CN103420827A

CN103420827A - 一种通过双水相萃取从发酵液中提取丁二酸的方法

Info

Publication number: CN103420827A
Application number: CN2013103662589A
Authority: CN
Inventors: 郑璞; 古博华
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2013-08-21
Filing date: 2013-08-21
Publication date: 2013-12-04

Abstract

一种通过双水相萃取从发酵液中提取丁二酸的方法，属于生物化工技术领域。本发明涉及微生物发酵生产的丁二酸发酵液，经酸化处理后，加入溶解度较大的酸式盐和亲水性有机溶剂，形成双水相体系，分离上相并进行减压蒸馏回收有机溶剂、母液用活性炭脱色、浓缩结晶，得到丁二酸晶体；在下相中，加入亲水性醇，分别回收无机盐与亲水性醇。本发明克服了目前从丁二酸发酵液中提取目标产物丁二酸存在的效率低，成本高，蛋白和葡萄糖去除困难的问题，该提取丁二酸方法，具有低能耗、操作简单、绿色环保的特点。

Description

一种通过双水相萃取从发酵液中提取丁二酸的方法

技术领域

本发明涉及一种用新型的双水相体系（无机盐/亲水性有机溶剂），通过盐析萃取从发酵液中提取丁二酸的方法，属于生物化工技术领域。

背景技术

丁二酸是美国能源部确定的12种最具潜力的平台化合物，在制药、食品和农业领域应用广泛（DEPARTMENT OF ENERGY WASHINGTON DC, 2004）。发酵法生产丁二酸在上游过程已经取得了很大的进展，下游过程已经成为了发酵法生产丁二酸商业化的一个瓶颈。在发酵法生产丁二酸的过程中，下游提取和纯化过程占成本的60%以上（Chemical engineering & technology, 2008, 31(5): 647-654）。目前对于丁二酸的提取，主要有3个步骤：第一步是通过膜过滤或者离心去除细胞和蛋白；第二步主要是产品的分离和杂质的去除，主要有以下单元操作钙盐法、铵盐法、电渗析、络合萃取、离子交换、吸附和酸化酯化法。最后一步便是真空浓缩和结晶。

美国专利US 5168055提出了用钙盐法提取发酵液中的丁二酸，通过使用氢氧化钙调节发酵过程的pH值，使pH值保持在5.8~6.4，进而发酵产物形成丁二酸钙沉淀，然后将丁二酸钙进行过滤、水洗、硫酸溶解，进而形成丁二酸和硫酸钙沉淀。然后将丁二酸溶液过强酸阳离子树脂和弱碱阴离子树脂除去杂质，得到高纯度的丁二酸。钙盐法虽然简单，但是收率低、副产物硫酸钙不易处理等缺点。美国专利US 86265190B1提出了一种铵盐法制备丁二酸的方法，用氨水中和发酵液，发酵液浓缩到丁二酸胺含量30%后，加硫酸调pH1.5-1.8，得到丁二酸结晶，并用甲醇重结晶，回收硫酸和甲醇，其中包括高温裂解硫酸盐，该步骤繁琐，增加了运行成本。美国专利US 5143834使用电渗析的方法来提取丁二酸，首先将发酵液通过电渗析膜，丁二酸盐变成丁二酸和碱，然后将丁二酸溶液过强酸阳离子交换柱和弱碱阴离子交换柱得到高纯度的丁二酸，该步骤在电渗析的过程中耗能巨大，不适合商业化应用。液液萃取法工业过程中常用的方法，对于丁二酸的萃取，一般都是用叔胺类萃取剂，韩国Huh等报道了用络合萃取、真空浓缩和结晶三步提取丁二酸，丁二酸纯度达99.5%以上，回收率达73.1% （Process Biochemistry, 41 (2006) 1461–1465）。中国专利CN103012107A报道了将离子交换和络合萃取结合的方法来提取丁二酸，发酵液先过滤、通过强酸阳离子交换将丁二酸盐转化成丁二酸，然后经过络合萃取、氨水反萃、乙醇沉淀来提取丁二酸铵。萃取率超过90%，纯度为97.8%。但是由于有机溶剂的毒性，使其在食品和医药级的丁二酸应用受到限制。中国专利CN1887843A、CN101475464A都是使用膜过滤的方法来分离发酵液中丁二酸，其回收率较高，但是使用膜过滤极易造成膜污染，膜的再生需要使用大量的酸碱和水。中国专利CN101348428A使用阴离子交换树脂来吸附发酵液中丁二酸，将发酵液经过滤、阴离子交换树脂吸附、水洗、酸洗脱、减压浓缩、结晶得到丁二酸产品，离子交换树脂的洗脱需要消耗大量的水和产生大量的废弃树脂固体物，不利于绿色环保。美国Alvaro Orjuela 等报道了通过将发酵液直接浓缩到丁二酸盐固体，然后加入乙醇和浓硫酸来同时酸化和酯化得到丁二酸二乙酯，丁二酸的回收率在95%以上，但是由于发酵液存在葡萄糖和生物大分子，粘度很大，直接浓缩非常困难，耗能巨大，且浓缩时葡萄糖易与其他物质发生反应，使其颜色加深（Separation and Purification Technology, 2011, 83: 31-37）。

