CN108727325A - 一种从爬山虎中提取木犀草素和白藜芦醇的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种从爬山虎中提取木犀草素和白藜芦醇的方法，具体步骤包括如下：对爬山虎鲜品进行微生物处理，采用乙醚回流提取，过滤，浓缩；滤渣加入复合菌发酵，乙醇回流提取，过滤，浓缩，加乙醚萃取，萃取液浓缩上大孔吸附树脂柱纯化，结晶，加乙醇溶解后脱色，再结晶得白藜芦醇纯品；下层液体加乙醇溶解，过滤，滤液上大孔吸附树脂柱，乙醇洗脱液浓缩，结晶得木犀草素纯品。

Description

一种从爬山虎中提取木犀草素和白藜芦醇的方法
所属技术领域
本发明涉及一种从爬山虎中提取分离木犀草素和白藜芦醇的方法，属于天然产物化学的技术领域。
背景技术
爬山虎，又叫捆石龙、枫藤、小虫儿卧草、红丝草、红葛、趴山虎、红葡萄藤、巴山虎，葡萄科植物。夏季开花，花小，呈黄绿色，浆果紫黑色。常见攀缘在墙壁岩石上。爬山虎的根茎可入药，破瘀血、消肿毒；果可酿酒，但它的根会分泌酸性物质腐蚀石灰岩,它的根会沿着墙的缝隙钻入其中,使缝隙过大,严重可至墙体碎裂倒塌。
公开号为CN1948459的中国专利介绍了一种能产白藜芦醇的枝孢霉属内生真菌，从爬山虎内生真菌中克隆了芪合酶基因(sts)，它与爬山虎中sts基因的编码序列相似性为95.25％，经18SrDNA序列鉴定该真菌属枝孢霉菌。高效液相色谱和质谱分析表明，该菌在离体培养下也能合成白藜芦醇。
公开号为CN101973975A的中国专利介绍了一种从灰毡毛忍冬提取木犀草素的方法，步骤包括：(1)粉碎干燥灰毡毛忍冬，并将灰毡毛忍冬、60％乙醇按重量(kg)/体积比(V)＝1∶1-3进行混合，加热回流提取；(2)提取液先纱布粗滤，然后离心取上清液，减压浓缩至无乙醇味；(3)将浓缩液用1.5-3倍体积的乙酸乙酯萃取三次，分离乙酸乙酯层并进行浓缩，直至获得干燥物；(4)加入60％乙醇进行加热溶解，然后加入活性碳进行脱色，再进行浓缩直至获得干燥物；(5)加入90％乙醇进行加热溶解，然后加入热水调节乙醇终浓度为30-40％，室温过夜结晶，得木犀草素纯品。
公开号为CN104710391A的中国专利介绍了一种利用花生壳提取木犀草素和β-谷甾醇的方法，步骤包括：(1)花生壳的收集：将花生壳晒干或烘干粉碎原料至20～40目，加入70～85％乙醇水溶液，加热至35～55℃回流提取2～5h，陶瓷膜过滤一次得滤液，滤渣重复提取一次，合并滤液；(2)向滤液中加入颗粒活性碳进行脱色，陶瓷膜过滤得脱色滤液；(3)将脱色滤液在40～50℃下进行减压浓缩至干，得干燥物，再加入质量比为7～12％的氢氧化钠水溶液，混合均匀后静置20～30min；(4)向第(3)步所得混合溶液加入乙酸乙酯进行萃取，得含有乙酸乙酯的萃取液和不含有乙酸乙酯的水溶液；(5)将含有乙酸乙酯的萃取液减压浓缩至干得到β-谷甾醇产品；(6)将不含有乙酸乙酯的水溶液加入盐酸调节pH，使pH小于5.5以下，加入两倍至三倍体积的石油醚进行萃取得萃取液；(7)将萃取液40℃下减压浓缩至干得到木犀草素粗品用75％乙醇水溶液溶解，加入等体积的45～70℃热水，减压浓缩回收乙醇，余液放入冰箱冷却至4℃下静置48h，得到木犀草素结晶，重结晶一次得到高纯度的木犀草素。
