CN102731592B - 一种从橄榄叶提取橄榄苦甙和穗花杉双黄酮的方法 - Google Patents

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Abstract

一种从橄榄叶提取橄榄苦甙和穗花杉双黄酮的方法。干燥过后的油橄榄叶经用乙醇溶液提取、过滤、减压浓缩，萃取,然后用树脂吸附、乙醇洗脱、将洗脱液浓缩，结晶与重结晶制得橄榄苦甙和穗花杉双黄酮纯品。所用的试剂均为无毒、廉价、量产的化学试剂，整个过程中可利用成熟的试剂回收的常规技术，这极大地降低了向环境排放废弃物。由于能同时提取出橄榄苦甙和穗花杉双黄酮，极大地降低了其生产成本，又节约了橄榄叶资源。

Description

一种从橄榄叶提取橄榄苦甙和穗花杉双黄酮的方法
技术领域
本发明属于天然产物化学的技术领域，具体涉及一种从橄榄叶中分离提取高纯度橄榄苦甙和穗花杉双黄酮的方法。
背景技术
油橄榄（Olea europaea L.），又称洋橄榄、齐墩果，为木犀科（Oledceae）木犀榄属（Olea L）植物，昌世界名贵常绿木本油料和果用树种。油橄榄原产小亚细亚，经引种进入我国，现有油橄榄面积约50万亩。
油橄榄以叶和果实入药用于治疗多种疾病，橄榄叶的煎剂或浸剂在地中海国家常作为糖尿病的民间用药，有一定的疗效。油橄榄叶提取可用做膳食补充剂以增强免疫功能。现有资料表明油橄榄具有抗心率不齐，抗真菌，抗高胆固醇，降血糖，降血压，抗炎，抗氧化，抗病毒，利尿等多种药理活性。从油橄榄叶中分离得到的化学成分可分为：黄酮类、糖类、萜类、有机酸类及其它化合物。橄榄苦昔的药理作用主要有降血压、抗氧化、抗微生物和抗癌等作用。
橄榄叶中还含有穗花杉双黄酮，依赖性地清除二苯代苦味酰肼(DPPH)自由基，并能显著减轻溶血性磷脂酰胆碱(LPC)所致的ECV304细胞损伤。穗花杉双黄酮可通过抑制转录因子NF-κB的活化，抑制一氧化氮合酶的诱导生成，从而发挥抗炎活性，另外还具有体外降糖的效果。
目前国内有报道用橄榄叶提取加工橄榄叶提取物，但大多采用简单水提或醇提后直接喷雾干燥成分，产品中橄榄苦甙、总酚及黄酮含量低。在2007年《青橄榄叶的化学成分研究》文献中报道了从橄榄叶分离到了穗花杉双黄酮。王成章也报道了橄榄苦甙在橄榄叶中比果实和树皮中含量要高得多。公开号为CN101955503A的中国专利介绍了一种橄榄苦甙的制备方法，取多花素馨花作为原料，采用超临界CO2萃取技术进行提取，有机溶剂萃取，大孔树脂吸附分离，浓缩过滤，结晶重结晶得到橄榄苦甙。此方法因为原材料是花部分，对大规模制备橄榄苦甙有一定难度，另外，在目前生产过程中超临界CO2萃取技术很少应用，主要是一次投料生产量小，生产设备成本过高，所以这一技术很难应用于生产。公开号为CN102060893A的中国专利介绍了一种从油橄榄叶中同步制备橄榄苦苷和橄榄总黄酮的工艺方法，虽然采用了大孔吸附树脂串联吸附、梯度解吸附，分离开了大部分的物质，但将解吸液回收有机溶剂后直接喷雾干燥，分别得到较高含量的橄榄苦苷和橄榄总黄酮提取物产品。此方法分离过程太长，造成其有效成分得率过低，另外将解吸液直接喷雾干燥，解吸液中金属离子以盐的形式存在于产品中，其它杂质也会降低其有效成分含量。
发明内容
本发明采用的技术方案包括：干燥过后的油橄榄叶经用乙醇溶液提取、过滤、减压浓缩，萃取，然后用树脂吸附、乙醇洗脱、将洗脱液浓缩，结晶与重结晶制得橄榄苦甙和穗花杉双黄酮纯品。
因此，本发明提供一种从橄榄叶提取橄榄苦甙和穗花杉双黄酮的方法，步骤包括：
(1)粉碎橄榄叶，并将橄榄叶、60%乙醇按重量(kg)/体积比(L)=1:1-8进行混合，加热至50℃左右进行回流提取；
(2)过滤除渣后，在50℃减压浓缩至无乙醇味；
(3)将浓缩液用2-3倍体积的乙酸乙酯分三次进行萃取，分离得到三次乙酸乙酯层萃取液，合并其萃取液，并在50℃将其萃取液进行减压浓缩，直至获得干燥物；
(4)将干燥物用等重量水进行溶解，上H—103大孔树脂进行吸附，用40%乙醇进行洗脱，收集洗脱液Ⅰ，再用70%乙醇进行洗脱，收集洗脱液Ⅱ；
(5)将洗脱液Ⅰ进行减压浓缩至原有体积的1/4-1/5，加入三倍体积的无水乙醇进行结晶和重结晶，得橄榄苦甙；
(6)将洗脱液Ⅱ进行减压浓缩至原有体积的1/5-1/6，加入二倍体积的丙酮进行结晶和重结晶，得穗花杉双黄酮。
在一个实施方案中，步骤(2)的回流提取时间为5小时至18小时。
在一个实施方案中，步骤(2)的过滤过程是纱布过滤、陶瓷膜过滤。其中，优选是三层纱布过滤2次、陶瓷膜过滤1次。
