醇溶液900L回流提取4h，过滤得滤液(1)，在55℃减压浓缩得18L浓缩液(2)。将浓缩液(1)和浓缩液(2)合并后加60L乙醚萃取120min，得乙醚液(1)和下层液体(1)。将乙醚液(1)在55℃减压浓缩至3L，上XAD-4大孔吸附树脂柱，用四倍柱体积的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液(1)，在55℃减压浓缩至3L，室温下放置至结晶析出，过滤得3.21kg滤渣(2)。滤渣(2)加5L乙醇溶液溶解，加1.5kg活性炭脱色，静置30～60min，过滤，浓缩至结晶析出，放冷结晶，重结晶得2.78kg白藜芦醇纯品。将下层液体(1)用35L乙醇溶液溶解，过滤，滤液上XAD-4大孔吸附树脂柱，先用五倍柱体积的水进行洗柱，弃去水洗脱液，再用六倍柱体积的乙醇溶液进行洗脱，得到300L洗脱液(2)。将洗脱液(2)在50℃减压浓缩至5L，结晶，过滤，重结晶得4.61kg木犀草素纯品。按HPLC法检测，木犀草素的纯度为98.89％，白藜芦醇的纯度为98.91％。
对照实施例1
取200kg干花生藤粉碎至120目，加入600L乙醚回流提取100min，过滤，滤液(1)在55℃减压浓缩得至6L浓缩液(1)。滤渣(1)加入25L复合菌发酵液3天，加入85％乙醇溶液1000L回流提取4h，过滤得滤液(1)，在55℃减压浓缩得20L浓缩液(2)。将浓缩液(1)和浓缩液(2)合并后加60L乙醚萃取120min，得乙醚液(1)和下层液体(1)。将乙醚液(1)在55℃减压浓缩至3L，上XAD-4大孔吸附树脂柱，用四倍柱体积的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液(1)，在55℃减压浓缩至3L，室温下放置至结晶析出，过滤得2.35kg滤渣(2)。滤渣(2)加5L乙醇溶液溶解，加1.5kg活性炭脱色，静置30～60min，过滤，浓缩至结晶析出，放冷结晶，重结晶得1.53kg白藜芦醇纯品。将下层液体(1)用40L乙醇溶液溶解，过滤，滤液上XAD-4大孔吸附树脂柱，先用五倍柱体积的水进行洗柱，弃去水洗脱液，再用六倍柱体积的乙醇溶液进行洗脱，得到350L洗脱液(2)。将洗脱液(2)在50℃减压浓缩至5L，结晶，过滤，重结晶得3.58kg木犀草素纯品。按HPLC法检测，木犀草素的纯度为98.73％，白藜芦醇的纯度为98.72％。
对照实施例2
取200kg干花生藤粉碎至120目，加入700L乙醚回流提取100min，过滤，滤液(1)在55℃减压浓缩得至8L浓缩液(1)。滤渣(1)加入85％乙醇溶液900L回流提取4h，过滤得滤液(1)，在55℃减压浓缩得18L浓缩液(2)。将浓缩液(1)和浓缩液(2)合并后加60L乙醚萃取120min，得乙醚液(1)和下层液体(1)。将乙醚液(1)在55℃减压浓缩至3L，上XAD-4大孔吸附树脂柱，用四倍柱体积的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液(1)，在55℃减压浓缩至3L，室温下放置至结晶析出，过滤得2.09kg滤渣(2)。滤渣(2)加5L乙醇溶液溶解，加1.5kg活性炭脱色，静置30～60min，过滤，浓缩至结晶析出，放冷结晶，重结晶得1.35kg白藜芦醇纯品。将下层液体(1)用40L乙醇溶液溶解，过滤，滤液上XAD-4大孔吸附树脂柱，先用五倍柱体积的水进行洗柱，弃去水洗脱液，再用六倍柱体积的乙醇溶液进行洗脱，得到350L洗脱液(2)。将洗脱液(2)在50℃减压浓缩至5L，结晶，过滤，重结晶得2.79kg木犀草素纯品。按HPLC法检测，木犀草素的纯度为98.81％，白藜芦醇的纯度为98.84％。
实施例2
