CN103477871A

CN103477871A - 一种蛹虫草的培育方法及其应用

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Publication number: CN103477871A
Application number: CN201310456846.1A
Authority: CN
Inventors: 陈剑清; 舒特俊
Original assignee: Zhejiang Sci Tech University ZSTU
Current assignee: Hangzhou Tuoquetang Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2013-09-29
Filing date: 2013-09-29
Publication date: 2014-01-01
Anticipated expiration: 2033-09-29
Also published as: CN103477871B

Abstract

本发明提供一种蛹虫草的培育方法，它包括以下步骤：干蚕蛹粉20g/L、大米粉180g/L、磷酸二氢钾1.2g/L、磷酸二氢钠1g/L、余量为水配制培养基，密封、灭菌、冷却；接种蛹虫草菌种，菌种密度为3～5个菌球/mL，培养基与菌种体积比为50:1；培养，包括暗培养、光培养；收获子实体。使用该方法培育得到的蛹虫草制成药物，以接种有lewiss肺癌的C57小鼠为实验对象，按药物中蛹虫草给药剂量为5g/kg的标准进行给药，每日给药1次，连续10天后，检测得lewis肺癌肿瘤的抑制率为19.6%。

Description

一种蛹虫草的培育方法及其应用

技术领域

本发明涉及蛹虫草培育技术领域，具体涉及一种蛹虫草的培育方法，以及使用该方法培育得到的蛹虫草在制备治疗肺癌的药物中的应用。

背景技术

蛹虫草（Cordyceps militaris），又名北虫草，隶属于真菌界的子囊菌亚门、麦角菌科、虫草属。它是一种药用真菌。蛹虫草中含有糖、脂肪和蛋白质，此外，还含有多种氨基酸、微量元素和维生素。蛹虫草中的多种生理活性成分具有抗肿瘤、抗菌、抗氧化、保护肝脏、增强免疫力等药理作用。而其与肿瘤相关的活性物质包括虫草素、多糖、虫草酸、甾醇类、硒、类胡萝卜素、蛋白质等。

然而，目前市面上出售的蛹虫草大多只追求虫草素的含量，导致其抗肿瘤的效果不是很明显，达不到人们的期望。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种蛹虫草的培育方法，将该方法培育出的蛹虫草应用在制备治疗肺癌的药物中，其抗肺癌效果显著。

本发明所采用的技术方案为：

一种蛹虫草的培育方法，包括以下步骤：

（1）蛹虫草培养基的配制：以纯净水将KH₂PO₄、NaH₂PO₄溶解、并充分混匀后再加入干蚕蛹粉、大米粉混合均匀，然后装入培养瓶，密封、灭菌、冷却，其中各组分的含量为：

（2）接种：在步骤（1）所得的蛹虫草培养基中接种蛹虫草菌种，所述蛹虫草菌种为Cordyceps militaris(L.)Link.、液体菌种，所述蛹虫草菌种的密度为3～5个菌球/mL，所述蛹虫草培养基与蛹虫草菌种的体积比为50:1；

（3）培养：

（a）暗培养：在温度22℃、湿度75～85%条件下避光培养3～5天，至蛹虫草菌丝长满所述蛹虫草培养基表面；

（b）第5～20天采用的光照培养：白天12小时日光灯光照，温度20～22℃、湿度80～85%，光照强度控制在100～150Lx；晚上12小时闭光，温度18～20℃、湿度75～85%；每天通风2次，早晚各一次，每次20～30分钟；

（c）第21～35天采用的光照培养：白天12小时自然光加日光灯光照，温度20～22℃、湿度75%～85%，总光照强度控制在1000～1200Lx；晚上12小时闭光，温度18～20℃、湿度75～85%；每天通风2次，早晚各一次，每次20～30分钟；

本步骤（b）、（c）中培养所用的光源均为散射光，培养过程中定时对培养瓶进行转瓶使光照均匀；

（4）收获及再培养：将经过步骤（3）培养后培养瓶中成熟的蛹虫草子实体取出，剩余部分按照步骤（3）（c）的方法继续培养至子实体成熟。

作为优选，所述步骤（1）中蛹虫草培养基的灭菌条件为121℃，1.1Mpa灭菌30～40min。

本发明以蚕蛹粉为主要原料、大米为辅料配制蛹虫草培养基，并且通过梯度实验最终确定本发明所述的培养基最优配方，然后采用特殊的培养方式：暗培养、然后不同时间段不同的光照培养方式，再加上光源采用散射光，培养过程中定时对培养瓶进行转瓶使光照均匀，即通过从整体上优化培育方案，最终确定本发明所述的蛹虫草的培育方法，严格按照该方法培育得到的蛹虫草子实体经过检测，发现每1g蛹虫草子实体中腺苷含量为15-20mg、虫草素含量为7.5-8mg、多糖含量为25-33mg，明显高于采用现有技术方法所培育得到的蛹虫草。

