CN108575556B - 一种猴头菌株及其选育方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株猴头菌株，通过双亲菌株原生质体的制备与单核体的挑选、杂合菌株的鉴定、杂合菌株的进一步筛选、杂合菌株栽培子实体的筛选，获得一株菌丝生物高、单产稳定且子实体多糖含量高的优良菌株ZJ611，保藏编号：CGMCC No.14990。本发明提供的猴头菌株生长速率达到0.308cm/d，比亲本菌株提高12％；摇瓶生物量达到12.23g/L，比亲本菌株提高43.07％；胞内多糖产率为0.89g/L，比亲本菌株提高36％；栽培子实体的单产到达87g/袋；多糖含量达到8.54％，比亲本提高63.9％。

Description

一种猴头菌株及其选育方法

技术领域

本发明属于微生物杂交育种领域，具体的说涉及一种猴头菌株及其选育方法。

背景技术

猴头菌是我国著名的食药兼用菌，隶属于担子菌门，猴菇科，猴菇属。猴头菇具有保肝护胃、降血糖、保护神经、增强人体免疫力、抗癌、抗氧化等功效，可治疗神经衰弱、胃炎及胃溃疡等，具有很高的食用和药用价值，已被开发为相关药物制剂。

猴头菌的化学成分非常复杂，有多糖、甾醇类、萜类、脂肪酸、酚类等化合物，其中猴头菌多糖是最主要的活性成分，具有提高免疫力、抗肿瘤、降血糖、抗氧化、抗衰老等多种功效。随着对猴头菌的深入研究和猴头菌类产品的开发，高产多糖的猴头菌的需求急剧增加，而现有猴头菌多糖主要来源于传统模式栽培的子实体和固体发酵菌丝体，因栽培环境的不稳定和菌株的退化，致使其多糖含量不高且不稳定，因此获得高品质猴头菌尤为重要。

发明内容

本发明的目的首先是提供一种猴头菌株，该菌株的保藏编号为：CGMCC No.14990，其分类命名：猴头菌，拉丁文学名：Hericiumerinaceus，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路 1号院3号，保藏日期是2017年12月18日。

本发明还提供了上述猴头菌菌株的选育方法，该方法包括如下步骤：

(1)原生质体的制备与单核体的挑选：

将刺长、0605两种菌种分别接种于PDB液体培养基上，静置培养6～8d，获得菌丝体；

两种菌丝体分别用溶壁酶和崩溃酶于32℃酶解2.5h，分别获得原生质体；

原生质体稀释至10⁴个/mL，涂布于PDA平板上，培养2～3d后挑出再生的原生质体置于PDA平板上，再生菌落长出菌丝后镜检观察锁状联合，挑选没有锁状联合的菌丝(初步判定其为单核菌丝)；

(2)杂合菌株的鉴定

将挑出的0605、刺长单核体放置于PDA平板上进行对峙培养，培养10～15d 后，挑出单核菌丝两端生长速度加快的菌丝进行镜检，挑选出有锁状联合的菌丝则可初步判定其为杂合菌丝；

(3)杂合菌株的进一步筛选

挑出杂合菌丝于新的PDA平板上，通过生长速度、摇瓶生物量、菌丝体胞内多糖含量实验，挑选出生长速度快、生物量高、菌丝体胞内多糖含量都优于亲本的新菌株；

(4)杂合菌株栽培子实体的筛选

挑出的生长速度快、生物量高、菌丝体胞内多糖含量相对高的菌株进行子实体栽培，从栽培种制作到子实体成熟，培养周期50天；经子实体单产计算及多糖含量分析，挑出产量、多糖含量均优于亲本的新菌株ZJ611(保藏编号为 CGMCC No.14990)。

