CN110896784A - 一种桦褐孔菌的代料栽培培养基、代料栽培方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种桦褐孔菌的代料栽培培养基和代料栽培方法，属于真菌栽培技术领域，包括杂木屑、玉米芯、麦麸、豆粉、白糖、石膏、水和茉莉酸甲酯母液；其中茉莉酸甲酯母液能够有效提高桦褐孔菌子实体的三萜含量，尤其能够有效提高桦褐孔菌Inonotus obliquus 1号(保藏编号为CGMCC No.10297)子实体的三萜含量，进而能够提高桦褐孔菌子实体的品质及应用价值。

Description

一种桦褐孔菌的代料栽培培养基、代料栽培方法及应用

技术领域

本发明涉及真菌栽培技术领域，尤其涉及一种桦褐孔菌的代料栽培培养基和代料栽培方法。

背景技术

桦褐孔菌(Inonotus obliquus(Fr.)Pilat)为多孔菌科褐卧孔菌属药用真菌，子实体呈瘤状，一般生于桦树上，可引起树木的白腐病。桦褐孔菌属于纯中药，是21世纪的保健功能性食品，长期的动物实验及临床实验表明使用桦褐孔菌无任何毒副作用。桦褐孔菌的药效已被证明具有治疗各种癌症(胃癌、肝癌、肠癌、各种消化器官的癌症)、心脏病、糖尿病，同时还可用来防治艾滋病，具有抗衰老和有效抑制传染性病毒的作用。

野生桦褐孔菌价格昂贵，且子实体野生资源有限，很难满足人们的需求。目前，桦褐孔菌人工栽培技术由于受现阶段菌株出实困难、栽培原料受限(仅可使用桦木屑作为代用料)和配方不适宜的制约，人工栽培产量偏低，不能满足目前保健和药用需求。

发明内容

本发明的目的在于提供一株桦褐孔菌及其代料栽培培养基和代料栽培方法，该桦褐孔菌可采用的栽培原料广泛，人工栽培产量高。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种桦褐孔菌的代料栽培培养基，包括干料、水和茉莉酸甲酯母液；

所述干料和水的质量比为35～45：55～65；所述干料包括以下质量份的原料：杂木屑45～50份、玉米芯38～42份、麦麸8～12份、豆粉1～4份、白糖0.5～2份和石膏0.5～2份；

所述代料栽培培养基中茉莉酸甲酯母液的添加量为8～12mL/750g；所述茉莉酸甲酯母液中茉莉酸甲酯的浓度为0.9～3.7μmoL/L；

所述桦褐孔菌包括桦褐孔菌Inonotus obliquus 1号；所述桦褐孔菌 Inonotusobliquus 1号的保藏编号为CGMCCNo.10297。

优选的，所述干料和水的质量比为40：60；所述干料包括以下质量份的原料：杂木屑46份、玉米芯40份、麦麸10份、豆粉2份、白糖1份和石膏1份。

优选的，所述杂木屑选自榆树、柞树、椴树、柳树、枫树、檀树、栎树和色木的木屑中的至少两种。

本发明还提供了上述方案所述代料栽培培养基进行桦褐孔菌的代料栽培方法，包括以下步骤：

1)将桦褐孔菌接种于所述代料栽培培养基，于20～28℃的条件下进行栽培种培养，得到栽培种；

2)将所述栽培种置于散射光、20～28℃、湿度为50％～60％的条件下进行出菇培养，至桦褐孔菌出核，得到桦褐孔菌子实体；所述出核过程中早 7:00～9:00、晚16:00～18:00各通风一次，每次通风的时间为12～18min。

优选的，步骤1)中所述桦褐孔菌的接种量占代料栽培培养基的质量百分比为3％～6％。

优选的，步骤1)中所述培养的时间以代料栽培培养基长满桦褐孔菌为准。

优选的，步骤1)中所述代料栽培培养基盛装于聚乙烯折角袋中，所述代料栽培培养基盛装的高度占聚乙烯折角袋长度的1/2。

优选的，步骤1)中在将所述桦褐孔菌接种于代料栽培培养基后，还包括对聚乙烯折角袋进行扎口，扎口后留有的菌袋空隙的高度为0.5～1.5cm。

本发明还提供了上述方案所述代料栽培培养基在提高桦褐孔菌子实体的三萜含量中的应用。

本发明的有益效果：本发明提供了一种桦褐孔菌的代料栽培培养基，包括杂木屑、玉米芯、麦麸、豆粉、白糖、石膏、水和茉莉酸甲酯母液；其中茉莉酸甲酯母液能够有效提高桦褐孔菌子实体的三萜含量，尤其能够有效提高桦褐孔菌Inonotus obliquus 1号(保藏编号为CGMCC No.10297)子实体的三萜含量，进而能够提高桦褐孔菌子实体的品质及应用价值。