本发明上述方法得到的蛹虫草在制备治疗肺癌的药物中的应用，即利用本发明方法培育所得的蛹虫草进行制备治疗肺癌的药物，然后进行抗肿瘤试验，结果发现本发明方法培育所得的蛹虫草制备成的药物其抗肺癌效果显著优于目前市场上市售的蛹虫草制成的药物。以接种有lewiss肺癌的C57小鼠为实验对象，将蛹虫草磨粉后制成药物，按药物中蛹虫草给药剂量为5g/kg的标准进行给药，每日给药1次，连续10天后，检测得lewis肺癌肿瘤的抑制率为19.6%。

附图说明

图1所示的是实施例中各蛹虫草制成的药物对小鼠lewis肿瘤生长抑制作用图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步具体描述，但不局限于此。

本方法以缫丝后的蚕蛹为主要原料，大米为辅料所培养的蛹虫草可收获两季，每瓶每次可获1g干重的蛹虫草。

实施实例中所提及的荷瘤鼠为接种有lewiss肺癌的C57。小鼠C57小鼠为普通级实验动物，雌雄兼用，购自军事医学科学院实验动物中心，实验动物质量合格证编号：SCXK-（军）2007-004。肿瘤瘤源lewis肺癌由本实验室传代保存。环磷酰胺片，铝塑包装，每片含环磷酰胺50mg、人参茎叶总皂苷50mg，天津金世制药有限公司生产，国药准字H12021006。氯化钠注射液（生理盐水），瓶装，500mL/瓶，山东齐都药业有限公司，生产批号1D12052502，国药准字H37020764。

一、蛹虫草培养基的配制

本发明的蛹虫草培养基为水溶液，由如下浓度的成分构成：

具体制备方法如下：

取如下重量的成分：干蚕蛹粉300g，大米粉2.7kg，磷酸二氢钾18g，磷酸二氢钠15g；加纯净水12L先把KH₂PO4、NaH₂PO4先溶解、并充分混匀后再加入干蚕蛹粉、大米粉混合均匀，得到体积为15L的培养基溶液，匀浆，分装入培养瓶，每瓶装50ml，盖好盖子，121℃，1.1Mpa灭菌30～40min，待其自然冷凝后备用。

二、蛹虫草的接种、培养

1、在超净台中接种虫草菌体(菌种为Cordyceps militaris(L)Link)，液体菌种，密度控制在3-5个菌球/mL，每培养瓶1mL。

2、在温度22℃、湿度75～85%条件下避光培养3～5天，使虫草菌丝迅速长满培养基表面，防止其他杂菌在培养基表面生长。

3、第5～20天光照培养，白天12小时日光灯光照，温度20～22℃（最好为22℃）、湿度80～85%，光照强度控制在100～150Lx；晚上12小时闭光，温度18～20℃（最好18℃）、湿度75～85%。每天通风2次，早晚各一次，气温相对低的时候进行每次20～30分钟。白天晚上温差有利于原基的分化形成。

4、第21～35天白天12小时光照（自然光加日光灯），温度20～22℃（最好为22℃）、湿度75%～85%，光照强度控制在1000～1200Lx；晚上12小时闭光，温度18～20℃（最好为18℃）、湿度75～85%。此时间为子实体生长时期，强光对子实体的生长有利，使其呈棒状生长并不断成熟、健壮、色泽变为鲜艳的橙黄色，在此生长阶段每天通风2次，早晚各一次，气温相对低的时候进行每次20～30分钟。

5、收获及再培养，旋开培养瓶盖，镊子用75%酒精消毒后，将子实体取出(只取出培养基上面的部分)，将取出的子实体置于干净的不锈钢盘中，挑选色泽均匀、粗壮、完整的子实体，去除残存的培养基后置于新的不锈钢盘中称重备用；培养瓶中剩余部分按第20～35天的培养条件及方法继续培养，再次收获。

培养中的注意事项：

A、光照时要用散射光，而不能用直射光，虫草的生长有向光性，对光照均匀的地方的瓶子要进行转瓶，使其光照均匀，子实体向上生长。

B、在培养过程中要严格控制温度和湿度，所以要严格控制好温度。在目前车间没控制温度设备的情况下，要用地面洒水来控制培养室的温度，一般一天洒水3次，但也要根据当天的气温情况来变，温度高要多洒，培养室温度超过25℃，要开空调降温。

