CN112778792B - 一种木霉属真菌中天然绿色色素的提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种木霉属真菌中天然绿色色素的提取方法，属于生物制品的提取制备技术领域。提取操作步骤如下：1培养木霉属真菌的菌种；2扩大培养得到大米培养物；3将大米培养物干燥，收取孢子；4孢子除杂得到除杂孢子；5制备色素粗提液；6浓缩干燥得到色素粗提物；7精制色素沉淀物；8将精制色素沉淀物干燥，得到墨绿色粉末状的天然绿色色素。本发明的绿色天然色素，在室内散失光下其稳定性是叶绿素的465倍；在光照时不易降解，在室温下放置一年，色素保存率仍有77%。研究发现其不溶于常见溶剂如水、乙醇、汽油、食用油及洗洁剂等常见试剂，因此着色后不易被水、有机溶剂或洗涤剂洗掉，具有广泛的应用前景。

Description

一种木霉属真菌中天然绿色色素的提取方法
技术领域
本发明属于生物制品的提取制备技术领域，具体涉及从木霉中提取绿色色素的工艺方法。
背景技术
木霉的孢子呈现绿色但其绿色色素至今未得到分离鉴定，其主要原因是目前常用的天然色素提取方法均无法从木霉中提取出绿色色素。只有将该绿色色素提取出来，才可为其分子结构与代谢通路的鉴定，及商品化应用奠定基础。
目前合成色素对消费者和环境的有害影响受到普遍的关注，寻求天然色素作为合成色素的代替品正成为研究热点。世界范围内对天然着色剂的需求在食品、化妆品和纺织行业迅速增长。
目前，通过植物和微生物生产的色素和着色剂是现代色素工业开发的主要来源。天然色素中，黄色和红色色素较多，但绿色色素除叶绿素外，其它种类较少。并且，天然叶绿素脱离植物细胞后易受环境中的光照、温度、氧化剂等因素的影响而被破坏，性质不稳定，因此亟需一种环境耐受更佳的天然绿色色素作为叶绿素的替代品。
发明内容
本发明的目的是提供一种木霉属真菌中天然绿色色素的提取方法。
一种木霉属真菌中天然绿色色素的提取操作步骤如下：
（1）培养菌种
将木霉属（Trichoderma）真菌接种于PDA培养基培，20～35℃条件下培养2～6天，得到菌种；
（2）扩大培养
将所述菌种接种于PDB液体培养基中，在转速150～250转/分钟、21～35℃条件下摇瓶培养2～6天；按1～10%体积重量比（V/W）接种到大米培养基中，培养7～15天，得到大米培养物；
（3）孢子收集
将大米培养物在-50～130℃干燥，然后使用收孢机或旋风分离器收取孢子；
（4）孢子除杂
按重量体积比1g ：0.5～5 mL，在孢子中加入除杂剂1号，在温度10～50℃、第一次回流提取30～600分钟，提取液回收用于下一批样品处理；固体部分按重量体积比1g ：0.5～5 mL，加入除杂剂2号，第二次回流提取30～600分钟，提取液回收用于下一批样品处理；固体部分再按重量体积比1g ：0.5～5 mL，加入除杂剂3号，搅拌均匀，在温度20～90℃、超声提取20～400分钟，过滤或离心，弃去滤液或离心上清，得到除杂孢子；
（5）制备色素粗提液
在除杂孢子中按重量体积比1g ：0.5～5 mL加入提取剂，搅拌或者室温下40KHz超声提取1～10小时，过滤或离心，滤液或离心上清即为色素粗提液；
（6）浓缩干燥
将色素粗提液减压浓缩，减压干燥，即得到色素粗提物；
（7）精制色素沉淀物
采用去杂法进行精制：按重量体积比1g ：1～10 mL将色素粗提物溶解于提取剂中，加入1～20倍体积的除杂剂3号使色素沉淀，离心过滤出第一沉淀物；按重量体积比1g ：1～10 mL将第一沉淀物用提取剂复溶，加入1～15倍体积的甲除杂剂2号使色素沉淀，离心过滤出第二沉淀物；按重量体积比1g ：1～10 mL将第二沉淀物用提取剂复溶，加入1～10倍体积的除杂剂1号使色素沉淀，离心去除上清，得到精制色素沉淀物；
