CN115947647A - 一种从微生物发酵液中提取白藜芦醇的方法 - Google Patents

一种从微生物发酵液中提取白藜芦醇的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种从微生物发酵液中提取白藜芦醇的方法，属于生物发酵提取技术领域。本发明采用陶瓷膜过滤收集截流菌悬液→有机溶剂萃取→纳滤膜过滤脱色除去杂蛋白等杂质，得到白藜芦醇一次净化液，再经反渗透膜浓缩→得到第一次白藜芦醇浓缩液→蒸发浓缩→静置结晶→离心分离→干燥→得到98％以上的白藜芦醇成品。本发明提取工艺简便，机械化程度高，易操作，不受季节和地域限制，生产成本低，可完全替代以植物原料白藜芦醇生产提取，实现工业规模化生产，而且在整个提取过程中不使用酸、碱和絮凝剂等化学药品，是一种安全、环保形提取白藜芦醇新工艺。

Description

一种从微生物发酵液中提取白藜芦醇的方法
技术领域
本发明涉及一种从微生物发酵液中提取白藜芦醇的方法，属于生物发酵提取技术领域。
背景技术
白藜芦醇是一种生物性很强多酚类物质，又称为芪三酚，经研究证实具有多种药理效果，对心血管疾病、动脉粥样硬化、老年痴呆症、心脑血管疾病、对多种癌症有一定的抑制和拮抗效果，因此白藜芦醇即是药品又是保健品；
白藜芦醇在市场的需求量极大，目前白藜芦醇生产多数都是以虎杖、葡萄皮籽、花生衣等植物为原料提取，白藜芦醇在植物中的含量极低，提取工艺落后，原始化，产量低、纯度低，收率低，成本高等缺点，而且以植物为原料提取生产白藜芦醇受到季节、地区等限制。同时以植物为原料提取生产白藜芦醇工艺复杂，原始化，工艺落后，而且需要添加酸、碱和絮凝剂等化学药品，环境污染严重。
使利用微生物纯种发酵法技术生产提取白藜芦醇不受季节、原料等限制，而且可提高产品质量和产量，保护生态环境，满足市场需求。但是，在从微生物发酵液中提取白藜芦醇时还面临发酵液粘度大、无机盐、脂肪、对香豆酸等杂质含量高而多的困难。
发明内容
[技术问题]
本发明要解决的技术问题是从微生物发酵液中提取白藜芦醇时，发酵液粘度大、无机盐、脂肪、对香豆酸等杂质含量高。
[技术方案]
本发明提供一种以微生物液体深层发酵液为原料，提取白藜芦醇的方法，采用了现代三级膜法分离技术提取工艺，不使用酸、碱和絮凝剂等化学剂，而且可提高产品收率和质量，是一种环保型提取新工艺。
本发明所述微生物液体深层发酵液，包括以酵母菌为菌株，以葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁等为原料的发酵液，本发明所述方法主要包括以下步骤：
(1)收集微生物细胞
在发酵过程中，微生物细胞不断代谢使白黎芦醇积累在微生物细胞的表面，将发酵液利用陶瓷膜过滤，以除去70～80％液体并收集截流菌液，减少溶剂用量；
(2)萃取
将截流菌液使用有机溶剂萃取细胞表面聚集的白黎芦醇，再通过过滤除去杂质，收集萃取清液，所述有机溶剂是甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯中的一种；
(3)固液分离
白黎芦醇萃取清液中含有大量生物细胞和发酵液残渣等杂质，将步骤(2)所得萃取清液使用离心机、板框压滤或真空吸滤机进行固液分离，收集滤清液，并在结束时使用≥30％的溶剂清洗滤饼，并回收洗液，以提高白黎芦醇的回收率；
(4)脱色
将(3)收集的滤清液、洗液再使用脱色膜除去色素和大分子杂蛋白，得到脱色后的滤清液，达到清澈透明效果；
(5)一级浓缩
使用膜浓缩技术进行浓缩，去除70～80％的水分和有机溶剂，得到白黎芦醇一级浓缩液；
(6)二级浓缩
将白黎芦醇一级浓缩液，使用单效浓缩罐，在65～67℃静态真空条件下浓缩回收有机溶剂，其后在高真空条件下浓缩至结晶结束，得到浓缩结晶液；