C、每天培养室要通风换气一到两次，时间选择在早上和傍晚温度相对低的时候，每次20～30分钟。

D、接种后污染的瓶子要及时的拿出，把里面的培养基倒出重新灭菌后重新接种，不能让污染的瓶子放在培养室里培养，而造成整个培养室受杂菌的污染。

三、蛹虫草制成的药物对肺癌的抑制试验

1、肿瘤接种

取接种肿瘤10-13天状态良好的荷瘤鼠脱臼处死，体表酒精消毒，在无菌（超净台）环境下剥离小鼠肿瘤至盛有生理盐水的无菌平皿，剪至小块，将小块肿瘤放入组织匀浆器，按体积比1:3左右加入生理盐水匀浆，匀浆液即肿瘤细胞混悬液倒入50ml无菌离心管，备用。活细胞计数1×107/ml浓度，2ml注射器针头套在1ml注射器上，在C57小鼠腋下i.p.接种0.2ml肿瘤细胞混悬液，肿瘤细胞混悬液的制备均在无菌条件下（超净工作台中）完成。从取出肿瘤至肿瘤接种完毕在60分钟内完成。

2、分组与给药

肿瘤细胞接种后24小时所有实验动物随机分组，依实验要求不同共分为6组，每组动物数量为10～12只不等。实验分组为：①生理盐水对照组（NS组）、②阳性药物（环磷酰胺）对照组、③～⑥分别为市售蛹虫草A制成的药物、市售蛹虫草B制成的药物、市售蛹虫草C制成的药物、本发明方法培育所得蛹虫草Z制成的药物。

3、试剂配置：

取一粒环磷酰胺片，于砚钵中磨成粉末，加入40ml生理盐水混匀，分装，三天配置一次。分别称取市售虫草A、B、C以及本方法培育虫草Z粉末1.5g，各加入4.5ml生理盐水，配制成250mg/ml的溶液制成药物，每天实验前配制。

4、给药方案：

NS组，灌胃相应容积的生理盐水；③～⑦市售蛹虫草A制成的药物、市售蛹虫草B制成的药物、市售蛹虫草C制成的药物、本发明方法培育所得蛹虫草Z制成的药物，分别灌胃给以相应剂量的溶液，给药容积均为0.4mL/20g（活性成分蛹虫草给药剂量为5g/kg）；阳性药物（环磷酰胺）对照组，口服环磷酰胺25mg/kg（0.4mL/20g）；各给药组每日均给药1次，连续10天。自肿瘤接种后24小时开始给药。

5、疗效评价

末次给药后24小时，处死动物，称取体重，解剖并取出肿瘤组织，称取肿瘤重量，以肿瘤生长抑制率来评价药物的体内抗癌效果，计算公式为：肿瘤生长抑制率=（1－给药组平均瘤重/对照组平均瘤重）×100%。

6、数据处理

全部数据均以均值和标准差表示。统计分析，组间比较t检验。结果如表1和图1所示。

表1各蛹虫草制成的药物对小鼠lewis肿瘤生长抑制作用

注：与对照组相比，*P<0.05，**P<0.02。

蛹虫草初步抑瘤实验结果显示，市售蛹虫草A制成的药物、市售蛹虫草B制成的药物、市售蛹虫草C制成的药物、本发明方法培育所得蛹虫草Z制成的药物组小鼠lewis肺癌肿瘤的抑制率分别为：11.8%、-9.8%、-8.6%、19.6%。综合评价，本发明方法培育所得蛹虫草制成的药物对小鼠肺癌（lewis）有抑制活性，其中本发明方法培育所得蛹虫草制成的药物组与生理盐水组相比P值为0.045，差异显著，抑瘤效果为佳，作用肯定。

本发明的上述实施例是对本发明的说明而不能用于限制本发明，与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。

Claims

1.一种蛹虫草的培育方法，其特征在于包括以下步骤：

（3）培养：

本步骤（b）、（c）中培养所用的光源均为散射光，培养过程中对培养瓶进行转瓶使光照均匀；

2.根据权利要求1所述的一种蛹虫草的培育方法，其特征在于：所述步骤（1）中蛹虫草培养基的灭菌条件为121℃，1.1Mpa灭菌30～40min。

3.权利要求1所述的一种蛹虫草的培育方法培育所得的蛹虫草在制备治疗肺癌的药物中的应用，其特征在于：以接种有lewiss肺癌的C57小鼠为实验对象，将蛹虫草磨粉、制成药物，按药物中蛹虫草给药剂量为5g/kg的标准进行给药，每日给药1次，连续10天后，检测得lewis肺癌肿瘤的抑制率为19.6%。