附图说明

图1为实施例1中不同菌株在杂木屑培养基栽培出核比较结果图；

图2为实施例2中不同菌袋空隙的高度对应的桦褐孔菌子实体产量的比较结果图；

图3为实施例3中不同代料栽培培养基栽培桦褐孔菌菌袋仰视图；

图4为实施例3中不同代料栽培培养基栽培桦褐孔菌菌袋正面图；

图5为实施例4中在黑龙江省伊春市伊春区栽培桦褐孔菌1号的应用证明；

图6为实施例4中在牡丹江东宁县东宁镇栽培桦褐孔菌1号的应用证明；

图7为实施例4中在尚志市珍珠乡栽培桦褐孔菌1号的应用证明；

图8为实施例4中在龙江县栽培桦褐孔菌1号的应用证明；

图9为实施例4中不同地区桦褐孔菌1号扩大培养种植实例图；

图10为实施例5中不同菌株MeJA菌丝长势图；

图11为实施例5中不同品种诱导栽培出核结果图；

图12为实施例6中与大连医科大学合作完成“桦褐孔菌对抗肿瘤及抗炎症生物活性研究”的合同书照片；

图13为茉莉酸甲酯不同添加剂量菌丝长势情况；

图14为MeJA不同添加剂量出核情况。

生物保藏说明

桦褐孔菌(Inonotus obliquus 1号)，于2014年12月25日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路 1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCC No.10297。

具体实施方式

本发明提供了一种桦褐孔菌的代料栽培培养基，包括干料、水和茉莉酸甲酯母液；所述干料和水的质量比为35～45：55～65，优选为40：60；所述干料包括以下质量份的原料：杂木屑45～50份、玉米芯38～42份、麦麸8～12 份、豆粉1～4份、白糖0.5～2份和石膏0.5～2份；优选的，所述干料包括以下质量份的原料：杂木屑46份、玉米芯40份、麦麸10份、豆粉2份、白糖1份和石膏1份；所述代料栽培培养基的pH优选为自然pH，更优选为 6.5～7；所述代料栽培培养基的粒径优选为0.5～8mm，更优选为1～5mm，以保证培养料内部通气良好，上下出菌核一致性好；所述代料栽培培养基的含水量≤20％，这一含水量不易感染杂菌；所述代料栽培培养基优选的还包括茉莉酸甲酯母液；所述代料栽培培养基中茉莉酸甲酯母液的添加量优选为 8～12mL/750g，更优选为10mL/750g；所述茉莉酸甲酯母液中茉莉酸甲酯的浓度优选为0.9～3.7μmoL/L，更优选为0.92～3.69μmoL/L，最优选为1.85 μmoL/L；所述茉莉酸甲酯母液的作用是提高桦褐孔菌子实体的三萜含量。

本发明中，所述桦褐孔菌优选的包括桦褐孔菌Inonotus obliquus 1号；所述桦褐孔菌Inonotus obliquus 1号的保藏编号为CGMCC No.10297；所述桦褐孔菌1号的菌核为圆形或长椭圆型，子实体坚实、呈褐色；所述桦褐孔菌1号是由桦褐孔菌野生子实体分离纯化得到的纯培养物，子实体采自吉林省桦甸市二道甸子镇，根据《真菌鉴定手册》和《中国真菌志》判定为褐卧孔菌属(Poria hypobrunneaPetch)。

本发明中，所述杂木屑优选的选自榆树、柞树、椴树、柳树、枫树、檀树和栎树和色木的木屑中的至少两种；所述杂木屑的粒径优选为0.5～8.0mm，更优选为1～5mm，最优选为3mm；所述杂木屑为广泛易得的原料，能够满足规模化栽培要求。

本发明中，本发明所述代料栽培培养基优选的采用以下方法制备得到：将所述杂木屑、玉米芯、麦麸、豆粉、白糖和石膏和水混合，得到代料栽培培养基。

本发明还提供了上述方案所述代料栽培培养基进行桦褐孔菌的代料栽培方法，包括以下步骤：

1)将桦褐孔菌接种于所述代料栽培培养基，于20～28℃的条件下进行栽培种培养，得到栽培种；

2)将所述栽培种置于散射光、20～28℃、湿度为50％～60％的条件下进行出菇培养，至桦褐孔菌出核，得到桦褐孔菌子实体；所述出核过程中早 7:00～9:00、晚16:00～18:00各通风一次，每次通风的时间为12～18min。

本发明在将桦褐孔菌接种于上述方案所述代料栽培培养基之前，优选的还包括将桦褐孔菌接种于原种培养基，进行原种培养；所述原种培养一方面能够实现菌种的扩繁；另一方面，菌种由简单的小分子营养原料(母种)向复杂大分子营养原料过度时，进行原种培养也是使其在栽培种培养时，更适应大分子营养原料生长，得到原种；所述原种培养基优选的包括以下重量份的原料：杂木屑75～80份、麦麸18～22份、石膏0.5～2份和白糖0.5～2份，所述原种培养基的含水量优选为55％～65％，更优选为60％；所述原种培养基优选的包括以下重量份的原料：杂木屑78份、麦麸20份、石膏1份和白糖1份。