（8）干燥
将精制色素沉淀物在压力小于或等于-0.1MP、温度-50～120℃条件下干燥，得到色素精制品，即为墨绿色粉末状的天然绿色色素。
进一步的具体技术方案如下：
步骤（1）中，所述木霉属（Trichoderma）的真菌为哈茨木霉（ T. harzianum）、绿色木霉 (T. viride)、康宁木霉 （T. koningii）中的一种。
步骤（2）中，所述PDB培养基的配方：6g马铃薯干粉或20g去皮鲜马铃薯、20g葡萄糖、加水至1000mL；所述大米培养基为在水中浸泡10～100 mim、高压灭菌的大米。
步骤（4）中，所述除杂剂1号的配方：按体积比乙酸乙酯或三氯甲烷：石油醚为 0.1～3：3～0.1（V/V）；
所述除杂剂2号配方：按体积比甲醇或乙醇：丙酮为 0.1～3：3～0.1（V/V）；
所述除杂剂3号配方：按体积比水：二甲基亚砜为 1：0～0.1（V/V）；
所述过滤的滤膜为100～600目；离心条件为：离心转速5000～20000转/分钟、时间5～20分钟。
步骤（5）中，所述提取剂由按体积比甲酸：乙醇为1：0~1（V/V）混合的混合液；所述过滤的滤膜为100～600目；离心条件为：离心转速5000～20000转/分钟、时间5～20分钟。
步骤（6）中，所述减压浓缩条件：压力小于或等于-0.08MP、温度20～98℃；减压干燥条件：压力小于或等于-0.1MP、温度-50～120℃。
步骤（7）中，离心条件为：离心转速5000～20000转/分钟、时间5～20分钟。
本发明的有益技术效果体现在下述几个方面：
1、本发明从木霉孢子中，通过除杂等方法提取得到天然绿色色素，解决了木霉属真菌中绿色色素无法提取的问题，为绿色色素分子结构与代谢通路的鉴定及商品化应用奠定基础。
2、本发明获得的绿色色素为天然色素，稳定性远强于植物叶绿素，在室内散失光下其稳定性是叶绿素的465倍；该天然色素在光照时不易降解，在室温下放置一年，色素保存率仍有77%。研究发现其不溶于常见溶剂如水、乙醇、汽油、食用油及洗洁剂等常见试剂，因此着色后不易被水、有机溶剂或洗涤剂洗掉，因此具有广泛的应用前景。实验结果表明，用绿色木霉绿色素染色的布匹，在25℃洗涤，在50℃烘干，反复100遍，其绿色色泽没有明显变化，科见其良好的稳定性。
3、本发明提取的绿色色素原料是木霉孢子，该菌容易培养，生产成本较低，易进行大规模工业化生产。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步地描述。
实施例1
一种木霉属真菌中绿色色素的具体提取操作步骤如下：
1.1培养菌种
将养哈茨木霉（ T. harzianum）真菌接种于PDA培养基，在20℃培养2天，获得菌种。
PDA培养基的配方为：6g马铃薯干粉或20g去皮鲜马铃薯，20g葡萄糖，15g琼脂，加水至1000mL。
1.2扩大培养
将步骤（1）获得的菌种接种于PDB液体培养基，于三角瓶中转速150转/分钟、21℃摇瓶培养2天，按1%体积重量比（V/W）接种到大米培养基中，培养7天，得到大米培养物。
PDB培养基的配方：6g马铃薯干粉、20g葡萄糖、加水至1000mL；大米培养基为在水中浸泡10mim，高压灭菌的大米。
1.3孢子收集
将大米培养物在-50℃干燥，然后使用收孢机收取孢子。
收孢机是一种以旋风收集为主要原理的机械。
1.4孢子除杂
按重量体积比1g ：0.5mL，在孢子中加入除杂剂1号，在温度10℃、第一次回流提取30分钟，提取液回收用于下一批样品处理；固体部分按重量体积比1g ：0.5mL，加入除杂剂2号，第二次回流提取30分钟，提取液回收用于下一批样品处理；固体部分再按重量体积比1g ：0.5mL，加入除杂剂3号，搅拌均匀，在温度20℃、超声提取20分钟，然后用100目滤膜过滤，弃去滤液，得到除杂孢子。
