CN112266362B - 一种双水相萃取结合离子交换层析提取四氢嘧啶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种双水相萃取结合离子交换层析提取四氢嘧啶的方法。本发明是利用1‑丁基‑3‑甲基咪唑四氟硼酸盐(或1‑甲基‑3‑乙酸乙酯咪唑四氟硼酸盐)与硫酸盐双水相体系进行分离纯化，并结合大孔树脂与阳离子树脂交换层析、降温结晶的精制技术，可以获得较高的产品纯度和回收率，该方法还具有操作简便，安全环保，成本低等优点，适合工业推广应用。

Description

一种双水相萃取结合离子交换层析提取四氢嘧啶的方法
技术领域
本发明属于化工领域，具体而言，涉及一种双水相萃取结合离子交换层析提取四氢嘧啶的方法。
背景技术
四氢嘧啶(Ectoin)，又叫1,4,5,6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸，是耐盐微生物为维持渗透压平衡而在细胞内产生的一种相容性溶质，四氢嘧啶具有独特的理化特性，广泛用于医药、化妆品、食品、环保等领域。现如今各专利文献报道的四氢嘧啶的提取方法，大都是通过膜系统过滤、活性炭脱色、离子交换树脂结合冷冻结晶干燥法来获得产品，其工艺操作复杂，生产成本高，收率低。
双水相萃取技术是一种广泛用于蛋白质、酶、核酸等生物分子的分离体系，具有体系简单、成本低、性质温和、低毒等优点，是一种具有很大潜力和广阔工业应用前景的体系，室温条件下可获得较高的产品纯度和回收率，易于扩大生产。离子液体(ILs)，也称为低温熔融盐。离子液体作为离子化合物，其熔点较低的主要原因是因其结构中某些取代基的不对称性使离子不能规则地堆积成晶体所致。它一般由有机阳离子和无机或有机阴离子构成，常见的阳离子有季铵盐离子、季磷盐离子、咪唑盐离子和吡咯盐离子等，阴离子有卤素离子、四氟硼酸根离子、六氟磷酸根离子等。
基于离子液体的双水相体系相比传统的双水相系统如PEG-盐，有机试剂-盐等优点颇多，操作简便、没有粘度、安全环保等优势。有鉴于此，提出本发明。
发明内容
本发明克服了上述现有技术的不足，提供了一种双水相萃取结合离子交换层析提取四氢嘧啶的方法。本发明是利用1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐(或1-甲基-3-乙酸乙酯咪唑四氟硼酸盐)与硫酸盐双水相体系进行分离纯化，并结合大孔树脂与阳离子树脂交换层析、降温结晶的精制技术，可以获得较高的产品纯度和回收率，适合工业推广应用。
本发明的技术方案是：一种双水相萃取结合离子交换层析提取四氢嘧啶的方法，其特征是，
1)预处理
将含有四氢嘧啶的菌体发酵液离心，菌体冷冻干燥后粉碎至200目以下；
2)萃取
将粉碎后的菌粉加入到基于离子液体的双水相体系中，经充分混合后，静置形成明显的上下相，回收富含四氢嘧啶的离子液体相；
3)离子交换层析
将步骤2)中的富含四氢嘧啶的离子液体相经大孔吸附树脂和阳离子交换树脂除杂，得到洗脱液；
4)浓缩、结晶
将步骤3)中的洗脱液浓缩至质量浓度45％-70％，降温析晶，晶体真空干燥，得到高纯度的四氢嘧啶晶体。
进一步地，所述步骤2)中的双水相体系中的组成成分为：1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐(或1-甲基-3-乙酸乙酯咪唑四氟硼酸盐)、硫酸盐(硫酸铵或硫酸钠)。其中，双水相体系中，1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐(或1-甲基-3-乙酸乙酯咪唑四氟硼酸盐)的质量百分数为20-30％，硫酸盐的质量百分数为10-25％，并调pH5.8-6.2。
进一步地，所述步骤2)菌粉与二元双水相体系的比例为：每1L二元双水相体系，加入50-100g的菌粉。
进一步地，所述步骤3)中大孔吸附树脂为D101、D101B、XDA-1中的一种或几种，阳离子树脂为001*7、001*14.5、D72中的一种或几种。
进一步地，所述步骤3)的具体步骤为：将萃取液pH调至5.0，经大孔吸附树脂脱色除杂，收集透过液；将透过液过阳离子交换树脂深度除杂，用质量浓度为5％的氨水洗脱，收集洗脱液。
进一步地，所述步骤4)中的降温结晶法为：四氢嘧啶浓缩液从60-70℃逐渐降温，最终降到4-10℃得到高纯度的四氢嘧啶粗晶，将粗晶重溶于甲醇中，滤去杂质，浓缩结晶、干燥，得到高纯度的四氢嘧啶成品。
