CN106554273B - 一种发酵液中长链二羧酸的提纯方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种发酵液中长链二羧酸的提纯方法，包括：I、向发酵液中加入无机盐和碱溶液，搅拌使无机盐溶解，利用碱与盐的协同作用使菌体细胞壁溶解、破碎、破乳化；II、静置分层后除去菌渣等固体杂质，回收烷烃；III、向发酵液中加入适量聚乙二醇，使聚合物溶解，制成双水相体系；IV、将上述双水相体系进行超重力处理，处理后上下两相迅速分离，蛋白、色素等杂质溶于上相，产物二羧酸盐溶于下相；V、取步骤IV中下相，酸化使二羧酸结晶析出，冷却、过滤、水洗、干燥得到精制的二羧酸产品。本发明采用双水相萃取与超重力结合精制长链二羧酸，缩短了工艺流程，节省了设备、时间和能耗等投入，而且可以得到纯度高、总氮含量低的精制产品。

Description

一种发酵液中长链二羧酸的提纯方法

技术领域

本发明涉及一种长链二羧酸的提纯方法，特别是从微生物发酵液中获得高纯度长链二羧酸的方法。

背景技术

长链二羧酸分子通式为C_nH_2n-2O₄，其中n为10-18，是微生物利用液蜡等发酵而得到的代谢产物。其发酵液是复杂的多相体系，其中含有未反应的碳源、微生物细胞及碎片、未利用的培养基和代谢产物以及微生物的分泌物等，尤其是其中含有大量蛋白质、色素和灰分等杂质，严重影响产品的纯度和应用，并给该种类二羧酸的提取与精制带来了困难。

目前提取长链二羧酸的方法一般分为溶剂法和水相法。虽然溶剂法可以解决上述问题，但由于溶剂法存在投资大，设备腐蚀严重，产品中残留有溶剂和烷烃以及生产安全性和环境污染等问题，该方法的使用受到了很大限制。传统的水相提纯方法虽然克服了溶剂法的缺陷，但是其产品纯度和收率不能达到较高指标。

CN01142806.6公开的长链二羧酸精制方法中，以长链二羧酸干粉为原料，使用丙酮、甲醇和乙醇作溶剂精制长链二羧酸。该法首先发酵液中的二羧酸先经活性炭吸附后，再酸化结晶、过滤、水洗和干燥二羧酸结晶滤饼得到长链二羧酸干粉，然后采用有机溶剂进行精制。该方法精制的原料为含水的滤饼经干燥后得到二羧酸干粉，对原料含水量的限制降低了该方法的操作弹性，增加了粗酸干燥的设备，导致此工艺流程较长，增加了生产成本。而且该方法在获得二羧酸结晶滤饼之前的碱性二羧酸钠盐的水溶液中及溶剂精制过程中，共进行了两次活性炭吸附处理，相关领域的技术人员都了解，增加一次活性炭处理过程，会增加设备投资和生产成本，并且活性炭用量与产品的损失是成正比的，活性炭用量越大，产品的收率越低。而且在有机溶剂精制二羧酸时，采用吸附剂一般能达到脱色的要求，但仍较难脱除其中的小分子蛋白，使总氮含量不符合要求。

CN1255483A公开了一种水相法分离二羧酸的方法：将终止发酵液加热除去未反应的烷烃，再加硅藻过滤除菌；滤液经调pH值得到酸饼和滤液；滤液又加活性炭脱色，然后过滤；又用脱色后的滤液溶解之前得到的酸饼，酸化；最后得到结晶，经烘干得到二羧酸产品。此方法操作步骤繁琐，操作成本高，而且二羧酸产品收率太低，纯度亦不高，烷烃回收率低。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种发酵液中长链二羧酸的提纯方法。本发明采用双水相萃取与超重力结合处理精制长链二羧酸，不仅缩短了工艺流程，节省了设备、时间和能耗等投入，而且可以得到纯度高、总氮含量低的精制产品，更适宜于工业化生产。