公开号为CN105566273A的中国专利介绍了一种玉米须中木犀草素的提取方法，具体步骤是：a)原料处理：将玉米须制备成玉米须粉末，置于干燥环境中备用；b)微波提取：将步骤a)中玉米须粉末按20mL/g～40mL/g液料比加入体积分数为60％-80％的乙醇溶液中，充分振荡并密封，后置于微波炉中进行微波提取；c)超声波提取：将步骤b)微波处理后的提取液放入超声波清洗器中，进行超声波提取；然后进行离心处理，得到玉米须木犀草素样品液；d)浓缩：将步骤c)得到的玉米须木犀草素样品液在45℃-55℃温度条件下减压浓缩，得到玉米须木犀草素浓缩液；e)储存：将步骤d)得到的玉米须木犀草素浓缩液于2℃-8℃温度条件下避光储存。
综上所述，木犀草素和白藜芦醇均具有较强的药理作用，在医药学领域的应用前景广阔。目前爬山虎未得到综合开发利用，探索从爬山虎中同时提取木犀草素和白藜芦醇意义非凡。
发明内容
目前公开的文献资料仅研究从爬山虎中提取活性成份白藜芦醇，但未对其他活性成分进行综合利用。针对爬山虎的活性成分未综合开发利用问题，本发明提供一种操作简单、工艺合理、快速同时提取木犀草素和白藜芦醇的生产工艺。
本发明采用的技术方案包括：对爬山虎鲜品进行微生物处理，采用乙醚回流提取，过滤，浓缩；滤渣加入复合菌发酵，乙醇回流提取，过滤，浓缩，加乙醚萃取，萃取液浓缩上大孔吸附树脂柱纯化，结晶，加乙醇溶解后脱色，再结晶得白藜芦醇纯品；下层液体加乙醇溶解，过滤，滤液上大孔吸附树脂柱，乙醇洗脱液浓缩，结晶得木犀草素纯品。
因此，本发明提供一种从爬山虎中提取木犀草素和白藜芦醇的方法，具体步骤包括如下：
(1)将新鲜爬山虎根茎喷洒A号营养液，室温暗培养10～20天，再喷洒1～10％酵母菌液，继续培养3～5天，在40～50℃下干燥，再粉碎至80目～120目，加入乙醚回流提取80～100min，过滤得滤液Ⅰ和滤渣Ⅰ，滤液Ⅰ进行浓缩至原有体积的1/20～1/40，得浓缩液Ⅰ，其中加入乙醚体积L与爬山虎重量kg比为1～5:1。
(2)滤渣Ⅰ喷洒5～15％复合菌发酵液2～3天，加入70～90％乙醇溶液回流提取2～4h，过滤得滤液Ⅱ，进行浓缩至原有体积的1/15～1/30，得浓缩液Ⅱ，其中加入乙醇溶液体积L与爬山虎重量kg比为0.5～4:1。
(3)将浓缩液Ⅰ和浓缩液Ⅱ合并后加两倍体积的乙醚萃取60～120min，得乙醚液Ⅰ和下层液体Ⅰ。
(4)将乙醚液Ⅰ浓缩至原有体积的1/5～1/15，上大孔吸附树脂柱，吸附30～60min后，用四倍至六倍柱体积的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液Ⅰ，浓缩至原有体积的1/5～1/15，室温下放置至结晶析出，过滤得粗结晶。
(5)粗结晶加乙醇溶液溶解，加适量活性炭脱色，静置30～60min，过滤，浓缩至结晶析出，放冷结晶，重结晶得白藜芦醇纯品。
(6)将下层液体Ⅰ浓缩至原有体积的1/15～1/25，再与乙醇溶液进行混合30～60min，过滤得滤液Ⅲ，上大孔吸附树脂柱，吸附20～50min，先用两倍至四倍柱体积的水进行洗柱，弃去水洗脱液，再用四倍至六倍柱体积的乙醇溶液进行洗脱，得到洗脱液Ⅱ。
(7)将洗脱液Ⅱ浓缩至原有体积的1/15～1/25，结晶，过滤，重结晶得木犀草素纯品。