含有四氢嘧啶的菌体发酵液的制备方法见本公司2019-12-12申报的发明专利申请2019112723521一种喜盐芽孢杆菌及其工业化生产依克多因(四氢嘧啶)的方法，发酵液中四氢嘧啶的含量是10-16g/L。
本发明的有益效果：本发明采用基于离子液体的双水相萃取技术结合离子交换层析提取四氢嘧啶，相比常规的纯化技术(如膜系统过滤、电渗析法脱盐、活性炭脱色等方法)相比，具有操作简便，安全环保，成本低、收率高、产品纯度高等优点，适合工业推广应用。
具体实施方式
下面结合具体试验方法对本发明的技术方案及其所产生的技术效果做进一步的阐述。应当理解，下述说明仅是为了解释本发明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。本发明所述方法如无特殊说明，均为本领域常规方法。
二元双水相体系溶液配制：1)先制备80％-100％浓度离子液体，如1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐或1-甲基-3-乙酸乙酯咪唑四氟硼酸盐原溶液，30-40％浓度硫酸盐原溶液；2)再分别称量一定质量的离子液体原溶液、硫酸盐溶液，按照一定比例配成不同浓度的二元双水相体系。
实施例1
1)将含有四氢嘧啶的菌体发酵液10L，使用离心机高速离心，收集菌体，并放入冷冻干燥机中冷干，将得到的菌体用粉碎机粉碎至200目以下，得到菌体粉末400g，经检测四氢嘧啶含量为375mg/g。
2)将400g菌粉与5L二元双水相体系(1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐溶液终浓度为20％，硫酸铵溶液终浓度为20％)加入到10L反应器中，加入微量硫酸调节pH值为6，搅拌2h，静置2h，分离富集四氢嘧啶的离子液体相溶液，离心除去残留的菌体。
3)离子交换层析
将富集四氢嘧啶的离子液体相溶液pH调至5.0，经大孔吸附树脂D101脱色除杂，流速为3BV/h，收集透过液；将透过液过阳离子交换树脂001*7深度除杂，用5％的氨水洗脱，流速为1BV/h，收集洗脱液。
4)结晶
将上述洗脱液浓缩至浓度为47％，从60℃开始降温结晶，到4℃结晶结束，将粗晶重溶于甲醇中，滤去杂质，浓缩结晶、干燥，得到高纯度的四氢嘧啶成品106g，经检测纯度为98.9％，收率为70.7％。
实施例2
1)将含有四氢嘧啶的菌体发酵液15L，离心机高速离心，收集菌体，并放入冷冻干燥机中冷干，将得到的菌体用粉碎机粉碎至200目以下，得到菌体粉末620g，经检测四氢嘧啶含量为363mg/g。
2)将620g菌粉与10L双水相体系(1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐溶液终浓度为25％，硫酸铵溶液终浓度为20％)到15L反应器中，加入微量硫酸调节pH值为6，搅拌2h，静置2h，分离富集四氢嘧啶的离子液体相溶液，离心除去残留的菌体。
3)离子交换层析
将富集四氢嘧啶的离子液体相溶液pH调至5.0，经大孔吸附树脂XDA-1脱色除杂，流速为3BV/h，收集透过液。将透过液过阳离子交换树脂001*14.5深度除杂，用5％的氨水洗脱，流速为1BV/h，收集洗脱液。
4)结晶
将步骤3)的洗脱液浓缩至浓度为50％，从60℃开始降温结晶，到5℃结晶结束，将粗晶重溶于甲醇中，滤去杂质，浓缩结晶、干燥，得到高纯度的四氢嘧啶成品168.7g，经检测纯度为99.3％，收率为74.9％。
实施例3
1)将含有四氢嘧啶的菌体发酵液50L，离心机高速离心，收集菌体，并放入真空干燥箱中干燥，将得到的菌体用粉碎机粉碎至200目以下，得到菌体粉末2100g，经检测四氢嘧啶含量为381mg/g。
2)将2100g菌粉与30L双水相体系(1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐溶液终浓度为30％，硫酸铵溶液终浓度为25％)加入到50L反应器中，加入微量硫酸调节pH值为6，搅拌2h，静置2h，分离富集四氢嘧啶的离子液体相溶液，离心除去残留的菌体。
3)离子交换层析
将富集四氢嘧啶的离子液体相溶液pH调至5.0，经大孔吸附树脂D101B脱色除杂，流速为3BV/h，收集透过液。将透过液过阳离子交换树脂D72深度除杂，用5％的氨水洗脱，流速为1BV/h，收集洗脱液。
4)结晶
将洗脱液浓缩至浓度为52％，从65℃开始降温结晶，到4℃结晶结束，将粗晶重溶于甲醇中，滤去杂质，浓缩结晶、干燥，得到高纯度的四氢嘧啶成品579g，经检测纯度为99.1％，收率为72.4％。