本发明将所述原种接种于上述方案所述代料栽培培养基，于20～28℃的条件下进行栽培种培养，得到栽培种；所述培桦褐孔菌的接种量占代料栽培培养基的质量百分比优选为3％～6％，更优选为4％～5％；所述培养的时间以代料栽培培养基长满桦褐孔菌为准；所述代料栽培培养基优选的盛装于聚乙烯折角袋中，所述代料栽培培养基盛装的高度占聚乙烯折角袋长度的1/2；所述聚乙烯折角袋的规格优选为16.5×33cm，每个聚乙烯折角袋盛装的代料栽培培养基的质量优选为750g；在将所述桦褐孔菌接种于代料栽培培养基后，本发明还包括对聚乙烯折角袋进行扎口，扎口后留有的菌袋空隙的高度优选为0.5～1.5cm，更优选为1cm，这一高度的设置有利于提高桦褐孔菌子实体产量；本发明对所述接种的方法没有特殊限制，采用本领域常规方法即可。

得到栽培种后，本发明将所述栽培种置于散射光、20～28℃、湿度为 50％～60％的条件下进行出菇培养，至桦褐孔菌出核，得到桦褐孔菌子实体；每次通风的时间优选为15min；所述出菇培养的温度优选为25℃，湿度优选为55％，时间优选为7～10d，pH值优选为自然pH，更优选为6.5～7；所述子实体生长期为30～40天。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1桦褐孔菌的代料栽培方法

1.分别取直径1.5cm的桦褐孔菌1号、桦褐孔菌2号、桦褐孔菌3号、桦褐孔菌4号母种3块接种于原种培养基上，制作原种；原种培养基配方：杂木屑78g，麦麸20g，石膏1g，白糖1g，含水量为60％(质量百分比)。

注：桦褐孔菌2号已在6个桦褐孔菌菌株栽培比较试验(《食用菌》，2010年4期，20-21页)中公开，引自吉林延边州特产研究所；桦褐孔菌3 号已在代料栽培桦褐孔菌比较试验(《食用菌学报》，2010年2期，32-34 页)中公开，由黑龙江省科学院微生物研究所提供；桦褐孔菌4号已在桦褐孔菌发酵产物的抑菌活性(《东北林业大学学报》，2012年11期，123-126页)中公开。

2.选用规格为16.5cm×33cm聚乙烯折角袋，每袋装入杂木屑-玉米芯培养基750g(湿重)，接入原种30g制作栽培种，对聚乙烯折角袋进行扎口；各级菌种均按常规灭菌、接种，并于25℃下恒温培养至满袋；杂木屑-玉米芯培养基是按质量百分比将46％杂木屑柞树、榆树、杨树、椴树和色木，占比 2:2:2:1:1、40％玉米芯、10％麦麸、2豆粉、1％白糖、1％石膏混合，然后加水至培养基中水的质量百分含量为60％制成，其pH自然。

3.取长满菌丝的栽培袋直接放于出菇室内，出核条件：①光照：散射光；②酸碱度：自然；③通风：早、晚室内通风各15min；④湿度：50％；⑤温度：25℃。

结果显示：4个菌株在杂木屑培养基栽培出核比较时，1号菌株(专利菌株)栽培均产量达30g/袋。2号出核产量仅为9克/袋，3、4号不出核。详见图1。桦褐孔菌1号在杂木屑-玉米芯培养基中出菌核快，菌丝满袋后 7～10天出核，菌核圆形至长椭圆型，子实体坚实、褐色，子实体生长期30～40 天，生物学效率20％～30％。

实施例2

采用实施例1的方法对桦褐孔菌1号进行栽培，在装料(杂木屑-玉米芯培养基)1/2袋高度，比较聚乙烯折角袋进行扎口(松紧度适中)后留有的菌袋空隙的高度对桦褐孔菌子实体产量的影响，实验组1的菌袋空隙的高度为0，实验组2的菌袋空隙的高度为1cm，实验组3的菌袋空隙的高度为 1cm(同时套袋)。结果参见图2，其中A为实验组1，B为实验组2，C为实验组3。结果显示，实验组2中，聚乙烯折角袋进行扎口后，其上部留有 1cm高度菌袋空隙时出核产量最高，其栽培均产量达20g/袋以上。

实施例3不同代料栽培培养基用于桦褐孔菌的代料栽培

1、培养基配方(质量百分含量)

H1.杂木屑86％，麦麸10％，豆粉2％。

H2.杂木屑26％，玉米芯60％，麦麸10％，豆粉2％。

H3.杂木屑46％，玉米芯40％，麦麸10％，豆粉2％。

H4.杂木屑66％，玉米芯20％，麦麸10％，豆粉2％。

H5.桦木屑46％，玉米芯40％，麦麸10％，豆粉2％。

H6.桦木屑66％，玉米芯20％，麦麸10％，豆粉2％。

H7.桦木屑86％，麦麸10％，豆粉2％。(传统配方)