所述过滤优选陶瓷膜过滤1次，膜孔孔径大小为0.22μm，所述浓缩过程都是在减压条件下进行，温度在55℃～65℃之间。
所述步骤(1)中所述A号营养液优选为含有0.5mg/L IAA的Ms无糖液体培养基，其中使用的量L与爬山虎重量kg比为0.5～5:10。
所述步骤(1)中所述加入酵母菌液的量L与爬山虎重量kg比1～10：100。
所述步骤(2)中所述加入复合菌发酵液的量L与爬山虎重量kg比5～15：100；复合菌为木霉与酵母菌，其混合比例为3：1或4：1。
所述步骤(4)、(5)和(6)中所述乙醇溶液优选75～90％乙醇水溶液，即为乙醇与水的混合液，90％乙醇溶液是指90mL乙醇加入10ml水进行混合即可。
所述步骤(4)和(6)中所述大孔吸附树脂柱优选NKA-9、D3520、D4020、H103、D1400、ADS-17、D941。
所述步骤(5)中所述加入乙醇溶液的量L与粗结晶重量kg比为5～15:1；加入活性炭的量kg与乙醇溶液体积L比为0.2～5:100。
所述步骤(6)中所述加入乙醇溶液的量L与下层液体Ⅰ的体积L比为2～6:1。
技术效果
1、通过爬山虎进行发芽和微生物刺激预处理，大大提高了爬山虎中白藜芦醇和木犀草素，大大提高了爬山虎的利用率和附加值，这有效降低了木犀草素和白藜芦醇的生产成本。
2、本发明原料采用乙醇回流提取，同时获得木犀草素和白藜芦醇醇提物，又提高了提取率，同时缩短了提取时间，又大大节省了能耗。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以下实施例旨在说明本发明而不是对本发明的进一步限定。
实施例1
将400kg新鲜爬山虎根茎(水分含量为43％)喷洒A号营养液100L，室温暗培养15天，再喷洒30L酵母菌液，继续培养4天，在45℃下干燥，再粉碎至100目左右，加入600L乙醚回流提取90min，过滤得滤液Ⅰ和滤渣Ⅰ，滤液Ⅰ进行浓缩得20L浓缩液Ⅰ。滤渣喷洒50L复合菌发酵液3天，加入85％乙醇溶液500L回流提取3h，过滤得滤液Ⅱ,进行浓缩得25L浓缩液Ⅱ。将浓缩液Ⅰ和浓缩液Ⅱ合并后加90L乙醚萃取80min，得乙醚液Ⅰ和下层液体Ⅰ。将乙醚液Ⅰ浓缩至8L，上D3520大孔吸附树脂柱，吸附50min后，用六倍柱体积的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液Ⅰ，进行浓缩至2L，室温下放置至结晶析出，过滤得粗结晶。粗结晶加乙醇溶液溶解，加适量活性炭脱色，静置40min，过滤，浓缩至结晶析出，放冷结晶，重结晶得3.58kg白藜芦醇纯品。将下层液体Ⅰ浓缩到2L，再与8L乙醇溶液进行混合60min，过滤得滤液Ⅲ，上D3520大孔吸附树脂柱，吸附50min，先用四倍柱体积的水进行洗柱，弃去水洗脱液，再用六倍柱体积的乙醇溶液进行洗脱，得到洗脱液Ⅱ；将洗脱液Ⅱ浓缩至3L，结晶，过滤，重结晶得4.28kg木犀草素纯品。按HPLC法检测，木犀草素的纯度为99.25％，白藜芦醇的纯度为99.06％。
对照实施例1
