CN104871827B - 一种人工培育的冬虫夏草及其培育方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种人工培育冬虫夏草的方法，包括：液体培养基的配置及灭菌，接种，液体菌种的培养，固体培养基的选择、制备和灭菌，接菌，黑暗发菌，光照发菌，烘干，封装保存。本发明还提供一种采用上述方法培养的冬虫夏草。该方法生产的冬虫夏草去除了虫草长草的阶段，使得其营养价值和药用价值聚集在虫体内不随长草而流失，并且全程无菌操作，免除喷洒农药造成农药残留超标的风险。

Description

一种人工培育的冬虫夏草及其培育方法

技术领域

本发明涉及中药领域，尤其涉及冬虫夏草的培育，特别地关系到一种人工培育的冬虫夏草及其培育方法。

背景技术

冬虫夏草又称虫草、冬虫草等，是麦角菌科虫草属真菌(虫草菌)Cordycepssinensis(Berk)Sacc.与鳞翅目蝙蝠蛾科蝙蝠蛾幼虫在特殊条件下形成的菌虫结合体，是传统的名贵药材，主要产于在我国的四川、青海、西藏、云南和甘肃等地。冬虫夏草的营养成分高于人参，可入药，也可食用，是上乘的佳肴，具有很高的营养价值。冬虫夏草可以增强机体的免疫力，滋补肺肾，对肺癌、肝癌等有明显的抑制作用。在临床上对肺虚久咳，气喘，肺结核咯血，盗汗，肾虚腰膝酸痛，阳痿遗精，神经衰弱及化疗、放疗后的红细胞下降都有疗效。

经过严格检测和动物试验、临床实验，冬虫夏草具有下列药理或保健功能：

一是具有明显的安神镇静作用。注射虫草抽提液后的动物，活动很快减少，能延长戊巴比妥睡眠时间，增加阀下量巴比妥入睡率。表明服用虫草能提高人的安睡效率，延长睡眠时间，适合失眠多梦者长期服用。

二是抗炎作用。对小鼠耳片、对大鼠足跖致炎研究表明，虫草在治疗肾炎、前列腺炎等方面具有独特的功效。而且，一些传统医学文献中有记载，虫草对于抑制肝脏纤维化进程有“全能”效果。

三是耐缺氧作用。研究表明，腹腔注射2.5g/kg以上的冬虫夏草的抽提物可明显降低小鼠心肌耗氧量，对异丙肾上腺素引起的心肌耗氧量的增加及耐缺氧能力下降有突出的改善效果。

上述三种保健功能，不仅是现代科学实验的结论，也是人们使用后感觉得到的反应。因此消费者都公认虫草具有护心养脑、强肾固本、改善血液循环、抗疲提神、改善亚健康状况等作用。

抗肿瘤作用是冬虫夏草新发现的功能。体外实验研究表明，不加虫草的肿瘤细胞培养至第六天，B16细胞、K526细胞、HL260细胞分别增长75、68、58倍，而虫草组在不影响造血细胞生长的情况下，培养第六天，肿瘤细胞保持在原来接种时的水平，增殖完全停止。可见，虫草确实具有阻抗肿瘤、抑制病毒作用，对晚期肝癌患者的肿瘤细胞复制、扩散犹有较好的延缓影响。与其他滋补品的“热补路线”不同，虫草具有“温补”的特性，适合于任何年龄、体质层次的人，尚未发现任何副作用。

但是，随着冬虫夏草的药用价值不断地被人们所发现，虫草资源的产业化应用量和优质虫草的市场需求量急剧膨胀，滥采滥挖，使得野生虫草资源日益匮乏。

因此，很多人在努力以人工方式培养冬虫夏草，以期能产业化。但是，野生冬虫夏草来自青藏高原，垂直分布于3000～5100m高海拔地区的高山草甸和灌木丛中，生态环境比较复杂，其分布主要受海拔高度、植被、土壤结构、坡向、小气候、温度、光照、湿度及其它自然和人为因素的影响，生长条件苛刻。