以上杂木屑由柞树、榆树、杨树、椴树和色木组成，柞树、榆树、杨树、椴树和色木的质量比为2：2：2：1：1；

以上配方白糖1％，石膏1％，水分60％，pH自然。

2、菌株接种

菌株为桦褐孔菌1号，菌株栽培方法参见实施例3。栽培结果参见表1、图6和图7。

表1 不同代料栽培培养基栽培桦褐孔菌出菌核比较

由表1、图3和图4可知，处理3中桦褐孔菌产量最高，达30g/袋。

实施例4扩大培养

采用实施例1的方法对桦褐孔菌1号在黑龙江省的伊春、尚志、东宁、龙江县等地种植。

2013年3月至2015年10月，在黑龙江省伊春市伊春区，应用本发明代料栽培方法栽培，桦褐孔菌1号栽培收益8元/袋，成本1.5元，净利润6.5 元/袋。2013年至2015年栽培量分别为16万袋、18万袋和20万袋，栽培均产(干重)20g/袋以上，获得很好收益，应用证明参见图5；

2013年3月至2016年7月，在牡丹江东宁县东宁镇应用本发明代料栽培方法，桦褐孔菌1号栽培收益6元/袋，成本2元，净利润4元/袋，2013 年至2015年栽培量分别为10万袋、12万袋和14万袋，栽培均产(干重) 近20g/袋，获得很好收益，应用证明参见图6；

2013年1月至2016年7月，在尚志市珍珠乡应用本发明代料栽培方法，桦褐孔菌1号栽培收益7元/袋，成本2元，净利润5元/袋，2013年至2015 年栽培量分别为12万袋、13万袋和14万袋，应用证明参见图7；

2013年1月至2016年7月，在龙江县应用本发明代料栽培方法也取得很好收益，桦褐孔菌1号栽培收益6元/袋，成本1.5元，净利润4.5元/袋， 2013年至2015年栽培量分别为14万袋、15万袋和16万袋，应用证明参见图8；

各地方种植实例图参见图9。

实施例5茉莉酸甲酯对不同桦褐孔菌子实体中三萜含量的影响

1.茉莉酸甲酯(MeJA)品种诱导培养基

杂木屑(由柞树、榆树、杨树、椴树和色木组成，其中柞树、榆树、杨树、椴树和色木的质量比为2：2：2：1：1)46％，玉米芯40％，麦麸10％，豆粉2％，白糖1％，石膏1％(质量百分含量)，20袋添加200μM的MeJA 母液90mL(0.92μmoL/L)，水份60％，pH自然。

2.制种方法

菌种按常规方法制作。分别取桦褐孔菌1号、桦褐孔菌2号、桦褐孔菌 3号、桦褐孔菌4号、桦褐孔菌5号1号菌株采自吉林省的桦甸，专利菌株。

2号已在6个桦褐孔菌菌株栽培比较试验(《食用菌》，2010年4期， 20-21页)中公开，引自吉林延边州特产研究所；3号已在代料栽培桦褐孔菌比较试验(《食用菌学报》，2010年2期，32-34页)中公开，由黑龙江省科学院微生物研究所提供；4号已在桦褐孔菌发酵产物的抑菌活性(《东北林业大学学报》，2012年11期，123-126页)中公开，5号已在桦褐孔菌菌株遗传多样性的ISSR分析(《食用菌学报》，2012年2期，26-30页) 中公开，桦褐孔菌4号和桦褐孔菌5号均引自东北林业大学。

直径5mm的菌块接种于母种培养基上制作母种。取直径1.5cm²的母种 3块接种于原种培养基上，制作原种。选用规格为17cm×33cm聚乙烯折角袋，每袋装入湿料750g，合干料300g，接入原种制作栽培种。各级菌种均按常规灭菌、接种，并于25℃下恒温培养，编号，记录栽培种在不同培养基上的满袋天数，菌核形成时间，菌核形状，菌核大小，颜色，干湿比和产量等。

3.茉莉酸甲酯(MeJA)诱导不同添加量

按表2量添加茉莉酸甲酯母液，每个处理生产40袋。

表2 茉莉酸甲酯(MeJA)不同添加量

4.出核管理

光照：培养室内散射光。酸碱度：自然。通风：每天早晚定时通风15min。湿度：出核时相对湿度保持在70％，出核温度控制在25℃，不开口层架摆放。

5.结果与分析

1)茉莉酸甲酯(MeJA)诱导品种比较菌丝长势

结果参见表3和图10，结果显示：1号菌丝长速最快，菌丝颜色黄白，较密，产色素多；3号菌丝长速也较快，粗壮洁白、浓密，2、4、5号菌丝纤细、长速慢。

表3 不同菌株添加诱导剂菌丝长势

2)茉莉酸甲酯(MeJA)诱导品种比较出核

结果参见表4和图11。结果显示：1、2、5号现核较早，菌核多、黄色，不规则椭圆形，1号产量最高为22.63g/袋，其次是5号。3、4号菌核形成较晚，数量少，产量低。

表4 不同菌株诱导栽培出核

3)野生子实体、人工栽培子实体和MeJA诱导栽培子实体三萜含量比较

野生子实体购自吉林省桦甸，人工栽培子实体和MeJA诱导栽培子实体采用的菌株均为桦褐孔菌1号；

人工栽培子实体的培养基配方如下：

杂木屑(由柞树、榆树、杨树、椴树和色木组成，其中柞树、榆树、杨树、椴树和色木的质量比为2：2：2：1：1)46％，玉米芯40％，麦麸10％，豆粉2％，白糖1％，石膏1％(质量百分含量)，水份60％，pH自然。