本发明还提供了上述猴头菌株的应用，其可用于制备猴头菌子实体多糖。

本发明还提供了一种由上述猴头菌株子实体提取的多糖。

本发明制备得到的猴头菌株ZJ611具有以下优点：

通过原生质体单核体杂交育种技术得到的猴头菌株，通过菌丝生长速度、摇瓶生物量、菌丝体胞内多糖含量进行筛选，获得新的优良杂交菌株。得到的猴头新菌株的菌丝生长速度及生物量均有大幅度上升，胞内多糖产量提升36.9％；子实体多糖含量提升63.9％。

具体实施方式

为了对本发明有更深入的了解，现结合具体的应用实例对本发明做进一步的说明：

亲本猴头菌株0605、刺长两株菌株来源于中国微生物菌种保藏中心上海食用菌分中心。

本实验所使用培养基配方：

固体培养基：PDA(马铃薯葡萄糖琼脂培养基购于BD公司)粉末39g，蒸馏水1L，121℃灭菌20min备用。

液体培养基：PDB(马铃薯葡萄糖肉汤培养基购于BD公司)粉末24g，蒸馏水1L，121℃灭菌20min备用。

原生质体再生培养基：PDA粉末39g，甘露醇109.2g，蒸馏水1L，121℃灭菌20min倒平板备用。

实施例1：

(一)原生质体的制备与单核体的挑选

(1)亲本菌株的活化及培养：将斜面菌种0605、刺长转接到PDA平板中， 26℃培养箱中培养10～15d。挑取平板菌丝于匀浆器中，加入少量液体培养基，匀浆打碎，接种于100mL液体培养基中，26℃恒温，静置培养10d，期间每天轻微震荡菌丝2～3次。

(2)原生质体的制备：过滤收集静置培养菌丝，无菌水冲洗1～2次，无菌吸水纸将菌丝表面水分吸干。按照每0.3g菌丝加入1mL酶液(0.2g溶壁酶(购于广东省微生物研究所)、0.05g崩溃酶(购于Sigma)溶于10mL 0.6mol/L的甘露醇溶液中，经0.2μm细菌过滤器过滤除菌)，32℃，150r/min，酶解2.5h。用G-3砂芯漏斗过滤，将收集的滤液在4℃、3000r/min条件下离心10min，弃上清，沉淀用0.6mol/L的甘露醇洗涤2～3次，得到纯化的原生质体。

(3)原生质体单核体的挑选将得到的0605、刺长原生质体溶液分别从10⁶稀释至10²涂布于原生质体再生平板上，放置于26℃黑暗培养。待再生平板上长出再生菌落时将再生菌落一一挑出至PDA平板上26℃黑暗培养。培养至3天后将PDA平板放置于倒置显微镜下观察再生菌落的菌丝是否有锁状联合。将没有锁状联合的再生菌落挑出放置于PDA平板上26℃黑暗培养。

(二)杂合菌株的鉴定

将接种到PDA平板上的0605、刺长原生质体单核体于26℃恒温培养15d 后，取两种菌株0.5cm×0.5cm菌块对峙培养，菌块距离1cm。当不同亲本的菌丝交错在一起时，取两亲本最远端生长速度快的菌丝进行镜检。以菌丝体是否有锁状联合为杂合子的初筛指标进行杂交菌株筛选。挑选具有锁状联合的菌株并转接到PDA平板上培养。

(三)杂合菌株的进一步筛选

(1)杂合菌株的初筛：将挑选得到的具有锁状联合的菌株转接到PDA平板上培养10d后，用直径0.6cm的打孔器定量接种于新的PDA平板之上，培养10d 后，统计菌丝生长速度，以亲本菌株0605、刺长平均生长速度为对照。并用直径0.6cm的打孔器定量接种5～6块于100mL液体培养基内，培养10～12d，菌丝体清洗过滤冻干，测其摇瓶生物量(生物量＝菌丝体干重g/液体培养基装液量L)。选取菌丝生长速度、生物量增长大于20％的菌株共15株如下表1。