将新鲜未去根的花生藤每天喷洒一次(1)号营养液15kg/100kg花生藤，室温暗培养20天，再加入15％酵母菌液，继续培养4天，在45℃下干燥，再粉碎至120目，取500kg加入1800L乙醚回流提取100min，过滤，滤液(1)在55℃减压浓缩得至25L浓缩液(1)。滤渣(1)加入60L复合菌发酵液3天，加入85％乙醇溶液2200L回流提取4h，过滤得滤液(1)，在55℃减压浓缩得50L浓缩液(2)。将浓缩液(1)和浓缩液(2)合并后加180L乙醚萃取120min，得乙醚液(1)和下层液体(1)。将乙醚液(1)在55℃减压浓缩至5L，上XAD-4大孔吸附树脂柱，用五倍柱体积的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液(1)，在55℃减压浓缩至5L，室温下放置至结晶析出，过滤得8.78kg滤渣(2)。滤渣(2)加乙醇溶液溶解，加适量活性炭脱色，静置30～60min，过滤，浓缩至结晶析出，放冷结晶，重结晶得7.14kg白藜芦醇纯品。将下层液体(1)用50L乙醇溶液溶解，过滤，滤液上XAD-4大孔吸附树脂柱，先用五倍柱体积的水进行洗柱，弃去水洗脱液，再用六倍柱体积的乙醇溶液进行洗脱，得到800L洗脱液(2)。将洗脱液(2)在50℃减压浓缩至15L，结晶，过滤，重结晶得12.16kg木犀草素纯品。按HPLC法检测，木犀草素的纯度为98.92％，白藜芦醇的纯度为98.94％。

Claims (7)

1.一种提取木犀草素和白藜芦醇的方法，具体步骤包括如下：
A、将新鲜未去根的花生藤每天喷洒(1)号营养液一次，室温暗培养10～20天，再加入5～15％酵母菌液，继续培养3～5天，在40～50℃下干燥，再粉碎至80目～120目，加入乙醚回流提取80～100min，过滤，滤液(1)在55℃～65℃减压浓缩至原有体积的1/50～1/80，得浓缩液(1)，其中加入乙醚体积L与干花生藤重量kg比为3～5:1；
B、滤渣(1)加入5～15％复合菌发酵液2～3天，加入70～90％乙醇溶液回流提取2～4h，过滤得滤液(1)，在55℃～65℃减压浓缩至原有体积的1/40～1/60，得浓缩液(2)，其中加入乙醇溶液体积L与干花生藤重量kg比为4～6:1；
C、将浓缩液(1)和浓缩液(2)合并后加两倍至四倍体积的乙醚萃取60～120min，得乙醚液(1)和下层液体(1)；
D、将乙醚液(1)在55℃～65℃减压浓缩至原有体积的1/15～1/40，上大孔吸附树脂柱，用三倍至六倍柱体积的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液(1)，在55℃～65℃减压浓缩至原有体积的1/5～1/20，室温下放置至结晶析出，过滤得滤渣(2)；
E、滤渣(2)加乙醇溶液溶解，加适量活性炭脱色，静置30～60min，过滤，浓缩至结晶析出，放冷结晶，重结晶得白藜芦醇纯品；
G、将下层液体(1)用乙醇溶液溶解，过滤，滤液上大孔吸附树脂柱，先用三倍至五倍柱体积的水进行洗柱，弃去水洗脱液，再用三倍至六倍柱体积的乙醇溶液进行洗脱，得到洗脱液(2)；
H、将洗脱液(2)在50℃～60℃减压浓缩至原有体积的1/30～1/80，结晶，过滤，重结晶得木犀草素纯品。
2.根据权利要求1的方法，所述过滤优选陶瓷膜过滤1次，膜孔孔径大小为0.22μm。
3.根据权利要求1的方法，所述步骤A中所述(1)号营养液优选为含有5～100mg/L的6-BA、0.02～0.1g/LGA3的Ms无糖液体培养基，其中每次使用的量L与鲜花生藤重量kg比为5～20:100。
4.根据权利要求1的方法，所述步骤D、E和G中所述乙醇溶液优选75～85％乙醇水溶液。
5.根据权利要求1的方法，所述步骤D和G中所述大孔吸附树脂柱优选HP-20、XAD-4、XAD-16等。
6.根据权利要求1的方法，所述步骤E中所述加入乙醇溶液的量L与滤渣(2)重量kg比为1～10:1；活性炭的量kg与滤渣(2)重量kg比为0.2～3:1。
7.根据权利要求1的方法，所述步骤G中所述加入乙醇溶液的量L与下层液体(1)体积L比为1～3:1。
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