(7)养晶
将浓缩结晶液放入养晶罐中，使晶体达到饱和状，并沉淀；
(8)离心分离
白黎芦醇饱和结晶体使用离心机进行固液分离，去除母液，离心收集结晶体；
(9)干燥
将步骤(8)得到的白黎芦醇结晶体(一般水分含量在25～30％)，置于50～55℃条件下进干燥，得到白黎芦醇成品。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)所述陶瓷膜是50纳米陶瓷膜过滤。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)所述有机溶剂的使用量为步骤(1)所得截流菌液体积的3～4倍，萃取时间8～12小时。所述有机溶剂最好选用乙醇。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)所述离心机的工作条件是：物料温度≤30℃，转速800r/min，离心时间5-8min。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)所述板框压滤的工作条件是：物料温度≤30℃，板框压滤为暗流鼓膜式，过滤面积20M2，物料接触部分为无毒高强度聚丙烯塑料。
在本发明的一种实施方式中，步骤(4)用分子量300左右的纳滤膜过滤脱色，除去萃取液中的色素和大分子杂蛋白。
在本发明的一种实施方式中，步骤(5)用分子量230左右的反渗透膜对脱色液进行浓缩，分离出70～80％的水分和有机溶剂，得到白黎芦醇一级浓缩液，此间运行温度控制在30℃或以下。
在本发明的一种实施方式中，步骤(6)将白黎芦醇一级浓缩液，使用单效浓缩罐，在65～67℃静态真空条件下浓缩回收有机溶剂，其后在高真空条件下浓缩至大量白黎芦醇结晶析出结束。
在本发明的一种实施方式中，步骤(7)将浓缩结晶液放入养晶罐中，在≤10℃条件下静置10～15小时养晶，使晶体达到饱和状并沉淀。
在本发明的一种实施方式中，步骤(8)将白黎芦醇饱和结晶体使用离心机进行固液分离，离心机工作条件为物料温度≤30℃，转速800r/min，离心5-8min。并用10℃左右纯净水洗晶1～2次，得到含水量较高的白黎芦醇半成品，母液回收再利用，离心收集结晶体，此时离心机的工作条件为物料温度≤30℃，转速800r/min，5-8min。
在本发明的一种实施方式中，步骤(9)将步骤(8)得到的白黎芦醇结晶体，一般水分含量在25％左右，装入烘盘中，置于50～55℃条件下干燥，得到白黎芦醇含量在98％以上成品。
[有益效果]
本发明从微生物发酵液中分离白藜芦醇的工艺顺序是：陶瓷膜过滤收集截流菌悬液
→有机溶剂萃取→纳滤膜过滤脱色除去杂蛋白等杂质，得到白藜芦醇一次净化液，再经反渗透膜浓缩→得到第一次白藜芦醇浓缩液→蒸发浓缩→静置结晶→离心分离→干燥→
得到98％以上的白藜芦醇成品。这种工艺顺序具有工艺简便，速度快、时间短、易操作，机械化程度高，收率高、生产成本低，可以实现工业规模化生产的优势，而且在整个提取过程中不使用酸、碱和絮凝剂等化学药品，具有安全、环保提取白藜芦醇的优势。
本发明采用三级膜法提取，直接使用发酵液经陶瓷膜、纳滤膜、反渗透浓缩膜提取，能够完全实现对发酵液中白黎芦醇目标产物的分离、浓缩提取，而且不需要酸、碱、絮凝剂、加热等化学药品和能源消耗，保证了白黎芦醇在提取过程中的原质原味。
附图说明
图1白黎芦醇提取工艺。
图2白藜芦醇HPLC图，横坐标为时间，单位min，纵坐标为305nm吸光值，单位mAU。
具体实施方式
本发明下述实施例中使用的白黎芦醇发酵液是由酵母微生物菌种经液体深层发酵而成，其生产工艺流程为：菌种摇瓶培养→一级种子罐培养→二级种子罐培养→发酵罐培养→发酵培养。