除杂剂1号配方：按体积比乙酸乙酯或三氯甲烷：石油醚为0.1：3（V/V）；
除杂剂2号配方：按体积比甲醇或乙醇：丙酮为0.1：3（V/V）；
除杂剂3号为水。
1.5制备粗提液
在除杂孢子中按重量体积比1g：0.5mL加入提取剂，提取剂为甲酸；室温下40KHz超声提取1小时，然后100目滤膜离心过滤，离心条件为：离心转速5000转/分钟、时间20分钟；滤液即为色素粗提液。
1.6浓缩干燥
将色素粗提液于-0.08MP、20℃减压浓缩，然后-0.1MP、-50℃减压干燥；即得到色素粗提物。
1.7色素沉淀物精制
采用去杂法进行精制：按重量体积比1g ：1mL将色素粗提物溶解于提取剂中，加入1倍体积的除杂剂3号使色素沉淀，离心分离出第一沉淀物；按重量体积比1g ：1 mL将第一沉淀物用提取剂复溶，然后加入1倍体积的甲除杂剂2号使色素沉淀，离心分离出第二沉淀物；按重量体积比1g ：1mL将第二沉淀物用提取剂复溶后加入1倍体积的除杂剂1号使色素沉淀，离心去除上清，得到色素沉淀物。
1.8色素干燥
将上述精制色素沉淀物在压力-0.1MP，温度-50℃条件下干燥，得到色素精制品，即为墨绿色粉末状的天然绿色色素。
实施例2
一种木霉属真菌中绿色色素的具体提取操作步骤如下：
2.1培养菌种
将绿色木霉（T. viride）真菌接种于PDA培养基，在30℃培养6天，获得菌种。
PDA培养基的配方为：20g去皮鲜马铃薯、20g葡萄糖、15g琼脂，加水至1000mL。
2.2扩大培养
将步骤（1）获得的菌种接入PDB液体培养基，于三角瓶中转速250转/分钟、35℃摇瓶培养6天，按10%体积重量比（V/W）接种到大米培养基中，培养16天，得到大米培养物。
PDB培养基的配方：20g去皮鲜马铃薯、20g葡萄糖，加水至1000mL；大米培养基为在水中浸泡10mim、高压灭菌的大米。
2.3孢子收集
将大米培养物在130℃干燥，然后使用旋风分离器收取孢子。
2.4孢子除杂
按重量体积比1g ：5mL，在孢子中加入除杂剂1号，在温度50℃、第一次回流提取600分钟，提取液回收用于下一批样品处理；第一次固体部分按重量体积比1g ：5mL，加入除杂剂2号，第一次回流提取600分钟，提取液回收用于下一批样品处理；第二次固体部分再按重量体积比1g ：5mL，加入除杂剂3号，搅拌均匀，在温度90℃、超声提取400分钟，转速5000转/分钟条件下，离心20分钟，弃去离心上清，得到离心沉淀物。
除杂剂1号配方为：乙酸乙酯或三氯甲烷：石油醚=0.1：3（V/V）；除杂剂2号配方为：甲醇或乙醇：丙酮=0.1：3V/V）；除杂剂3号配方为：水：二甲基亚砜=1：0（V/V）。
除杂剂1号配方为：乙酸乙酯或三氯甲烷：石油醚=3：0.1（V/V）；除杂剂2号配方为：甲醇或乙醇：丙酮=3：0.1（V/V）；除杂剂3号配方为：水：二甲基亚砜=1：0.1（V/V）。
2.5制备粗提液
按重量体积比1g：5mL在离心沉淀物中加入提取剂，室温下40KHz超声提取10小时，然后600目滤膜过滤；离心分离，转速20000转/分钟、离心时间5分钟；滤液即为色素粗提液。
提取剂为按体积比1：1的甲酸和乙醇的混合液。
2.6浓缩干燥
将色素粗提液于-0.06MP、98℃条件下减压浓缩，然后-0.08MP、120℃条件下减压干燥，即得到色素粗提物。
2.7精制色素沉淀物
采用去杂法进行精制：按重量体积比1g ：10 mL将色素粗提物用提取剂溶解，加入20倍体积的除杂剂3号使色素沉淀，离心分离，沉淀物按重量体积比1g ：10 mL用提取剂复溶，然后加入15倍体积的甲除杂剂2号使色素沉淀，离心分离，第二沉淀物按重量体积比1g ：10 mL再次用提取剂复溶，加入10倍体积的除杂剂1号使色素沉淀，离心去除上清，得到精制色素沉淀物。