在一个实施方案中，步骤(5)、(6)中进行结晶和重结晶时结晶温度在低温下进行，优选是在4℃左右。
技术效果
1、本发明方法中所用的原料、设备均为常见的普通原料、设备，避免了工业化生产过程中对于昂贵原材料、仪器的依赖，大大地降低了生产成本。
2、本发明所用的试剂均为无毒、廉价、量产的化学试剂，整个过程中可利用成熟的试剂回收的常规技术，这极大地降低了向环境排放废弃物。
3、经过长期摸索，本发明确定了采用高浓度乙醇在低温条件下进行结晶，橄榄苦甙的纯度是最高，可达到97.37-98.23%。
4、由于能同时提取出橄榄苦甙和穗花杉双黄酮，极大地降低了其生产成本，又节约了橄榄叶资源。
附图说明
图1：橄榄苦甙标准品的HPLC曲线图，其中纵坐标表示峰面积，横坐标表示分离时间。
图2：从橄榄叶中提取的橄榄苦甙的纯度HPLC曲线图，其中纵坐标表示峰面积，横坐标表示分离时间。
图3：穗花杉双黄酮纯品的C-NMR谱
图4：穗花杉双黄酮纯品的H-NMR谱
具体实施方式
下面，本发明将用实施例进行进一步的说明，但是它并不限于这些实施例的任一个或类似实例。
实施例1
称取100kg橄榄叶，普通粉碎机进行粉碎，加入400L的60%乙醇进行混合，加热至50℃左右进行回流提取10小时后，采用三层纱布过滤2次、陶瓷膜过滤1次；进行过滤除渣后，在50℃减压浓缩至无乙醇味，得浓缩液80L；将浓缩液用200L的乙酸乙酯分三次进行萃取，分离得到三次的乙酸乙酯层，合并乙酸乙酯萃取液220L，将其萃取液进行50℃减压浓缩，直至获得干燥物2.65kg；将干燥物用2.65kg水进行溶解，上H—103大孔树脂进行吸附，用40%乙醇进行洗脱，收集洗脱液Ⅰ40L，再用70%乙醇进行洗脱，收集洗脱液Ⅱ30L；将洗脱液Ⅰ进行减压浓缩至8L，加入24L的无水乙醇在4℃进行结晶和重结晶，得橄榄苦甙1.17kg；将洗脱液Ⅱ进行减压浓缩至5L，加入10L的丙酮在4℃进行结晶和重结晶，得穗花杉双黄酮0.36kg。所得重结晶样品进行纯度，其检测仪器为Agilent1100高效液相色谱仪（美国安捷伦公司），色谱柱为Shim-pack ODS C18柱（4.6×150mm，5μm），流动相为0.2%磷酸溶液一乙睛(79:21，V/V) ，检测波长：254nm；柱温30℃；流速：1.0mL/min；上样量为10μL，检测所得到橄榄苦甙的纯度为98.43%。流动相为0.5%磷酸二氢钠溶液一甲醇(40:60，V/V) ，检测波长：330nm；柱温30℃；流速：1.0mL/min；上样量为10μL，检测所得到穗花杉双黄酮的纯度为97.68%。
实施例2
称取200kg橄榄叶，普通粉碎机进行粉碎，加入600L的60%乙醇进行混合，加热至50℃左右进行回流提取10小时后，采用三层纱布过滤2次、陶瓷膜过滤1次；进行过滤除渣后，在50℃减压浓缩至无乙醇味，得浓缩液150L；将浓缩液用350L的乙酸乙酯分三次进行萃取，分离得到三次的乙酸乙酯层，合并乙酸乙酯萃取液380L，将其萃取液进行50℃减压浓缩，直至获得干燥物5.48kg；将干燥物用5.48kg水进行溶解，上H—103大孔树脂进行吸附，用40%乙醇进行洗脱，收集洗脱液Ⅰ60L，再用70%乙醇进行洗脱，收集洗脱液Ⅱ45L；将洗脱液Ⅰ进行减压浓缩至12L，加入36L的无水乙醇在4℃进行结晶和重结晶，得橄榄苦甙2.35kg；将洗脱液Ⅱ进行减压浓缩至8L，加入16L的丙酮在4℃进行结晶和重结晶，得穗花杉双黄酮0.84kg。按实施例1中检测方法进行检测所得到橄榄苦甙的纯度为98.26%，穗花杉双黄酮的纯度为98.25%。
实施例3
称取500kg橄榄叶，普通粉碎机进行粉碎，加入2000L的60%乙醇进行混合，加热至50℃左右进行回流提取10小时后，采用三层纱布过滤2次、陶瓷膜过滤1次；进行过滤除渣后，在50℃减压浓缩至无乙醇味，得浓缩液300L；将浓缩液用800L的乙酸乙酯分三次进行萃取，分离得到三次的乙酸乙酯层，合并乙酸乙酯萃取液850L，将其萃取液进行50℃减压浓缩，直至获得干燥物11.28kg；将干燥物用11.28kg水进行溶解，上H—103大孔树脂进行吸附，用40%乙醇进行洗脱，收集洗脱液Ⅰ150L，再用70%乙醇进行洗脱，收集洗脱液Ⅱ120L；将洗脱液Ⅰ进行减压浓缩至30L，加入90L的无水乙醇在4℃进行结晶和重结晶，得橄榄苦甙5.74kg；将洗脱液Ⅱ进行减压浓缩至20L，加入40L的丙酮在4℃进行结晶和重结晶，得穗花杉双黄酮1.95kg。按实施例1中检测方法进行检测所得到橄榄苦甙的纯度为98.78%，穗花杉双黄酮的纯度为97.83%。