对于人工培育来说，养虫、培菌和育草是人工培养冬虫夏草的必要条件。如在其他地区人工培养，除了这三者外，还必须模拟适宜三者生长发育的环境条件。这在理论上是可行的，但实践中操作难度非常大。目前，仅在实验室中可以模拟高原特有的生态环境，但成本非常高，没有产业化价值。同时，大规模饲养蝙蝠蛾幼虫和培养虫草属菌的技术仍未解决。

野生冬虫夏草中真菌要寄生于蝙蝠蛾幼虫，蝙蝠蛾的一个生活周期在自然状况下需4年以上，而各虫态的变化，龄期的长短，因受虫种、温度、海拔、饲料等因素的决定，所以在时间上存在一定的差异。人工培育蝙蝠蛾幼虫的生产周期长，经试验，感染成活率非常低，无法进行产业应用。因此人们尝试采用其他宿主代替蝙蝠蛾幼虫作为虫草菌的宿主。

此外，由于冬虫夏草人工培育困难，野生资源有限，因此《中国药典》将冬虫夏草同属真菌蛹虫草Cordyceps militaris(L.)Link作为冬虫夏草的替代品。蛹虫草的真菌已经可以实现人工培育，获得子实体。即使是这样，对于蛹虫草的培育也很难获得真正“有虫有草”的产品，市面上出售的所谓蛹虫草产品多为蛹虫草的子座，属于“有草无虫”产品，而非“有虫有草”的真正虫草，并且其有效成分的含量远远低于真正的冬虫夏草。

目前在人工培育冬虫夏草和蛹虫草的子座过程中，由于其“长草”的温度为25-30℃，湿度为70-90％，其高湿度易生虫害，而为了防虫，需要喷洒农药，以致农药残留超标。人若经常服用，又对其身体又产生了新的危害。由于对虫草有需求的人群多为免疫力低下的人群，因此农药残留超标对其身体危害更大。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种人工培育冬虫夏草的方法，该方法省去发草步骤，使得冬虫夏草有效成分保留在虫体体内，而不造成药效流失，并且获得的冬虫夏草的全程均保持无菌环境，无需喷洒农药，无农药残留。

本发明的另一目的是提供一种采用上述方法获得的冬虫夏草，所获得的冬虫夏草经检测有效成分高于野生冬虫夏草。

为了实现上述目的，本发明提供一种人工培育冬虫夏草的方法，包括以下步骤：

1)液体培养基配置

液体培养基按重量计包括：葡萄糖：磷酸二氢钾：硫酸镁：维生素B1：黄豆粉：酵母粉：水＝40：1：0.5：0.5：20：20：1000，自然pH值；

按比例称取葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、维生素B1、黄豆粉、酵母粉和水，混匀，倒入量杯量取体积，然后倒入锅中煮沸5-10分钟，煮沸后沉淀20分钟，把上清液倒入量杯中，加水补足蒸发量，冷却至室温；

2)液体培养基灭菌

将液体培养基倒入三角瓶内，填装量为三角瓶容积的60-70％，装瓶后用棉花或橡胶塞或无菌透气封口膜将瓶口封好进行灭菌，灭菌后静置冷却至室温；

3)接种

在无菌条件下将冬虫夏草菌种接种至灭菌后的液体培养基中，接种量为液体培养基填装量的2-6％；

4)液体菌种培养

将接种后的三角瓶置于摇床，在18-25℃环境下，摇床转速为140转/分，培养6-10天，得到液体菌种；

5)固体培养基选择

选取健康的活体宿主虫体作为固体培养基材料，清水冲洗掉虫体上的灰尘和杂质；

6)固体培养基制备

将宿主虫体放入提前清洗晾干的洁净广口玻璃瓶，装虫量为玻璃瓶容积的50-70％，装瓶后用无菌透气封口膜或专用瓶盖封口，灭菌；

7)接菌

在无菌条件下将步骤4)培养获得的液体菌种装入预先经过灭菌的喷雾器或注射器中，用喷雾器或注射器将液体菌种均匀地喷洒在虫体上，搅拌均匀，封好瓶盖，隔绝空气；

8)黑暗发菌

将接完菌种的玻璃瓶放在无光黑暗培育发菌室培养架上，控制温度为18-20℃，湿度为50-60％，培育发菌30天；

9)光照发菌

用日光灯管或节能灯管给予冷光，光照度为300-400Lx，光照时间30天，控制温度为25-30℃，湿度为80-85％，当虫体培养基菌丝由白色变为暗黄色时，培育发菌完毕；