将400kg新鲜爬山虎根茎(水分含量为43％)喷洒100L水，室温暗培养15天，再喷洒30L酵母菌液，继续培养4天，在45℃下干燥，再粉碎至100目左右，加入600L乙醚回流提取90min，过滤得滤液Ⅰ和滤渣Ⅰ，滤液Ⅰ进行浓缩得20L浓缩液Ⅰ。滤渣喷洒50L复合菌发酵液3天，加入85％乙醇溶液500L回流提取3h，过滤得滤液Ⅱ,进行浓缩得25L浓缩液Ⅱ。将浓缩液Ⅰ和浓缩液Ⅱ合并后加90L乙醚萃取80min，得乙醚液Ⅰ和下层液体Ⅰ。将乙醚液Ⅰ浓缩至8L，上D3520大孔吸附树脂柱，吸附50min后，用六倍柱体积的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液Ⅰ，进行浓缩至2L，室温下放置至结晶析出，过滤得粗结晶。粗结晶加乙醇溶液溶解，加适量活性炭脱色，静置40min，过滤，浓缩至结晶析出，放冷结晶，重结晶得1.47kg白藜芦醇纯品。将下层液体Ⅰ浓缩到2L，再与8L乙醇溶液进行混合60min，过滤得滤液Ⅲ，上D3520大孔吸附树脂柱，吸附50min，先用四倍柱体积的水进行洗柱，弃去水洗脱液，再用六倍柱体积的乙醇溶液进行洗脱，得到洗脱液Ⅱ；将洗脱液Ⅱ浓缩至3L，结晶，过滤，重结晶得3.55kg木犀草素纯品。按HPLC法检测，木犀草素的纯度为98.37％，白藜芦醇的纯度为98.65％。
对照实施例2
将400kg新鲜爬山虎根茎(水分含量为43％)喷洒A号营养液100L，室温暗培养15天，再喷洒30L水，继续培养4天，在45℃下干燥，再粉碎至100目左右，加入600L乙醚回流提取90min，过滤得滤液Ⅰ和滤渣Ⅰ，滤液Ⅰ进行浓缩得20L浓缩液Ⅰ。滤渣喷洒50L复合菌发酵液3天，加入85％乙醇溶液500L回流提取3h，过滤得滤液Ⅱ,进行浓缩得25L浓缩液Ⅱ。将浓缩液Ⅰ和浓缩液Ⅱ合并后加90L乙醚萃取80min，得乙醚液Ⅰ和下层液体Ⅰ。将乙醚液Ⅰ浓缩至8L，上D3520大孔吸附树脂柱，吸附50min后，用六倍柱体积的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液Ⅰ，进行浓缩至2L，室温下放置至结晶析出，过滤得粗结晶。粗结晶加乙醇溶液溶解，加适量活性炭脱色，静置40min，过滤，浓缩至结晶析出，放冷结晶，重结晶得2.62kg白藜芦醇纯品。将下层液体Ⅰ浓缩到2L，再与8L乙醇溶液进行混合60min，过滤得滤液Ⅲ，上D3520大孔吸附树脂柱，吸附50min，先用四倍柱体积的水进行洗柱，弃去水洗脱液，再用六倍柱体积的乙醇溶液进行洗脱，得到洗脱液Ⅱ；将洗脱液Ⅱ浓缩至3L，结晶，过滤，重结晶得3.02kg木犀草素纯品。按HPLC法检测，木犀草素的纯度为98.43％，白藜芦醇的纯度为98.72％。
实施例2
将1000kg新鲜爬山虎根茎(水分含量为51％)喷洒A号营养液250L，室温暗培养16天，再喷洒70L酵母菌液，继续培养4天，在45℃下干燥，再粉碎至120目左右，加入1200L乙醚回流提取90min，过滤得滤液Ⅰ和滤渣Ⅰ，滤液Ⅰ进行浓缩得50L浓缩液Ⅰ。滤渣喷洒120L复合菌发酵液3天，加入85％乙醇溶液1200L回流提取3h，过滤得滤液Ⅱ,进行浓缩得60L浓缩液Ⅱ。将浓缩液Ⅰ和浓缩液Ⅱ合并后加220L乙醚萃取80min，得乙醚液Ⅰ和下层液体Ⅰ。将乙醚液Ⅰ浓缩至18L，上H103大孔吸附树脂柱，吸附50min后，用五倍柱体积的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液Ⅰ，进行浓缩至5L，室温下放置至结晶析出，过滤得粗结晶。