Claims (1)

1.一种从橄榄叶提取橄榄苦甙和穗花杉双黄酮的方法，其具体步骤包括：
(1)粉碎橄榄叶，并将橄榄叶、50%乙醇按重量(kg)/体积比(L)=1:1-8进行混合，加热回流提取；
(2)过滤除渣后，减压浓缩至无乙醇味；
(3)将浓缩液用2-3倍体积的乙酸乙酯萃取三次，分离乙酸乙酯层并进行浓缩，直至获得干燥物；
(4)将干燥物用等重量水进行溶解，上H—103大孔树脂进行吸附，用40%乙醇进行洗脱，收集洗脱液Ⅰ，再用70%乙醇进行洗脱，收集洗脱液Ⅱ；
(5)将洗脱液Ⅰ进行减压浓缩至原有体积的1/4-1/5，加入三倍体积的无水乙醇进行结晶和重结晶，得橄榄苦甙；
(6)将洗脱液Ⅱ进行减压浓缩至原有体积的1/5-1/6，加入二倍体积的丙酮进行结晶和重结晶，得穗花杉双黄酮。
2.根据权利要求1的方法，步骤(2)的过滤过程是三层纱布过滤2次、陶瓷膜过滤1次。
3.根据权利要求1或2的方法，其中步骤(5)、(6)中进行结晶和重结晶时结晶温度在4℃低温下进行。
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