10)烘干

将培育好的虫体从玻璃瓶内倒出，放在烘干箱内烘干，获得人工培育的冬虫夏草成品；

11)封装保存

使用真空封装机进行封装，封装后放到通风干燥处保存。

更进一步地，所述灭菌采用高压蒸汽灭菌或常压蒸汽灭菌。

更进一步地，所述高压蒸汽灭菌方法为：使用高压灭菌锅，当压力达到49千帕时，打开高压锅放气阀排出冷气，冷气放尽后，关闭放气阀重新升温，待压力达到117千帕时再保持1小时。

更进一步地，所述常压蒸汽灭菌方法为：使用灭菌锅，常压条件下当温度达到100℃时，灭菌保持8小时。

更进一步地，所述宿主虫体为大麦虫、黄粉虫、幼蚕，优选为大麦虫。

更进一步地，所述步骤7)中接菌量为虫体重量的3-10％

更进一步地，所述步骤10)中烘干的温度为50-60℃。

本发明还提供一种人工培育的冬虫夏草，所述冬虫夏草采用上述方法培育而成。

培养中所用三角瓶可根据生产量选择不同容量大小，广口玻璃瓶以便于操作为首要保证，可以为一般广口瓶或虫草/植物专用组培瓶，一般广口瓶可使用无菌透气封口膜封口，组培瓶可使用其配套专用瓶盖(耐高温高压，适当透气)封口。

发菌室培养架层间高度可根据广口玻璃瓶的高度调整，以保证广口玻璃瓶能均匀接受光照为前提。

当生产规模扩大时，可采用发酵罐代替三角瓶进行冬虫夏草菌种的培养，并且采用适宜发酵罐灭菌的方式进行液体培养基灭菌和菌种培养。

本发明所用冬虫夏草菌种购自中国农业微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏编号为ACCC No：50560。

由于冬虫夏草菌种生命力弱，极易退化，复壮过程繁琐，因此发明人使用直接购买自中国农业微生物菌种保藏管理中心的斜面培养菌种经一次扩增后用于培养冬虫夏草。

原始菌种的一次扩增：

将购买的斜面培养菌种(带培养基(固体))一起切成小块按照1:20-30(1管原始菌种接20-30支试管)的量接种到装有80％液体培养基(体积)的18×200规格的试管中，在摇床中在25℃环境下，摇床转速为140转/分，培养10天，得到一代菌种，用于人工培育的冬虫夏草的培养，全部过程均在无菌条件下进行。

本发明的特点在于：

1.菌种来源明确

由于冬虫夏草培育困难，《国家药典》规定可以使用蛹虫草作为冬虫夏草的替代品，因此，很多号称虫草的产品仔细看来实际是蛹虫草。但是二者却有重大差别，冬虫夏草真菌分类名称为Cordyceps sinensis(Berk)Sacc.，蛹虫草真菌分类名称为Cordycepsmilitaris(L.)Link，蛹虫草真菌已经实现人工培育，并且有很多以蛹虫草菌丝体制作的保健药物，其子实体也作为普通商品出售，被称为虫草花。虫草花只是作为一般菜用真菌使用，其药用价值远远低于作为药用真菌的Cordyceps sinensis(Berk)Sacc.。区别是否为真正的冬虫夏草，就是以寄生真菌来区分，本发明所用真菌购自中国农业微生物菌种保藏管理中心，为来源明确且经鉴定的冬虫夏草真菌。