MeJA诱导栽培子实体培养基配方如下：

杂木屑(由柞树、榆树、杨树、椴树和色木组成，其中柞树、榆树、杨树、椴树和色木的质量比为2：2：2：1：1)46％，玉米芯40％，麦麸10％，豆粉2％，白糖1％，石膏1％(质量百分含量)，20袋添加200μM的MeJA 母液90mL(0.92μmoL/L)，水份60％，pH自然。

人工栽培子实体和MeJA诱导栽培子实体的栽培方法同实施例1。

分别提取野生子实体、人工栽培子实体和MeJA诱导栽培子实体中的三萜。

三萜提取方法如下：待测样品80℃烘干至恒重、粉碎，过100目筛得子实体粉。准确称取1.000g子实体粉于100mL烧杯中，加入30mL的异丙醇，在功率400W条件下超声处理15min后，于80℃水浴下浸提2h，将处理后的料液在5000rpm离心10min，取出上清液记录体积数，香草醛-冰醋酸法测定三萜含量。

结果参见表5，表5结果显示：不同来源子实体三萜得率差异明显，野生子实体三萜含量最低，为57.34mg/g，人工栽培菌核三萜含量较野生子实体三萜含量提高11.1％。人工诱导子实体三萜含量为72.44mg/g，较野生子实体三萜含量提高26.3％，较未诱导人工菌核提高13.7％。

表5 不同来源子实体三萜提取率

实施例6

如下过程与大连医科大学合作完成，合同参见图12。

1.材料与方法

1.1设备与材料

1.1.1主要仪器设备

二氧化碳培养箱超净工作台，可调试移液枪，TGL-16B高速台式离心机，优普超纯水机，超低温冰箱，酶标仪，药典筛(16目筛)，旋转蒸发器RB52A， HH.S数显恒温水浴锅，SHB-III循环水式多用真空泵DHG，鼓风干燥箱，紫外可见分光光度计，FACS Calibur流式细胞仪，Heal Thermo CO₂孵箱，电子天平。

1.1.2材料

细胞系：成瘤实验株H20，购自上海中科院细胞研究所。

肺炎小鼠模型：LPS生理盐水滴入口腔，待液体全部吸入鼻腔，造模成功。

药材：实验用人工栽培菌核三萜提取物(干粉)、野生桦褐孔菌三萜提取物(干粉)，实验提取。

动物：昆明小白鼠。

1.1.3药品和试剂

生理盐水，CORM-2，M199培养基，小牛血清，青霉素，链霉素，0.1％胶原酶Ⅰ，0.25％胰蛋白酶溶液，噻唑蓝(MTT)，生理盐水，异丙醇，二甲基亚砜(DMSO)，乙醇，戊巴比妥钠，HE染色剂。

1.2方法

1.2.1桦褐孔菌三萜对小鼠H20实体瘤的抑瘤作用

1.2.1.1动物模型的建立

造模小鼠的成瘤实验株H20细胞购自于南京凯基生物公司，复苏后在 37℃，RPMIl640培养液中培养1～2天，以生理盐水调整细胞浓度为 1×10⁷/mL，取0.2mL注入健康昆明种小鼠腹腔内，观察小数行动，肚子肿大行走困难后，将小鼠颈椎脱臼处死，于75％酒精浸泡1～2min后抽取腹水，用PBS洗涤，吸管充分吹打均匀，1000r/min离心5min，倾出上清，加生理盐水配制成1×10⁷/mL的瘤细胞悬液，移入50mL玻璃瓶内，将玻璃瓶放于冰水槽里冰浴备用。

将144只昆明种小鼠(购于大连医科大学)，雄性，体重18～22g，随机分为8组，每组18只。注射器抽取H20细胞前先将玻璃瓶内瘤细胞悬液水平直线振摇，每只小鼠后背(右腋)皮下接种0.2mL(2×l0⁶个细胞)，18只不接种H20细胞，作为正常对照组小鼠。

1.2.1.2给药

接种后24h开始灌胃给药治疗，1次/d，剂量分别为1组：生理盐水5 mL/kg体重；2组：桦褐孔菌1号200mg/kg；3组：桦褐孔菌1号100mg/k g； 4组：桦褐孔菌1号50mg/k g；5组：桦褐孔菌2号200mg/kg；6组：桦褐孔菌2号100mg/kg；7组：桦褐孔菌2号50mg/kg；8组：阳性对照(皮下注射环磷酰胺25mg/kg)，连续给药9d，第10天每组处死10只小鼠，每组剩下的8只停止给药，观察小鼠死亡时间。