2.8色素干燥
将精制色素沉淀物在压力-0.08MP、温度120℃条件下干燥，得到色素精制品，即为墨绿色粉末状的天然绿色色素。
实施例3
一种木霉属真菌中绿色色素的具体提取操作步骤如下：
3.1培养菌种
将蝗木霉（M. acridum）真菌接种于PDA培养基，在25℃培养4天，获得菌种。
PDA培养基的配方为：6g马铃薯干粉，20g葡萄糖，15g琼脂，加水至1000mL。
3.2扩大培养
将步骤（1）获得的菌种接入PDB液体培养基，于三角瓶中转速200转/分钟、28℃摇瓶培养4天后，按5%体积重量比（V/W）接种到大米培养基中，培养11天，得到大米培养物。
PDB培养基的配方：6g马铃薯干粉，20g葡萄糖，加水至1000mL；大米培养基为在水中浸泡10mim，高压灭菌的大米。
3.3孢子收集
将大米培养物在50℃干燥，然后使用旋风分离器收取孢子。
3.4孢子除杂
按重量体积比1g ：3mL，在孢子中加入除杂剂1号，在温度30℃、第一次回流提取300分钟，提取液回收用于下一批样品处理；按重量体积比1g ：3mL在第一次固体部分中加入除杂剂2号，第一次回流提取300分钟，提取液回收用于下一批样品处理；按重量体积比1g ：3mL在第二次固体部分中加入除杂剂3号，搅拌均匀，在温度55℃、超声提取210分钟，然后转速10000转/分钟离心10分钟，弃去离心上清，得到离心沉淀物。
除杂剂1号配方为：按体积比1.5：1.5由乙酸乙酯和石油醚混合均匀制得；
除杂剂2号配方为：按体积比1.5：1.5由甲醇和丙酮混合均匀制得；
除杂剂3号配方为：按体积比1：0.05由水和二甲基亚砜混合均匀制得。
3.5制备粗提液
按重量体积比1g：5mL在离心沉淀物中加入提取剂，室温下40KHz超声提取5小时，过滤，离心，滤液即为色素粗提液。
提取剂为甲酸：乙醇按体积比1：1（V/V）的混合液；过滤的滤膜为600目；离心条件为：离心转速20000转/分钟、时间5分钟。
3.6浓缩干燥
将色素粗提液于-0.07MP、98℃减压浓缩，然后-0.09MP、50℃减压干燥，即得到色素粗提物。
3.7精制色素沉淀物
采用去杂法进行精制：按重量体积比1g ：5mL将色素粗提物用提取剂溶解，加入20倍体积的除杂剂3号使色素沉淀，过滤出第一沉淀物，第一沉淀物按重量体积比1g ：5mL用提取剂复溶，然后加入15倍体积的甲除杂剂2号使色素沉淀，过滤出第二沉淀物，第二沉淀物按重量体积比1g ：5mL用提取剂复溶，加入10倍体积的除杂剂1号使色素沉淀，离心去除上清，得到精制色素沉淀物。
3.8色素干燥
将上述精制色素沉淀物在压力-0.09MP、温度50℃条件下干燥，得到色素精制品，即为墨绿色粉末状的天然绿色色素。

Claims (7)

1.一种木霉属真菌中天然绿色色素的提取方法，其特征在于操作步骤如下：
（1）培养菌种
将木霉属（Trichoderma）真菌接种于PDA培养基中，20～35℃条件下培养2～6天，得到菌种；
（2）扩大培养
将所述菌种接种于PDB液体培养基中，在转速150～250转/分钟、21～35℃条件下摇瓶培养2～6天；按1～10%体积重量比（V/W）接种到大米培养基中，培养7～15天，得到大米培养物；
（3）孢子收集
将大米培养物在-50～130℃干燥，然后使用收孢机或旋风分离器收取孢子；
（4）孢子除杂
按重量体积比1g ：0.5～5 mL，在孢子中加入除杂剂1号，在温度10～50℃、第一次回流提取30～600分钟，提取液回收用于下一批样品处理；固体部分按重量体积比1g ：0.5～5mL，加入除杂剂2号，第二次回流提取30～600分钟，提取液回收用于下一批样品处理；固体部分再按重量体积比1g ：0.5～5 mL，加入除杂剂3号，搅拌均匀，在温度20～90℃、超声提取20～400分钟，过滤或离心，弃去滤液或离心上清，得到除杂孢子；