2.使用完整虫体，控制虫体长草

使用冬虫夏草菌丝体发酵获得产品本身没有虫体，也无法长草，处于“无虫无草”状态。使用蛹虫草替代，要么仅仅产生蛹虫草真菌的子实体(虫草花)，呈现“无虫有草”的形态，或利用蚕蛹培养出“有虫有草”的蛹虫草，但是其归根结底不是冬虫夏草，虽然商家在不断宣传其功效不亚于冬虫夏草，但实际并无有效数据支持这一论断。对于野生冬虫夏草来说，其“草”的部分如果断掉，则其经济价值大降低，这是由于其“长草”后有效成分大部分转移到“草”中，为真菌的有性生殖提供能量。因此，实际在虫体内长满菌丝体，即将“长草”形成子实体时，其营养价值和药用价值达到了最高。野生冬虫夏草虫体是埋于地下的，长草是真菌进行有性繁殖的方式，而且只有长草后才会伸出地面，人们才能看到采集，但是其已经不再是营养和药用价值最高的时刻。这一点发明人人也通过检测人工培育的“长草”虫体、“未长草”虫体和“要长草又未长草”虫体中腺苷的含量得到了证实，其中“要长草又未长草”虫体的腺苷含量最高(腺苷是《中国药典》中冬虫夏草唯一的检测标准)。但是人们根据传统观念，在冬虫夏草的培养时还在努力使宿主虫体长草，而错过了其营养价值和药用价值最高的阶段，同时，未有见到使用“要长草又未长草”虫体的报道。

3.全程无菌培养，防止农药残留

由于传统观念中要努力让虫体“长草”(不管是冬虫夏草还是蛹虫草)，模拟自然环境将其放置在土中，并且“长草”环境需要保持70％以上的湿度，造成生虫现象，为了除虫，需要喷洒农药，造成产品的农药残留超标。因此市场上见不到人工培育“有虫有草”的虫草产品，而是菌丝体的加工产品或子实体(实际也都为蛹虫草真菌，冬虫夏草真菌的培育仍然处于实验室阶段)。发明人不让虫体“长草”，也就免除了生虫喷洒农药的问题，全程无菌操作，获得的冬虫夏草虫体无污染，无农药残留。

4.液体培养基配方巧妙

本发明所用液体培养基中包含葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、维生素B1、黄豆粉、酵母粉。在菌丝体生长发育过程中需要碳源、氮源、矿物质营养及生长素。其中葡萄糖为碳源，黄豆粉、酵母粉为氮源，磷酸二氢钾、硫酸镁为矿物营养，维生素B1为生长素。其中各个配比是在实际培养中经过不断摸索形成，在摸索过程中发现，若所含碳源少，氮源多，会造成菌丝徒长，生长过旺，营养和有效成分积累少，若所含碳源多，氮源少，则菌丝细弱，生长缓慢，延长生长时间，也降低菌丝感染效率。通过合理调整碳源和氮源的比例，才能培养出优质菌种，确保产品的质量和产量。

5.宿主虫体选择有技巧

黄粉虫又叫面包虫，在昆虫分类学上隶属于鞘翅目，拟步行虫科，粉甲虫属(拟步行虫属)。原产北美洲，50年代从苏联引进我国饲养，黄粉虫干品含脂肪30％，含蛋白质高达50％以上，此外还含有磷、钾、铁、钠、铝等常量元素和多种微量元素。因干燥的黄粉虫幼虫含蛋白质40％左右、蛹含57％、成虫含60％。黄粉虫可以制成饲料，作为动物的蛋白质来源，也可以作为食物，为人类提供高蛋白。黄粉虫体型小于蝙蝠蛾幼虫，一年四季能养，能满足大批量培育。

大麦虫是近年从东南亚国家引进，是一种拟步甲科种类的幼虫。老熟幼虫最大体长6厘米左右，比一般的黄粉虫大3-4倍，产量是黄粉虫的5倍，营养价值更是远远超出黄粉虫。雌性成虫体形比雄性成虫个体明显偏大。大麦虫可作为优质动物饲料，也由于它含有大量人体所必需的微量元素，也可以作为人类动物性蛋白的来源，成为人们的盘中大餐。大麦虫的体型与蝙蝠蛾幼虫大小差不多，一年四季能养，能满足大批量培育，但由于其引进时间尚短，培养成本相对较高。