本发明发酵液中长链二羧酸的提纯方法，包括以下内容：

I、向终止发酵液中加入一定量的无机盐和碱溶液，搅拌使无机盐全部溶解，利用碱与盐的协同作用使菌体细胞壁溶解、破碎，同时进行体系的破乳化；

II、静置分层后除去菌渣等固体杂质，回收烷烃；

III、向发酵液中加入适量聚乙二醇，使聚合物溶解，制成双水相体系；

IV、将上述双水相体系进行超重力处理，处理后上下两相迅速分离，蛋白、色素等杂质溶于上相，产物二羧酸盐溶于下相；

V、取步骤IV中下相，酸化使二羧酸结晶析出，冷却、过滤、水洗、干燥得到精制的二羧酸产品。

本发明方法中，步骤I所述终止发酵液为微生物利用液蜡发酵而得到的代谢产物，其中含有的二羧酸分子通式为C_nH_2n-2O₄，其中n为10-18，二羧酸可以是单一一种二羧酸，也可以是混合二羧酸。

步骤I中所述无机盐可以是磷酸盐或者硫酸盐中的一种或几种，优选为磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸铵等中的一种或几种，加入量为发酵液质量的5%-20%。所述的碱溶液可以是质量浓度为10%-30%的NaOH溶液或KOH溶液，加入量为将体系pH值调节至10-12。

步骤I所述的加入无机盐和碱溶液可以是同时加入，也可以是先加入无机盐溶解后再加入碱溶液，优选先加入无机盐溶解后再加入碱溶液的方式。所述的搅拌混合时间为20-120min。

本发明方法中，步骤II可以采用离心或膜过滤等常规方法和设备进行脱除菌体等杂质的操作，所述静置时间为60-120min。

本发明方法中，步骤III所述的聚乙二醇的分子量为4000-40000之间，优选4000-20000，质量分数为4%-15%，优选为5%-10%。利用蛋白、杂蛋白色素、核酸等杂质与产物在双水相中两相的分配系数不同从而进行产物萃取。

本发明方法中，步骤IV超重力处理在超重力设备内进行，超重力设备为超重力旋转填充床、折流式、螺旋通道式、旋转碟片式及定-转子式等常规的超重力旋转装置，优选超重力旋转填充床。所述的超重力水平为50-650g（g为重力加速度＝9.8m/s²），超重力处理的平均停留时间为2-10s，超重力水平是指超重力反应器中转子旋转产生的离心加速度的大小，通常用重力加速度g的倍数表示，主要和转子的转速及转子的内外径有关。

本发明方法中，步骤V中酸化可以采用常规方法进行。所述酸化的pH值为2.0-4.0，加热温度为80-100℃。所述的酸化所用的酸可以是任意浓度的H₂SO₄、HNO₃、HCl或H₃PO₄。

步骤V中冷却结晶温度一般为使二羧酸充分结晶为止，温度一般为10℃～30℃。步骤V中的过滤步骤可以采用膜过滤，如纳滤膜或微滤膜等，可用的膜孔径范围为10^-3μm-10μm。

本发明方法可以获得高纯度的单一种类的二羧酸产品，也可以获得混合二羧酸产品。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

（1）采用无机盐和碱溶液相结合的方式使发酵液中的菌体细胞壁溶解、破碎同时破乳化，一方面无机盐的加入对细胞具有自溶作用，对体系同时具有破乳化作用；另一方面碱的皂化作用能够使细胞壁快速溶解，无机盐与碱液协同作用可以使菌体细胞的破碎更加彻底，使存在于细胞中的产物二羧酸更好的分散到体系中，从而为提高二羧酸产品的收率打下良好基础。

（2）采用双水相萃取提纯长链二羧酸，利用待分离杂质与产物二羧酸在双水相中两相的分配系数不同实现产物萃取，避免了溶剂法提取引入有机溶剂带来的生产安全性和环境污染等问题，同时解决了水相法提取的产物纯度难以达到较高要求的问题。

（3）采用双水相萃取与超重力处理相结合的方法提取长链二羧酸，利用超重力过程大大强化了相间传质，有效提升了萃取效果，使得蛋白、杂蛋白色素、核酸等杂质与产物更好的在两相间分开；同时超重力处理使得萃取与分相的时间大大缩短，节省了时间投入。