传统的双水相（高聚物/无机盐或者高聚物/高聚物），由于其温和的条件，操作简单，放大容易，在生物大分子（如蛋白）的提取中取得了很好的应用，但是由于高聚物价格非常昂贵，使其在大宗化学品的提取中受限。近年来，有学者在进行有机溶剂溶析结晶时发现，有的亲水性溶剂和无机盐在合适的条件下也能够形成双水相。与传统的双水相体系相比，此种新型的双水相，粘度低、分相快、成本低。中国专利CN101012151A和CN101012152A分别公开了利用新型的双水相萃取提取发酵液中1,3丙二醇和2，3丁二酸。中国专利CN101979368A公开了使用盐析萃取从发酵液中提取有机酸，产品回收率高、成本低，是一种有工业应用前景的方法。本发明针对发酵液中的丁二酸，采用新型的双水相体系提取，减少提取操作的流程，葡萄糖和蛋白去除率较高，同时，加入的无机盐、亲水性有机溶剂和小分子醇都可以很好的回收、绿色环保。

发明内容

本发明目的是针对目前从丁二酸发酵液中提取目标产物丁二酸存在的效率低，成本高，蛋白和葡萄糖去除困难的问题，发明一种通过双水相技术提取发酵液中的丁二酸的方法。

本发明的技术方案：一种通过双水相萃取从发酵液中提取丁二酸的方法，对于微生物发酵法生产的丁二酸发酵液，通过硫酸、或盐酸、或者阳离子交换树脂处理，使丁二酸发酵液的pH为1-3之间；往酸化发酵液中加入溶解度较大的酸式盐和亲水性有机溶剂，使体系形成双水相；对上相进行减压蒸馏回收亲水性有机溶剂，母液经活性炭脱色、浓缩结晶得到丁二酸晶体；对下相加入亲水性醇使无机盐沉淀回收无机盐，蒸馏回收亲水性醇。

具体步骤为：

（1）发酵液的酸化：丁二酸浓度为40~150g/L的发酵液，用硫酸、盐酸或者阳离子交换树脂进行处理，使其pH为1~3之间；

（2）双水相体系的形成：将已经酸化处理过的发酵液加入溶解度大的酸式无机盐硫酸铵、或磷酸二氢钠（终浓度质量分数15%-25%，w/w），溶解，然后再加入亲水性有机溶剂（终浓度质量分数20%-40%，w/w），震荡或者搅拌3-10min后，静置分相4-10h，将上下相进行分离；

亲水性有机溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、异丙醇、正丙醇，甘油、乙醚；

（3）从上相中分离提取丁二酸：将上相进行蒸馏（40~60℃）回收亲水性有机溶剂，母液进行活性炭脱色（0.5%-5%，重量/体积分数），温度50-90℃，脱色10-60min；并将脱色液进行减压浓缩（55~80℃）、4℃结晶得到丁二酸晶体；

（4）从下相中回收无机盐及亲水性醇：在分离的下相中加入亲水性醇，亲水性醇与下相的体积比为0.5~3（V/V），过滤回收沉淀的无机盐，滤液进行蒸馏（50~80℃）回收亲水性醇；亲水性醇为甲醇或乙醇。

本发明的有益效果：克服了目前从丁二酸发酵液中提取目标产物丁二酸存在的效率低，成本高，蛋白和葡萄糖去除困难的问题，发明一种通过双水相技术提取发酵液中的丁二酸方法。该提取丁二酸方法，具有低能耗、操作简单、绿色环保的特点。

附图说明

图1：双水相萃取提取发酵液中的丁二酸流程图。

具体实施方式

实施例1-5 酸式盐和碱式盐对丁二酸萃取的比较

实验条件：取4g不同酸式盐（(NH₄)₂SO₄、NaH₂PO₄）和碱式盐（K₂HPO₄、K₃PO₄、K₂CO₃）分别溶解于50g/L丁二酸溶液（模拟发酵液）中，然后再分别加入12g丙酮。分别进行震荡3min，静止8h分相，分别测定上下相的体积和丁二酸的含量，计算丁二酸的分配系数K和回收率Y；结果见表1；