1.2.1.3观察指标

1)一般生活状况

包括小鼠的饮食、活动、毛发、粪便，用药后有无病变及中毒现象，并测定小鼠接种H20实体瘤的初始体重以及处死时的体重，连续称重3次取平均值为该小鼠的体重值。

2)瘤体重量及抑瘤率

处死小鼠时提取小鼠体内肿瘤并称量其重量，计算出各组小鼠的抑瘤率。

抑瘤率(％)＝(生理盐水组平均瘤重-给药组平均瘤重)/生理盐水组平均瘤重x100％

3)小鼠免疫器官脏器指数

处死小鼠时提取其脾脏、胸腺并称重，连续称重3次取平均值作为其重量值计算胸腺指数和脾脏指数。

胸腺指数＝(胸腺重量/小鼠体重)×100％

脾脏指数＝(脾脏重量/小鼠体重)×100％

1.2.1.4对荷瘤小鼠生存时间的影响

停药后观察小鼠死亡时间(生存时间)，计算生命延长率。

生命延长率＝[(治疗组平均生存天数-对照组平均生存天数)/对照组平均生存天数]×100％

1.2.2桦褐孔菌对肺炎小鼠的抗炎作用研究

1.2.2.1肺炎动物模型的建立

使用22mg/mL戊巴比妥钠(用生理盐水稀释)，50μL/只，腹腔注射，10min 后见尾根、后肢、睫毛反射均消失，呼吸缓慢均匀为深度麻醉。

鼻咽滴注：按照167μg/mL配制脂多糖(LPS)生理盐水溶液，小鼠麻醉后，头向下倾斜，将舌头用镊子牵出，用移液枪吸取60μL LPS生理盐水溶液(约10μgLPS/只)，经咽后壁滴入口腔，迅速捏住鼻孔，维持30秒，待液体全部吸入鼻腔，并出现轻微气管罗音即为造模成功。

1.2.2.2给药

将96只昆明种小鼠，雄性，体重18～22g，随机分为8组，每组12只。灌胃给与桦褐孔菌，1次/d，剂量分别为1组：不给予LPS的正常对照组小鼠(生理盐水5mL/kg体重)；2组：给予LPS的模型组(生理盐水5mL/kg 体重)；3组：桦褐孔菌1号200mg/kg；4组：桦褐孔菌1号100mg/kg；5 组：桦褐孔菌1号50mg/k g；6组：桦褐孔菌2号200mg/kg；7组：桦褐孔菌2号100mg/kg；8组：桦褐孔菌2号50mg/kg。按照上述造模方法，在末次给药1h后吸入LPS后24h摘眼球取血，离心得到血清，测定血清中炎症因子TNF-α，IL-6和IL-10的含量以及超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)、过氧化氢酶(CATALASE，CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione Peroxidase，GSH-Px)的活性。

1.2.2.3观察指标

1)小鼠血清中炎症因子的检测

采用酶联免疫吸附法(ELISA)法，摘眼球取血1mL，4℃静置1h后， 3500r/min离心10min，取上层血清，采用生物素双抗体夹心ELISA测定小鼠血清中TNF-α，IL-6和IL-10水平。严格按照试剂盒说明书操作。

2)小鼠血清中抗氧化酶活性测定

采用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性；采用改良比色法测定CAT活性；采用二硫代双硝基苯甲酸(DTNB)直接显色法测定GSH-Px活性，严格按照试剂盒说明书操作。

1.2.3统计分析

数据用

表示，应用SPSS 17.0软件进行统计分析，组间两两比较及各组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2.结果

2.1对小鼠H20实体瘤的抑瘤作用小鼠一般状况

模型组从第3天开始在注射部位触及稍突起于皮面较小的质地较软肿块，荷瘤小鼠造模成功率为100％。皮下肿块生长迅速，早期荷瘤小鼠反应灵活，皮毛光滑，进食、进水正常；实验过程中随着肿瘤的增长，部分荷瘤小鼠出现进食饮水量减少，行动迟缓，状态欠佳。皮毛失去光泽。至后期部分荷瘤小鼠因肿瘤过大出现身体消瘦，皮毛稀疏，疲乏无力。从第11天开始，各组开始出现荷瘤小鼠死亡，模型组小鼠最早开始出现死亡。处死时，各组初始重量与处死重量均无统计学意义(P>0.05)，环磷酰胺组的小鼠体重略有降低，结果见表6。

表6 各组小鼠初始重量、处死重量(x±S，g)

2.2桦褐孔菌对荷瘤小鼠肿瘤生长状况的影响

桦褐孔菌低、中、高剂量组均能抑制荷瘤小鼠肿瘤生长，桦褐孔菌1号低、中、高剂量组的抑瘤率分别为29.37％，38.89％和42.86％，其中高剂量桦褐孔菌1号的抑瘤率最大；环磷酰胺组抑瘤率为70.24％，与模型组比较，有统计学意义，桦褐孔菌2号低、中、高剂量组的抑瘤率分别为19.84％， 21.03％和23.81％，桦褐孔菌1号比桦褐孔菌2号的抑瘤率高，比单独环磷酰胺组的抑瘤率低，结果见表7。