具体实施方式

下面通过实施例来进一步对本发明方法进行说明。

实施例1

以正十二烷烃为底物，利用热带假丝酵母发酵生产十二碳二羧酸。发酵结束时二羧酸浓度为164.3g/L，pH为7.4。取发酵液1000ml，向发酵液中加入其质量分数5%的磷酸二氢钾，搅拌使无机盐溶解，继续搅拌再加入质量分数10%的NaOH溶液，至体系pH=10，搅拌混合时间100min。静置60min，回收上层未反应的烷烃，用膜孔径为10^-2μm的滤膜过滤，除去菌体细胞、碎片。向体系中加入质量分数5%、分子量为4000的聚乙二醇，搅拌使聚合物溶解，形成双水相体系。将体系送入超重力设备中进行超重力处理，超重力水平为150g，超重力处理的平均停留时间为5s，将经过超重力处理的体系静止20min，将上下两相分离，取下相，用6M的硫酸调节pH至3并加热至85℃，恒温1h。以15℃/h匀速降至室温结晶，用膜孔径为10^-2μm的超滤膜过滤得二羧酸滤饼，水洗至中性，干燥滤饼即得到产品。产品质量见表1。

实施例2

以正十二烷烃为底物，利用热带假丝酵母发酵生产十二碳二羧酸。发酵结束时二羧酸浓度为158g/L，pH为7.3。取发酵液1000ml，向发酵液中加入其质量分数10%的磷酸氢二钾，搅拌使无机盐溶解，继续搅拌再加入质量分数为20%的NaOH溶液，至体系pH=12，搅拌混合时间120min。静置80min，回收上层未反应的烷烃，用膜孔径为10^-2μm的滤膜过滤，除去菌体细胞、碎片。向体系中加入质量分数10%、分子量为10000的聚乙二醇，搅拌使聚合物溶解，形成双水相体系。将体系送入超重力设备中进行超重力处理，超重力水平为200g，超重力处理的平均停留时间为10s，将经过超重力处理的体系静止30min，将上下两相分离，取下相，用6M的硫酸调节pH至3.5并加热至80℃，恒温1h。以10℃/h匀速降至室温结晶，用膜孔径为10^-2μm的超滤膜过滤得二羧酸滤饼，水洗至中性，干燥滤饼即得到产品。产品质量见表1。

实施例3

以正十三烷烃为底物，利用热带假丝酵母发酵生产十三碳二羧酸。发酵结束时二羧酸浓度为154.3g/L，pH为7.5。取发酵液1000ml，向发酵液中加入其质量分数15%的硫酸铵，搅拌使无机盐溶解，继续搅拌再加入质量分数为30%的NaOH溶液，至体系pH=12，搅拌混合时间20min。静置100min，回收上层未反应的烷烃，用膜孔径为10^-2μm的滤膜过滤，除去菌体细胞、碎片。向体系中加入质量分数12%、分子量为20000的聚乙二醇，搅拌使聚合物溶解，形成双水相体系。将体系送入超重力设备中进行处理，超重力水平为300g，超重力处理的平均停留时间为3s，将经过超重力处理的体系静止30min，将上下两相分离，取下相，用6M的硫酸调节pH至2.5并加热至95℃，恒温1h。缓慢降至室温结晶，用膜孔径为10^-2μm的超滤膜过滤得二羧酸滤饼，水洗至中性，干燥滤饼即得到产品。产品质量见表1。

实施例4

以正十三烷烃为底物，利用热带假丝酵母发酵生产十三碳二羧酸。发酵结束时二羧酸浓度为158.8g/L，pH为7.2。取发酵液1000ml，向发酵液中加入其质量分数20%的磷酸二氢钾，搅拌使无机盐溶解，继续搅拌再加入质量分数为20%的KOH溶液，至体系pH=10，搅拌混合时间60min。静置80min，回收上层未反应的烷烃，用膜孔径为10^-2μm的滤膜过滤，除去菌体细胞、碎片。向体系中加入质量分数8%、分子量为4000的聚乙二醇，搅拌使聚合物溶解，形成双水相体系。将体系送入超重力设备中进行超重力处理，超重力水平为400g，超重力处理的平均停留时间为2s，将经过超重力处理的体系静止20min，将上下两相分离，取下相，用6M的硫酸调节pH至2并加热至90℃，恒温1h。缓慢降至室温结晶，用膜孔径为10^-2μm的超滤膜过滤得二羧酸滤饼，水洗至中性，干燥滤饼即得到产品。产品质量见表1。