下述实施例中使用的检测白黎芦醇的方法是HPLC：
标准品处理：称取适量标准品溶于甲醇(大于95％)，配置标准液进行检测。使用安捷伦高效液相色谱进行测定。HPLC条件：色谱柱：InertSustain C18 250mm×4.6mm column(particle size 5μm)；流动相A，含有1‰三氟乙酸的超纯水；流动相B，含有1‰三氟乙酸的乙腈；柱温：40℃；进样量：10μL；检测器波长：305nm。
实施例1
第一步取白黎芦醇发酵液50公斤，加水50公斤水稀释；
第二步使用50纳米陶瓷膜过滤，收集截流菌液12公斤，
第三步在收集12公斤截流菌液中加入95％乙醇36升，常温萃取8小时；
第四步萃取液用暗流鼓膜式板框机过滤，收集滤清液，滤饼再使用60-65％的乙醇洗饼并回收滤清液；
第五步 脱色，用分子量300左右微滤膜过滤脱色和除去杂蛋等杂质，收集滤清液，截流渣液再用3倍75％乙醇顶滤，提高收率，
第六步 第一次浓缩，滤清液使用分子量230左右反渗透膜浓缩，去除75-80％乙醇和水，得到白黎芦醇一级浓缩液。
第七步白黎芦醇一级浓缩液再使用单效蒸发浓缩罐，前期在65-67℃条件下静态真空浓缩收集乙醇，后期高真空浓缩至大量晶体析出结束；
第八步 浓缩结晶液在≤10℃养晶罐中养晶，使晶体达到饱和；
第九步 饱和白黎芦醇结晶使用MIN200台式离心机分离，并使用≤10℃纯水洗晶体，提高纯度，
第十步 干燥：白黎芦醇离心结晶体，一般水分含量在25％左右，装入烘盘中，置于50～55℃条件下干燥，得到白黎芦醇含量在98.9％的成品，收率为89.2％。
实施例2
第一步 取白黎芦醇发酵液500公斤；
第二步 使用50纳米陶瓷膜过滤，过滤至滤液达到一半时，加水200公斤，提高过滤速度，收集截流菌液113公斤；
第三步 在收集113公斤截流菌液中加入95％乙醇340升，常温萃取8小时；
第四步 萃取液用4M2暗流鼓膜式板框压滤机过滤，收集滤清液，滤饼再使用70-80％回收乙醇洗饼并同条件压滤合并；
第五步 脱色，用分子量300左右纳滤膜过滤脱色和除去杂蛋等杂质，收集滤清液，截流渣液再用3倍75％乙醇顶滤，提高收率，
第六步 第一次浓厚，滤清液使用分子量230反渗透膜浓缩，去除75-80％乙醇和水，得到第-次浓缩液。
第七步 第一次浓厚液再使用单效蒸发浓缩罐，前期在65-67℃条件下静太真空浓缩收集乙醇，后期高真空浓缩至大量晶体析出结束；
第八步 浓缩结晶液在≤10℃养晶罐中养晶，使晶体达到饱和；
第九步 饱和白黎芦醇结晶使用SS755三足式离心机分离，后期使用≤10℃纯水洗晶体，母液回收下批再利用；
第十步 干燥：白黎芦醇离心结晶体，一般水分含量在25％左右，装入烘盘中，置于50～55℃条件下干燥，得到白黎芦醇含量在98.2％以上的成品，收率为89.5％。
实施例3
第一步 取白黎芦醇发酵液5000公斤；
第二步 使用50纳米陶瓷膜过滤，过滤至滤液达到一半时，加水2000公斤，提高过滤速度，收集截流菌液1213公斤；
第三步 在收集1213公斤截流菌液中加入95％乙醇3650升，常温萃取8小时；
第四步 萃取液用20M2暗流鼓膜式板框压滤机过滤，收集滤清液，滤饼使用70-80％回收乙醇洗饼并同条件压滤合并；
第五步 脱色，用分子量300左右纳滤膜过滤脱色和除去杂蛋等杂质，收集滤清液，截流渣液再用3倍70-80％乙醇顶滤，提高收率，
第六步 第一次浓厚，滤清液使用分子量230反渗透膜浓缩，去除75-80％乙醇和水，得到第-次浓缩液。
第七步 第一次浓厚液再使用单效蒸发浓缩罐，前期在65-67℃条件下静太真空浓缩收集乙醇，后期高真空浓缩至大量晶体析出结束；