表7 桦褐孔菌对荷瘤小鼠肿瘤生长状况的影响

2.3桦褐孔菌对荷瘤小鼠免疫器官脏器指数的影响：

脾脏指数：表8中可以看到，与模型组比较，环磷酰胺组的脾器指数下降显著(P<0.05)，有统计学意义。与模型组比较，桦褐孔菌1号低、中、高剂量组小鼠脾脏指数均高于模型组，并且中、高剂量组的升高有统计学意义 (P<0.05)；桦褐孔菌2号低、中、高剂量组小鼠脾脏指数也均高于模型组，但无统计学意义(P>0.05)。

胸腺指数：与模型组比，环磷酰胺组的胸腺指数下降，有统计学意义 (P<0.05)；与模型组比较，桦褐孔菌1号和桦褐孔菌2号低、中、高剂量组小鼠胸腺指数均升高，其中桦褐孔菌1号中、高剂量组小鼠脾脏指数有统计学意义(P<0.05)。

表8 各组小鼠胸腺重量、脾重量比较

注：与模型组比较，aP<0.05；

2.4.桦褐孔菌对荷瘤小鼠平均生存时间和生命延长率的影响

与模型组比，桦褐孔菌低、中、高剂量组和环磷酰胺组小鼠平均生存时间均长于模型组，其中环磷酰胺组的平均生存时间最长，其次为桦褐孔菌 1号高剂量组，结果见表9。

表9桦褐孔菌对荷瘤小鼠平均生存时间和生命延长率的影响

2.5桦褐孔菌对肺炎小鼠血清中炎症因子TNF-α、IL-6和IL-10水平的影响

如表10所示，与对照组相比，LPS模型组血清中TNF-α、IL-6和IL-10 水平均显著升高(P<0.05)；与LPS模型组相比，桦褐孔菌1号和2号各剂量处理组TNF-α、IL-6和IL-10水平均降低，其中桦褐孔菌1号高剂量处理组小鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-10水平的下降具有显著性(P<0.05)。

表10 各组小鼠TNF-α、IL-6和IL-10含量(

ng/L)

注：与对照组比较，aP<0.05；与LPS模型组比较，bP<0.05

2.6.桦褐孔菌对肺炎小鼠血清中SOD、CAT、GSH-Px酶活性的影响

如表11所示，与对照组相比，LPS模型组血清中SOD、CAT、GSH-Px 酶活性均显著降低(P<0.05)；与LPS模型组相比，桦褐孔菌1号和2号各剂量处理组小鼠血清中SOD、CAT、GSH-Px酶活性均升高，其中桦褐孔菌1 号高剂量处理组小鼠血清中SOD、CAT、GSH-Px酶活性的升高均有显著性 (P<0.05)，表明桦褐孔菌具有提高小鼠抗氧化能力的作用。

表11 桦褐孔菌对肺炎小鼠血清中SOD、CAT、GSH-Px酶活性的影响(

U/mL)

注：与对照组比较，aP<0.05；与LPS模型组比较，bP<0.05；

3.结论

3.1桦褐孔菌三萜对H20荷瘤小鼠的抑瘤作用

桦褐孔菌1号和2号对H20荷瘤小鼠均有一定的抑瘤作用，桦褐孔菌1 号的抑瘤效果大于2号，其机制可能在于对免疫功能的调节。

3.2桦褐孔菌三萜对LPS引起的小鼠炎症反应的抗炎症作用

桦褐孔菌对LPS引起的小鼠炎症反应具有一定的抗炎症作用，其对炎症反应的调节可能与清除体内自由基、提高机体抗氧化能力，消除氧化应激有关系。

以成瘤H20株进行的抗肿瘤效果及肺炎小鼠的抗炎作用进行研究，观察桦褐孔菌三萜的抗肿瘤及抗炎药效，通过小鼠一般生活状况、瘤体重量及抑瘤率、小鼠免疫器官脏器指数、荷瘤小鼠生存时间，研究桦褐孔菌三萜抗肿瘤活性，以皮下注射环磷酰胺为阳性对照，观察其抑瘤效果；通过小鼠血清中抗氧化酶活性、小鼠血清中炎症因子的检测，测定小鼠血清中TNF-α，IL-6 和IL-10水平及SOD活性，结果显示：桦褐孔菌1号和2号对H20荷瘤小鼠均有一定的抑瘤作用，桦褐孔菌1号的抑瘤效果大于2号；对LPS引起的小鼠炎症反应具有一定的抗炎症作用，其对炎症反应的调节可能与清除体内自由基、提高机体抗氧化能力，消除氧化应激有关系。

实施例7

杂木屑(由柞树、榆树、杨树、椴树和色木组成，其中柞树、榆树、杨树、椴树和色木的质量比为2：2：2：1：1)46％，玉米芯40％，麦麸10％，豆粉2％，白糖1％，石膏1％(质量百分含量)，20袋添加200μM的MeJA 母液90mL(0.92μmoL/L)；

取桦褐孔菌1号，直径5mm的菌块接种于母种培养基上制作母种。取直径1.5cm²的母种3块接种于原种培养基上，制作原种。选用规格为 17cm×33cm聚乙烯折角袋，每袋装入湿料750g，合干料300g，接入原种制作栽培种。各级菌种均按常规灭菌、接种，并于25℃下恒温培养。记录栽培种在培养基上的生长情况。结果参见表12、图13、图14。