幼蚕是蚕蛾的幼虫形态，以桑叶为食，主要用于产丝。幼蚕的蛋白质含量高，与蝙蝠蛾幼虫外形个头一样，并且同为鳞翅目昆虫，与蝙蝠蛾的亲缘关系更近，但其生产具有季节性。

因此，上述宿主虫体选择要根据实际情况，根据时节，因地制宜恰当选择。在桑蚕生产地区及桑蚕生长的季节，幼蚕可作为理想的冬虫夏草真菌宿主虫体。而在非桑蚕生长季节，黄粉虫和大麦虫又更适于作为宿主虫体，黄粉虫培养技术成熟，作为宿主虫体成本更低。大麦虫个头大，作为宿主虫体营养和有效成分含量更高，但其培养成本相对较高一些。

使用野生冬虫夏草的一般人群多为具有基础疾病，身体虚弱，免疫力低下的人士，本发明培育的冬虫夏草参考野生冬虫夏草的使用人群，邀请经上百名中老年志愿者服用，记录其服用后的改善效果，发现具有如下功效：

一、补肾

1.肾阳虚阴虚同补，帮助受损肾脏恢复功能。

2.可治疗高血压患者因长期服用降压药刺激肾造成的尿急、尿频，服用一个月后，小便恢复正常。

3.可治疗老年人因肾功能减退引起的尿频、尿急，不知不觉尿裤子、尿炕，服用一个月后，小便恢复正常。

4.可治疗因肾功能引起的腿肿，腿感无力，站立时脚后跟痛，服用半个月后，腿消肿，双腿感觉有劲，脚后跟消痛。

5.对男性性功能低下，随着年龄增长，性功能降低，服用一个月后性功能恢复明显。

6.可治疗由肾引起的高血压，服用一个月后，降血压效果明显，服用三个月后，停服降压药，血压恢复正常。

二、润肺

消除肺部、支气管垃圾，服用一个月后，咳喘减轻，痰量减少。

三、治疗和防止糖尿病并发症

从根本上杜绝糖尿病并发症的发生，因糖尿病并发症引起的腿肿，服用一个月后，腿消肿。

四、养护心血管，消除血液中的垃圾、养护心肌，改善造血机能和血管弹性、促进血液循环。脸色铁青，心脏感到不适、全身无力的病人，服用一个月后，脸色红润，心脏不适感和全身无力感消失。

五、养护前列腺

因前列腺炎造成的尿频、尿急、小腹疼痛，服用一个月后，小便次数明显减少，小腹疼痛消失。

六、养护女性生殖系统，调整雌激素分泌

对女性痛经，月经不调、血色黑、阴道炎、子宫内膜炎、子宫肌瘤均有较好的疗效。可推迟女性更年期，并改善女性更年期的症状。

七、长期服用，能延缓衰老，不脱发、头发变黑、去除老年斑、保持年轻态。

八、提高人体免疫力

对免疫力低下、经常生病、易感冒的人，服用后能提高人体免疫力、不易感冒，无力感消失。

九、调理失眠

对失眠的人群，服用十五天即有明显效果，入睡容易，睡得足、睡得香。

十、对老年人腰膝酸软、神疲、耳鸣、眼花，服用一个月后均有一定改善。

十一、具有抗癌抗肿瘤的功能，可改善放化疗副作用

癌症患者手术后放化疗时服用可改善呕吐、恶心、胃口差、头发脱落，失眠等症状，长期服用可防止肿瘤复发。

十二、具有消除痔疮的功能，服用三个月后内痔、外痔消失。

十三、可以阻止肝纤维化，调节病毒性肝炎的免疫水平，增强肝炎病毒的清除能力。

上述功效与野生冬虫夏草的功效一致，说明本发明培育的冬虫夏草完全可以替代野生冬虫夏草，保护自然资源，同时具有产业化推广价值。

本发明的有益效果为：

本发明提供一种人工培育冬虫夏草的方法以及该方法获得的冬虫夏草产品，该方法去除了虫草长草的阶段，使得其营养价值和药用价值聚集在虫体内不随长草而流失，并且全程无菌操作，免除喷洒农药造成农药残留超标的风险。培育出的冬虫夏草具有良好地滋补功效，适于患有基础疾病或肿瘤，身体虚弱，免疫力低下的人群服用，也适于工作繁忙，身体处于亚健康的中青年人群服用。