所述除杂剂1号的配方：按体积比乙酸乙酯或三氯甲烷：石油醚为 0.1～3：3～0.1；
所述除杂剂2号配方：按体积比甲醇或乙醇：丙酮为 0.1～3：3～0.1；
所述除杂剂3号配方：按体积比水：二甲基亚砜为 1：0～0.1；
（5）制备色素粗提液
在除杂孢子中按重量体积比1g ：0.5～5 mL加入提取剂，搅拌或者超声提取2～10小时，过滤或离心，滤液或离心上清即为色素粗提液；
所述提取剂由按体积比甲酸：乙醇为1：0~1混合的混合液；
（6）浓缩干燥
将色素粗提液减压浓缩，减压干燥，即得到色素粗提物；
（7）精制色素沉淀物
采用去杂法进行精制：按重量体积比1g ：1～10 mL将色素粗提物溶解于提取剂中，加入1～20倍体积的除杂剂3号使色素沉淀，离心过滤出第一沉淀物；按重量体积比1g ：1～10mL将第一沉淀物用提取剂复溶，加入1～15倍体积的除杂剂2号使色素沉淀，离心过滤出第二沉淀物；按重量体积比1g ：1～10 mL将第二沉淀物用提取剂复溶，加入1～10倍体积的除杂剂1号使色素沉淀，离心去除上清，得到精制色素沉淀物；
所述提取剂由按体积比甲酸：乙醇为1：0~1混合的混合液；
所述除杂剂1号的配方、所述除杂剂2号的配方和所述除杂剂3号的配方同步骤（4）；
（8）干燥
将精制色素沉淀物在压力小于或等于-0.1MP、温度-50～120℃条件下干燥，得到色素精制品，即为墨绿色粉末状的天然绿色色素。
2.根据权利要求1所述的一种木霉属真菌中天然绿色色素的提取方法，其特征在于：步骤（1）中，所述木霉属（Trichoderma）的真菌为哈茨木霉（T. harzianum）、绿色木霉 (T. viride)、康宁木霉（T. koningii）中的一种。
3.根据权利要求1所述的一种木霉属真菌中天然绿色色素的提取方法，其特征在于：步骤（2）中，所述PDB培养基的配方：6g马铃薯干粉或20g去皮鲜马铃薯、20g葡萄糖、加水至1000mL；所述大米培养基为在水中浸泡10～100 mim、高压灭菌的大米。
4.根据权利要求1所述的一种木霉属真菌中天然绿色色素的提取方法，其特征在于：步骤（4）中，所述过滤的滤膜为100～600目；离心条件为：离心转速5000～20000转/分钟、时间5～20分钟。
5.根据权利要求1所述的一种木霉属真菌中天然绿色色素的提取方法，其特征在于：步骤（5）中，所述过滤的滤膜为100～600目；离心条件为：离心转速5000～20000转/分钟、时间5～20分钟。
6.根据权利要求1所述的一种木霉属真菌中天然绿色色素的提取方法，其特征在于：步骤（6）中，所述减压浓缩条件：压力小于或等于-0.08MP、温度20～98℃；减压干燥条件：压力小于或等于-0.1MP、温度-50～120℃。
7.根据权利要求1所述的一种木霉属真菌中天然绿色色素的提取方法，其特征在于：步骤（7）中，离心条件为：离心转速5000～20000转/分钟、时间5～20分钟。
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WO2010064262A2 (en) * 2008-12-05 2010-06-10 Myko Tech Private Limited A process for production of water soluble melanin using a strain of the fungus gliocephalotrichum
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