光照：培养室内散射光。酸碱度：自然。通风：每天早晚定时通风15min。湿度：出核时相对湿度保持在70％～80％，出核温度控制在20～25℃间，不开口层架摆放。得到子实体后，检测子实体中三萜含量。结果参见表13。

实施例8

除MeJA母液中MeJA浓度为1.85μmoL/L外，其余与实施例7相同。

实施例9

除MeJA母液中MeJA浓度为3.69μmoL/L外，其余与实施例7相同。

对比例1

除不添加MeJA母液外，其余与实施例7相同。

对比例2

除MeJA母液中MeJA浓度为0.03μmoL/L外，其余与实施例7相同。

对比例3

除MeJA母液中MeJA浓度为0.15μmoL/L外，其余与实施例7相同。

对比例4

除MeJA母液中MeJA浓度为0.31μmoL/L外，其余与实施例7相同。

对比例5

除MeJA母液中MeJA浓度为0.46μmoL/L外，其余与实施例7相同。

对比例6

除MeJA母液中MeJA浓度为0.62μmoL/L外，其余与实施例7相同。

对比例7

除MeJA母液中MeJA浓度为7.38μmoL/L外，其余与实施例7相同。

表12 实施例7～9以及对比例1～7中MeJA不同添加剂量出实情况

实施例7～9以及对比例1～7的结果显示：实施例7～9以及对比例7相比于其他处理产生的色素较多、颜色较深(参见图13)；对比例2～5出核晚，菌核大，圆球形，出核数量少，颜色褐色，产量较低，与对比例1相比差异不明显；对比例6、实施例7～9以及对比例7号出核早，菌核数量多，不规则椭圆型，颜色褐黄色，产量较高(参见图14)；实施例9产量最高，达 23.5g/袋(参见表12)。

表13 茉莉酸甲酯不同添加剂量诱导三萜提取率

由表13可以看出，茉莉酸甲酯添加剂量对三萜得率的影响较大，实施例8(茉莉酸甲酯添加剂量1.85μmol/L)的诱导效果最佳，三萜含量达 72.44mg/g，其次是实施例7(茉莉酸甲酯添加剂量0.92μmol/L)，三萜含量达70.22mg/g，实施例9和对比例7诱导，三萜生成受抑制，对比例2～5对三萜诱导无效果。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种桦褐孔菌的代料栽培培养基，包括干料、水和茉莉酸甲酯母液；

所述干料和水的质量比为35～45：55～65；所述干料包括以下质量份的原料：杂木屑45～50份、玉米芯38～42份、麦麸8～12份、豆粉1～4份、白糖0.5～2份和石膏0.5～2份；

所述代料栽培培养基中茉莉酸甲酯母液的添加量为8～12mL/750g；所述茉莉酸甲酯母液中茉莉酸甲酯的浓度为0.9～3.7μmoL/L；

所述桦褐孔菌包括桦褐孔菌Inonotus obliquus 1号；所述桦褐孔菌Inonotusobliquus 1号的保藏编号为CGMCC No.10297。

2.根据权利要求1所述的代料栽培培养基，其特征在于，所述干料和水的质量比为40：60；所述干料包括以下质量份的原料：杂木屑46份、玉米芯40份、麦麸10份、豆粉2份、白糖1份和石膏1份。

3.根据权利要求1所述的代料栽培培养基，其特征在于，所述杂木屑选自榆树、柞树、椴树、柳树、枫树、檀树、栎树和色木的木屑中的至少两种。

4.利用权利要求1～3任意一项所述代料栽培培养基进行桦褐孔菌的代料栽培方法，包括以下步骤：

1)将桦褐孔菌接种于所述代料栽培培养基，于20～28℃的条件下进行栽培种培养，得到栽培种；

2)将所述栽培种置于散射光、20～28℃、湿度为50％～60％的条件下进行出菇培养，至桦褐孔菌出核，得到桦褐孔菌子实体；所述出核过程中早7:00～9:00、晚16:00～18:00各通风一次，每次通风的时间为12～18min。

5.根据权利要求4所述的栽培方法，其特征在于，步骤1)中所述桦褐孔菌的接种量占代料栽培培养基的质量百分比为3％～6％。

6.根据权利要求4所述的代料栽培方法，其特征在于，步骤1)中所述培养的时间以代料栽培培养基长满桦褐孔菌为准。

7.根据权利要求4所述的代料栽培方法，其特征在于，步骤1)中所述代料栽培培养基盛装于聚乙烯折角袋中，所述代料栽培培养基盛装的高度占聚乙烯折角袋长度的1/2。

8.根据权利要求7所述的代料栽培方法，其特征在于，步骤1)中在将所述桦褐孔菌接种于代料栽培培养基后，还包括对聚乙烯折角袋进行扎口，扎口后留有的菌袋空隙的高度为0.5～1.5cm。

9.权利要求1～3任意一项所述代料栽培培养基在提高桦褐孔菌子实体的三萜含量中的应用。

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