第八步 浓缩结晶液在≤10℃养晶罐中养晶，使晶体达到饱和；
第九步 饱和白黎芦醇结晶使用SS755三足离心机分离，后期使用≤10℃纯水洗晶体，提高纯度，
第十步 干燥：白黎芦醇离心结晶体，一般水分含量在25％左右，装入烘盘中，置于50～55℃条件下干燥，得到白黎芦醇含量在98.8％的成品，收率为90.3％。

Claims (9)

1.从微生物液体深层发酵液中提取白藜芦醇的方法，其特征在于，主要包括以下步骤：
(1)收集微生物细胞
将发酵液利用陶瓷膜过滤，以除去70～80％液体并收集截流菌液；
(2)萃取
将截流菌液使用有机溶剂萃取白黎芦醇，再过滤、收集萃取清液，所述有机溶剂是甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯中的一种；
(3)固液分离
将步骤(2)所得萃取清液使用离心机、板框压滤或真空吸滤机进行固液分离，收集滤清液，并清洗滤饼、回收洗液；
(4)脱色
将(3)收集的滤清液、洗液再使用脱色膜处理，得到脱色后的滤清液；
(5)一级浓缩
将脱色后的滤清液使用膜浓缩，去除70～80％的水分和有机溶剂，得到白黎芦醇一级浓缩液；
(6)二级浓缩
将白黎芦醇一级浓缩液，使用单效浓缩罐，在65～67℃静态真空条件下浓缩回收有机溶剂，然后在高真空条件下浓缩至结晶结束，得到浓缩结晶液；
(7)养晶
将浓缩结晶液放入养晶罐中，使晶体达到饱和状，并沉淀；
(8)离心分离
白黎芦醇饱和结晶体使用离心机进行固液分离，去除母液，离心收集结晶体；
(9)干燥
将步骤(8)得到的白黎芦醇结晶体，置于50～55℃条件下进干燥，得到白黎芦醇成品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物是酵母。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述陶瓷膜是50纳米陶瓷膜过滤。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述有机溶剂的使用量为步骤(1)所得截流菌液体积的3～4倍，萃取时间8～12小时。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述板框压滤的工作条件是：物料温度≤30℃，板框压滤为暗流鼓膜式，过滤面积20M2。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)用分子量300左右的纳滤膜过滤脱色，除去萃取液中的色素和大分子杂蛋白。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)用分子量230左右的反渗透膜对脱色液进行浓缩，分离出70～80％的水分和有机溶剂，得到白黎芦醇一级浓缩液，此间运行温度控制在30℃或以下。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(7)将浓缩结晶液放入养晶罐中，在≤10℃条件下静置10～15小时养晶，使晶体达到饱和状并沉淀。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(8)将白黎芦醇饱和结晶体使用离心机进行固液分离，离心机工作条件为物料温度≤30℃，转速800r/min，离心5-8min，并用10℃左右纯净水洗晶1～2次，得到含水量较高的白黎芦醇半成品，母液回收再利用，离心收集结晶体，此时离心机的工作条件为物料温度≤30℃，转速800r/min，5-8min。
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