实施例5

以正十六烷烃为底物，利用热带假丝酵母发酵生产十六碳二羧酸。发酵结束时二羧酸浓度为155.6g/L，pH为7.6。取发酵液1000ml，向发酵液中加入其质量分数15%的硫酸铵，搅拌使无机盐溶解，继续搅拌再加入质量分数30%的KOH溶液，至体系pH=10，搅拌混合时间110min。静置60min，回收上层未反应的烷烃，用膜孔径为10^-2μm的滤膜过滤，除去菌体细胞、碎片。向体系中加入质量分数9%、分子量为6000的聚乙二醇，搅拌使聚合物溶解，形成双水相体系。将体系送入超重力设备中进行超重力处理，超重力水平为350g，超重力处理的平均停留时间为4s，将经过超重力处理的体系静止20min，将上下两相分离，取下相，用8M的硫酸调节pH至4并加热至92℃，恒温1h。缓慢降至室温结晶，用膜孔径为10^-2μm的超滤膜过滤得二羧酸滤饼，水洗至中性，干燥滤饼即得到产品。产品质量见表1。

比较例1

双水相体系不进行超重力处理，而用普通离心处理，离心时间4min，离心转速7000rpm，其余同实施例1，产品质量见表1。

比较例2

不制备双水相体系，即不加入聚乙二醇，其余同实施例1，产品质量见表1。

比较例3

不加入无机盐，其余同实施例1，产品质量见表1。

比较例4

不加入碱溶液，其余同实施例1，产品质量见表1。

表1 长链二羧酸产品质量

由表1可见，本发明方法较比较例所述方法取得了更为理想的提纯效果。

Claims (7)

1.一种发酵液中长链二羧酸的提纯方法，其特征在与包括以下内容：

I、向终止发酵液中加入一定量的无机盐和碱溶液，搅拌使无机盐全部溶解，利用碱与盐的协同作用使菌体细胞壁溶解、破碎，同时进行体系的破乳化；所述终止发酵液中含有的二羧酸分子通式为C_nH_2n-2O₄，其中n为10-18；无机盐是磷酸盐或者硫酸盐中的一种或几种，加入量为发酵液质量的5%-20%；所述的碱溶液是质量浓度为10%-30%的NaOH溶液或KOH溶液，加入量为将体系pH值调节至10-12；

II、静置分层后除去菌渣固体杂质，回收烷烃；

III、向发酵液中加入适量聚乙二醇，使聚合物溶解，制成双水相体系；所述的聚乙二醇的分子量为4000-40000之间，质量分数为4%-15%；

IV、将上述双水相体系进行超重力处理，处理后上下两相迅速分离，蛋白、色素杂质溶于上相，产物二羧酸盐溶于下相；

V、取步骤IV中下相，酸化使二羧酸结晶析出，冷却、过滤、水洗、干燥得到精制的二羧酸产品。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤I所述终止发酵液为微生物利用液蜡发酵而得到的代谢产物，二羧酸是单一一种二羧酸或者是混合二羧酸。

3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述无机盐是磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸铵中的一种或几种。

4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤II采用离心或膜过滤脱除菌体杂质，所述静置时间为60-120min。

5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤IV超重力处理在超重力设备内进行，超重力设备为超重力旋转填充床、折流式、螺旋通道式、旋转碟片式或定-转子式超重力旋转装置，所述的超重力水平为50-650g，g为重力加速度＝9.8m/s²，超重力处理的平均停留时间为2-10s。

6.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤V中酸化的pH值为2.0-4.0，加热温度为80-100℃；酸化所用的酸是任意浓度的H₂SO₄、HNO₃、HCl或H₃PO₄。

7.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤V中冷却结晶温度为10～30℃；过滤步骤采用纳滤膜或微滤膜，膜孔径范围为10^-3μm-10μm。