附图说明

图1为大麦虫虫体长满菌丝的状态图。

图2为获得的以大麦虫为宿主虫体的冬虫夏草背面图。

图3为获得的以大麦虫为宿主虫体的冬虫夏草腹面图。

图4为获得的以大麦虫为宿主虫体的冬虫夏草的横剖图。

图5为获得的以大麦虫为宿主虫体的冬虫夏草的纵剖图。

图6为获得的以黄粉虫为宿主虫体的冬虫夏草的侧面和腹面图。

图7为获得的以幼蚕为宿主虫体的冬虫夏草的背面图。

图8为获得的以幼蚕为宿主虫体的冬虫夏草的腹面图。

具体实施方式

本发明所用材料来源如下：

1.菌种

本发明中所用冬虫夏草菌种购自中国农业微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏编号为ACCC No：50560。

2.试剂

所用大麦虫、黄粉虫、幼蚕购买自北京市十里河花鸟鱼虫市场。

葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁购自一般化工商店，使用均为分析纯等级。

维生素B1购自上海鼓臣生物技术有限公司。

黄豆粉为自制，将干黄豆炒熟打粉，过200目筛即得。

酵母粉购自上海宝曼生物科技有限公司。

水为普通自来水。

2.仪器设备

三角瓶购自一般化学仪器商店。

广口玻璃瓶购自徐州大华玻璃制品有限公司，包括一般广口瓶和组培瓶(带配套专用瓶盖)。

无菌透气封口膜购自祥云实验器材商城。

其余仪器设备均为虫草培育常规设备。

3.生产环境

由于冬虫夏草的生长条件严苛，因此对于环境也有相应要求：需要选在水、电供应有保障，地形开阔，远离污染源，周围环境清洁卫生，排水通畅的地方。

厂房要求：

1)通风良好，安装自动定时换气装置。

2)温度10-30℃连续可调，自动调温。

3)湿度30-90％连续可调，自动调湿。

4)房内四壁和顶棚要光滑、无缝隙、无漏洞、地面铺瓷砖，以便于冲刷清洗和消毒灭菌。门窗开关灵活，并能封闭严密，配备紫外消毒设备。

5)设洗瓶室、配料室、灭菌室、接种室、发菌室、烘干室、化验室、成品库。

下面以具体实施例来进一步说明本发明的技术方案。

实施例1

1.液体培养基配置

液体培养基按重量计包括：葡萄糖40克、磷酸二氢钾1克、硫酸镁0.5克、维生素B10.5克、黄豆粉20克、酵母粉20克、水1000克，自然pH值；

按称取葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、维生素B1、黄豆粉、酵母粉和水，混匀，倒入量杯量取体积，然后倒入锅中煮沸10分钟，煮沸后沉淀20分钟，把上清液倒入量杯中，加水补足蒸发量，冷却至室温；

2.液体培养基灭菌

将液体培养基倒入三角瓶内，填装量为三角瓶容积的60％，装瓶后用棉花将瓶口封好进行高压蒸汽灭菌，

灭菌方法：使用高压灭菌锅，当压力达到49千帕时，打开高压灭菌锅放气阀排出冷气，冷气放尽后，关闭放气阀重新升温，待压力达到117千帕时再保持1小时，灭菌后静置冷却至室温；