表1：碱式盐与酸式盐对丁二酸萃取的比较

所以选择添加酸式盐。

实施例6-10 不同pH条件下发酵液中丁二酸的萃取情况

实验条件：用硫酸将丁二酸的发酵液调节成不同的pH值，然后分别取12g不同pH的发酵液，加入4g (NH₄)₂SO₄溶解，再加入4g丙酮震荡3min，静置8h分相，分别测定上下相的体积和丁二酸和葡萄糖的含量，计算丁二酸的萃取率Y和葡萄糖的去除率R，结果见表2；

表2：不同pH条件下丁二酸的萃取情况

由此可见，选择发酵液的pH1~3为合适。

实施例11-13 不同(NH₄)₂SO₄浓度条件下丁二酸发酵液萃取情况

实验条件：用硫酸将发酵液的pH值调节至2.0，取3份10g发酵液，分别加入不同质量的硫酸铵（3g、4g、5g），加入去离子水使每份的质量为15g，溶解，再分别加入5g丙酮，震荡3min，静置8h分相，分别测定上下相的体积，测定丁二酸，葡萄糖，蛋白和细胞的含量，计算丁二酸的萃取率Y和葡萄糖、细胞与蛋白的去除率，结果见表3；

表3不同(NH₄)₂SO₄浓度条件下丁二酸发酵液萃取情况

Figure 2013103662589100002DEST_PATH_IMAGE001

由此可见，盐的终浓度分数w/w为15%~25%较合适。

实施例14-16 不同丙酮浓度下丁二酸发酵液萃取情况

实验条件：用硫酸将发酵液的pH值调节至2.0，取3份10g发酵液，分别加入3g硫酸铵，溶解，再分别加入不同质量的丙酮（5g、6g、7g），再加入去离子水，使其总质量为20g，震荡3min，静置8h分相，分别测定上下相的体积，测定丁二酸，葡萄糖，蛋白和细胞的含量，计算丁二酸的萃取率Y和葡萄糖、细胞与蛋白的去除率，结果见表4；

表4 不同丙酮浓度下丁二酸发酵液的萃取情况

Figure 2013103662589100002DEST_PATH_IMAGE002

实施例17 用甲醇回收硫酸铵

用硫酸将丁二酸发酵液的pH值调节至2，取50g已调pH值的发酵液，加入15g硫酸铵，溶解，加入35g丙酮震荡3min，静置8h分相，将上下相分离，测得下相体积为35mL，往下相中加入70mL甲醇，硫酸铵沉淀出来，过滤，干燥，测得固体含量为17.19g，固体中硫酸铵含量为83.13%，得出固体中硫酸铵的质量为14.29g，硫酸铵的回收率为95.3%。过滤所得滤液蒸馏回收甲醇。

Claims

1.一种通过双水相萃取从发酵液中提取丁二酸的方法，其特征在于对于微生物发酵法生产的丁二酸发酵液，进行发酵液的酸化、双水相体系的形成、从上相中分离提取丁二酸并回收溶剂、从下相中回收无机盐及亲水性醇；工艺为：

（1）发酵液的酸化：丁二酸浓度为40~150g/L的发酵液，用硫酸、盐酸、或阳离子交换树脂处理，使丁二酸发酵液pH值为1~3；

（2）双水相体系的形成：将已经酸化处理过的发酵液加入溶解度大的酸式无机盐硫酸铵、或磷酸二氢钠，盐的终浓度质量分数w/w为15%~25%，然后再加入一种或者多种亲水性有机溶剂，有机溶剂的终浓度质量分数w/w为20%-40%，震荡或者搅拌3-10min后，静置分相4-10h，将上下相进行分离；

（3）从上相中分离提取丁二酸：将上相在40-60℃下蒸馏，回收亲水性有机溶剂，母液用重量/体积分数0.5%-5%活性炭脱色，在温度50-90℃下脱色10-60min，将脱色液在55-80℃下浓缩、4℃结晶得到丁二酸晶体；

（4）从下相中回收无机盐及亲水性醇：在分离的下相中，加入体积比为0.5-3的亲水性醇，过滤回收沉淀的无机盐，滤液于50-80℃蒸馏回收亲水性醇；

亲水性醇为甲醇或乙醇。