(2)杂合菌株的复筛

取上述步骤中筛出的15株优秀菌株，用直径0.6cm的打孔器定量接种5～6 块于100mL液体培养基内，培养10～12d，菌丝体清洗过滤冻干，测其摇瓶生物量及多糖含量，并计算多糖产量。选取生物量提高率大于20％，且菌丝体多糖含量大于7％的菌株共9株如下表。(其中，0605和刺长为亲本菌株；其余的为杂交菌株)

生物量＝菌丝体干重(g)/液体培养基装液量(L)

菌丝体多糖的测定

1.供试样品溶液的制备

取1g菌丝，置250mL三角瓶中，按照液质比20:1加水蒸馏水，沸水浴提取2h，提取两次，将提取液转移到烧杯中。

2.标准曲线

分别吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml标准葡萄糖溶液(100μg/mL)置20mL 具塞玻璃试管中，用蒸馏水补至1ml，再加入5％苯酚溶液1ml，混匀后迅速加入5ml浓硫酸，静置10min，使用漩涡振荡器使反应液充分混合，然后将试管置于沸水浴中反应15min，490nm测吸光度，以葡聚糖或葡萄糖质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

3.测定

吸取1mL稀释后样品溶液于20mL具塞试管，按标准曲线项下的步骤操作。

4.结果计算

样品中多糖含量以质量分数w计，单位以克每百克(g/100g)表示，按以下公式计算：

W＝(m₁×V₁/m₂×V₂)×0.9×10^-4

m1：从标准曲线上查的样品测定液中含糖量，单位为μg

V1:样品定容体积，单位mL

V2：比色测定时所移取样品测定液的体积，单位mL

m2：样品质量，单位g

表1杂合子菌丝生长速率、生物量及菌丝多糖产率

(四)杂交菌株栽培子实体的筛选

将上述优良菌株进行子实体栽培，培养料配方：木屑30％、玉米芯40％、棉籽壳15％、玉米粉2％、麸皮6％、米糠5％、石膏1％、碳酸钙1％。栽培袋： 15cm*30cm*0.045cm的聚乙烯塑料袋，每袋湿重600g；

灭菌接种：高压灭菌，100℃保温60min，121℃灭菌90min，灭菌结束后待菌包中心温度冷却至24℃以下，进行接种。

栽培种培养：发菌期培养温度24～26℃，避光培养，低于24℃，微弱散射光易出原基。培养环境条件为：前3-5天为定植期，调整培养室室温为25～26℃，二氧化碳浓度低于4000ppm，空气相对湿度65％以下，黑暗培养；而后进入发热期，将培养室室温调整为24～25℃，同时增加室内循环，房间二氧化碳浓度不超过3000ppm，湿度控制在65％左右，培养周期13～15d；

栽培管理：第1天，去掉盖子，将出菇房温度调整为15-18℃，加大内循环，黑暗培养；第2-5天，开始形成小原基。控制室内温度14-15℃，湿度90-95％，二氧化碳800ppm以下，每天光照5小时，强度50-100lux；第6-8天，刺激子实体形成。控制室内温度12-14℃，湿度85-90％，二氧化碳800ppm以下，每天光照5小时，强度50-100lux；第9天，控制室内温度12-14℃，湿度80-85％，二氧化碳800ppm以下；第10天，菇体基本长足，坚实，色白，菌刺长度在1.3-1.5 厘米，未弹射孢子，此时适时采收。

(4)子实体多糖含量测定及高多糖含量菌株筛选

样品待测液制备：将不同菌株栽培的猴头菌子实体(每个菌株采样30袋后混合)分别烘干，粉粹，称取0.5g样品，做两次平行，精确到0.001g，置于50ml 具塞离心管内。用5ml纯水浸润样品，缓慢加入20ml无水乙醇；使用漩涡振荡器振荡摇匀，使样品混合均匀，置于超生提取器中超生提取30min；提取结束之后，于13000r/min离心10min，弃去上清液；沉淀用10ml 80％乙醇溶液溶解，再次离心，弃上清；用水将沉淀转入离心管，加入50ml蒸馏水，利用恒温振荡仪进行加热。设定温度100℃，时间设定2h；冷却至室温，于13000r/min离心10min，将上清液加水定容到100ml容量瓶中，此溶液为测定液。