粗结晶加乙醇溶液溶解，加适量活性炭脱色，静置40min，过滤，浓缩至结晶析出，放冷结晶，重结晶得7.46kg白藜芦醇纯品。将下层液体Ⅰ浓缩到5L，再与20L乙醇溶液进行混合60min，过滤得滤液Ⅲ，上H103大孔吸附树脂柱，吸附50min，先用四倍柱体积的水进行洗柱，弃去水洗脱液，再用六倍柱体积的乙醇溶液进行洗脱，得到洗脱液Ⅱ；将洗脱液Ⅱ浓缩至7L，结晶，过滤，重结晶得8.61kg木犀草素纯品。按HPLC法检测，木犀草素的纯度为99.18％，白藜芦醇的纯度为99.14％。

Claims (6)

1.一种从爬山虎中提取木犀草素和白藜芦醇的方法，其特征在于，具体步骤包括如下：
(1)将新鲜爬山虎根茎喷洒A号营养液，室温暗培养10～20天，再喷洒1～10％酵母菌液，继续培养3～5天，在40～50℃下干燥，再粉碎至80目～120目，加入乙醚回流提取80～100min，过滤得滤液Ⅰ和滤渣Ⅰ，滤液Ⅰ进行浓缩至原有体积的1/20～1/40，得浓缩液Ⅰ，其中加入乙醚体积L与爬山虎重量kg比为1～5:1；
(2)滤渣Ⅰ喷洒5～15％复合菌发酵液2～3天，加入70～90％乙醇溶液回流提取2～4h，过滤得滤液Ⅱ，进行浓缩至原有体积的1/15～1/30，得浓缩液Ⅱ，其中加入乙醇溶液体积L与爬山虎重量kg比为0.5～4:1；
(3)将浓缩液Ⅰ和浓缩液Ⅱ合并后加两倍体积的乙醚萃取60～120min，得乙醚液Ⅰ和下层液体Ⅰ；
(4)将乙醚液Ⅰ浓缩至原有体积的1/5～1/15，上大孔吸附树脂柱，吸附30～60min后，用四倍至六倍柱体积的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液Ⅰ，浓缩至原有体积的1/5～1/15，室温下放置至结晶析出，过滤得粗结晶；
(5)粗结晶加乙醇溶液溶解，加适量活性炭脱色，静置30～60min，过滤，浓缩至结晶析出，放冷结晶，重结晶得白藜芦醇纯品；
(6)将下层液体Ⅰ浓缩至原有体积的1/15～1/25，再与乙醇溶液进行混合30～60min，过滤得滤液Ⅲ，上大孔吸附树脂柱，吸附20～50min，先用两倍至四倍柱体积的水进行洗柱，弃去水洗脱液，再用四倍至六倍柱体积的乙醇溶液进行洗脱，得到洗脱液Ⅱ；
(7)将洗脱液Ⅱ浓缩至原有体积的1/15～1/25，结晶，过滤，重结晶得木犀草素纯品。
2.根据权利要求1方法，其特征在于所述步骤(1)中所述A号营养液优选为含有0.5mg/LIAA的Ms无糖液体培养基，其中使用的量L与爬山虎重量kg比为0.5～5:10。
3.根据权利要求1方法，其特征在于所述步骤(4)、(5)和(6)中所述乙醇溶液优选75～90％乙醇水溶液。
4.根据权利要求1方法，其特征在于所述步骤(4)和(6)中所述大孔吸附树脂柱优选NKA-9、D3520、D4020、H103、D1400、ADS-17、D941。
5.根据权利要求1方法，其特征在于所述步骤(5)中所述加入乙醇溶液的量L与粗结晶重量kg比为5～15:1；加入活性炭的量kg与乙醇溶液体积L比为0.2～5:100。
6.根据权利要求1方法，其特征在于所述步骤(6)中所述加入乙醇溶液的量L与下层液体Ⅰ的体积L比为2～6:1。
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