Claims (7)

1.一种双水相萃取结合离子交换层析提取四氢嘧啶的方法，其特征是，
1)预处理
将含有四氢嘧啶的菌体发酵液离心，菌体冷冻干燥后粉碎至200目以下；
2)萃取
将粉碎后的菌粉加入到基于离子液体的双水相体系中，并调pH5.8-6.2；经充分混合后，静置形成明显的上下相，回收富含四氢嘧啶的离子液体相；
所述双水相体系中的组成成分为：1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐或1-甲基-3-乙酸乙酯咪唑四氟硼酸盐，以及硫酸盐；其中，双水相体系中，1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐或1-甲基-3-乙酸乙酯咪唑四氟硼酸盐的质量百分数为20-30％，硫酸盐的质量百分数为10-25％；
3)离子交换层析
将步骤2)中的富含四氢嘧啶的离子液体相经大孔吸附树脂和阳离子交换树脂除杂，得到洗脱液；
4)浓缩、结晶
将步骤3)中的洗脱液浓缩至质量浓度45％-70％，降温析晶，晶体真空干燥，得到高纯度的四氢嘧啶晶体。
2.如权利要求1所述的双水相萃取结合离子交换层析提取四氢嘧啶的方法，其特征是，所述步骤2)硫酸盐为硫酸铵或硫酸钠。
3.如权利要求1所述的双水相萃取结合离子交换层析提取四氢嘧啶的方法，其特征是，所述步骤2)菌粉与二元双水相体系的比例为：每1L二元双水相体系，加入50-100g的菌粉。
4.如权利要求1所述的双水相萃取结合离子交换层析提取四氢嘧啶的方法，其特征是，所述步骤3)中大孔吸附树脂为D101、D101B、XDA-1中的一种或两种以上的组合。
5.如权利要求1所述的双水相萃取结合离子交换层析提取四氢嘧啶的方法，其特征是，所述步骤3)所述阳离子树脂为001*7、001*14.5、D72中的一种或两种以上的组合。
6.如权利要求1所述的双水相萃取结合离子交换层析提取四氢嘧啶的方法，其特征是，所述步骤3)的具体步骤为：将萃取液pH调至5.0，经大孔吸附树脂脱色除杂，收集透过液；将透过液过阳离子交换树脂深度除杂，用质量浓度为5％的氨水洗脱，收集洗脱液。
7.如权利要求1-6中任一项所述的双水相萃取结合离子交换层析提取四氢嘧啶的方法，其特征是，所述步骤4)中的降温结晶法：四氢嘧啶浓缩液从60-70℃逐渐降温，最终降到4-10℃得到高纯度的四氢嘧啶粗晶，将粗晶重溶于甲醇中，滤去杂质，浓缩结晶、干燥，得到高纯度的四氢嘧啶成品。
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Pledgor: SHANDONG FREDA BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.

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