多糖测定：苯酚-硫酸法测定多糖含量。将待测样品稀释5倍，取1ml于试管中，分别加入0.5ml苯酚溶液，混匀，再加入2.5ml浓硫酸(98％)，混匀，100℃水浴加热30min。充分反应后在490nm处测定吸光度值，以葡聚糖为标准品计算样品的糖含量。

从栽培结果可以看出，单产和多糖含量均高于亲本的仅有ZJ611和ZJ1210菌株，而ZJ611子实体的多糖含量要高出亲本50％以上，因此选取单产高，且子实体多糖含量提高63.9％的菌株ZJ611。(其中，0605和刺长为亲本菌株；其余的为杂交菌株)

表2杂合子栽培子实体单产和多糖含量

Claims (4)

1.一种猴头菌株，该菌株的保藏编号为：CGMCC No.14990；

所述猴头菌株制备方法包括如下步骤：

(1)原生质体的制备与单核体的挑选：

将刺长、0605两种菌种分别接种于PDB液体培养基上，静置培养6～8d，获得菌丝体；

两种菌丝体分别用溶壁酶和崩溃酶于32℃酶解2.5h，分别获得原生质体；

原生质体稀释至104个/mL，涂布于PDA平板上，培养2～3d后挑出再生的原生质体置于PDA平板上，再生菌落长出菌丝后镜检观察锁状联合，挑选没有锁状联合的菌丝；

(2)杂合菌株的鉴定：

将挑出的0605、刺长单核体放置于PDA平板上进行对峙培养，培养10～15d后，挑出单核菌丝两端生长速度加快的菌丝进行镜检，挑选出有锁状联合的菌丝判定其为杂合菌丝；

(3)杂合菌株的进一步筛选：将挑出的杂合菌丝于PDA平板上，通过生长速度、摇瓶生物量、菌丝体胞内多糖含量实验，挑选出生长速度快、生物量高、菌丝体胞内多糖含量都优于亲本的新菌株；

(4)杂合菌株栽培子实体的筛选：

挑出的生长速度快、生物量高、菌丝体胞内多糖含量相对高的菌株进行子实体栽培；经子实体单产计算及多糖含量分析，挑出产量、多糖含量均优于亲本的新菌株ZJ611。

2.一种制备权利要求1所述猴头菌株的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

(1)原生质体的制备与单核体的挑选：

将刺长、0605两种菌种分别接种于PDB液体培养基上，静置培养6～8d，获得菌丝体；

两种菌丝体分别用溶壁酶和崩溃酶于32℃酶解2.5h，分别获得原生质体；

原生质体稀释至104个/mL，涂布于PDA平板上，培养2～3d后挑出再生的原生质体置于PDA平板上，再生菌落长出菌丝后镜检观察锁状联合，挑选没有锁状联合的菌丝；

(2)杂合菌株的鉴定：

将挑出的0605、刺长单核体放置于PDA平板上进行对峙培养，培养10～15d后，挑出单核菌丝两端生长速度加快的菌丝进行镜检，挑选出有锁状联合的菌丝判定其为杂合菌丝；

(3)杂合菌株的进一步筛选： 将挑出的杂合菌丝于PDA平板上，通过生长速度、摇瓶生物量、菌丝体胞内多糖含量实验，挑选出生长速度快、生物量高、菌丝体胞内多糖含量都优于亲本的新菌株；

(4)杂合菌株栽培子实体的筛选：

挑出的生长速度快、生物量高、菌丝体胞内多糖含量相对高的菌株进行子实体栽培；经子实体单产计算及多糖含量分析，挑出产量、多糖含量均优于亲本的新菌株ZJ611。

3.一种如权利要求1所述猴头菌株的应用，其可用于制备提取猴头菌子实体多糖。

4.一种由权利要求1所述猴头菌株子实体提取的多糖。