3.接种

在无菌条件下将冬虫夏草菌种接种至灭菌后的液体培养基中；每瓶中接种冬虫夏草菌种量为填装培养基的5％；

4.液体菌种培养

将接种后的三角瓶置于摇床，在25℃环境下，摇床转速为140转/分，培养6天，得到液体菌种；

5.固体培养基选择

选取健康的活体大麦虫作为固体培养基材料，清水冲洗掉虫体上的灰尘和杂质；

6.固体培养基制备

将大麦虫放入提前清洗晾干的洁净广口玻璃瓶(组培瓶)，装虫量为玻璃瓶容积的60％，装瓶后用专用瓶盖封口，高压蒸汽灭菌，方法同步骤2；

7.接菌

在无菌条件下将步骤4培养获得的液体菌种装入预先灭过菌的注射器中，用注射器器将液体菌种均匀地喷洒在虫体上，搅拌均匀，封好瓶盖，隔绝空气；

8.黑暗发菌

将接完菌种的玻璃瓶放在无光黑暗培育发菌室培养架上，控制温度为18℃，湿度为60％，培育发菌30天；

此步骤黑暗条件是使真菌充分发菌，如图1所示，可见白色菌丝长满玻璃瓶，此时菌丝未向虫体内生长。

9.光照发菌

用日光灯管给予冷光，光照度为400Lx，光照时间30天，控制温度为25℃，湿度为80％，当虫体培养基菌丝由白色变为暗黄色要生长子实体时，培育发菌完毕；

此步骤光照可以促进菌丝向虫体内部生长，当其长满虫体时，准备形成子实体，此时体外菌丝呈现老熟的暗黄色。

10.烘干

将培育好的大麦虫虫体从玻璃瓶内倒出，放在烘干箱内50℃烘干，获得人工培育的冬虫夏草成品，如图3和图4所示为大麦虫冬虫夏草成品虫体背面和腹面示意图。

11.封装保存

使用真空封装机进行封装，封装后放到通风干燥处保存。

图4所示为获得的以大麦虫为宿主虫体的冬虫夏草的横剖图，图5所示为获得的以大麦虫为宿主虫体的冬虫夏草的纵剖图，为了显示说明虫体内不同部位的情况，将其切割成多个虫段进行展示，可以看出，在虫体不同部分的内部组织间均生长出白色菌丝，成为真正的冬虫夏草。

实施例2

1.液体培养基按重量计包括：葡萄糖30克、磷酸二氢钾0.75克、硫酸镁0.375克、维生素B10.375克、黄豆粉15克、酵母粉15克、水750克，自然pH值；

按称取葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、维生素B1、黄豆粉、酵母粉和水，混匀，倒入量杯量取体积，然后倒入锅中煮沸5分钟，煮沸后沉淀20分钟，把上清液倒入量杯中，加水补足蒸发量，冷却至室温；

2.液体培养基灭菌

将培养基倒入三角瓶内，填装量为三角瓶容积的65％，装瓶后用橡胶塞将瓶口封好进行常用蒸汽灭菌；

灭菌方法为：常压条件下当温度达到100℃时，灭菌保持8小时，灭菌后静置冷却至室温；

3.接种

在无菌条件下将冬虫夏草菌种接种至灭菌后的的液体培养基中；每瓶中接种冬虫夏草菌种量为液体培养基填装量的2％；

4.液体菌种培养

将接种后的三角瓶置于摇床，在18℃环境下，摇床转速为140转/分，培养10天，得到液体菌种；

5.固体培养基选择

选取健康活体黄粉虫作为固体培养基材料，清水冲洗掉虫体上的灰尘和杂质；

6.固体培养基制备

将黄粉虫放入提前清洗晾干的洁净广口玻璃瓶(组培瓶)，装虫量为玻璃瓶容积的70％，装瓶后用专用瓶盖封口，常压蒸汽灭菌，方法同步骤2；

7.接菌

在无菌条件下将步骤4培养获得的液体菌种装入预先灭过菌的喷雾器中，用喷雾器将液体菌种均匀地喷洒在虫体上，封好瓶盖，隔绝空气；

8.黑暗发菌

将接完菌种的玻璃瓶放在无光黑暗培育发菌室培养架上，控制温度为20℃，湿度为50％，培育发菌30天；

9.光照发菌

用节能灯管给予冷光，光照度为300Lx，光照时间30天，控制温度为30℃，湿度为85％，当虫体培养基菌丝由白色变为暗黄色要生长子实体时，培育发菌完毕；

10.烘干

将培育好的黄粉虫虫体从玻璃瓶内倒出，放在烘干箱内55℃烘干，获得人工培育的冬虫夏草成品，如图6所示；

11.封装保存

使用真空封装机进行封装，封装后放到通风干燥处保存。

实施例3

1.液体培养基配置

液体培养基按重量计包括：葡萄糖50克、磷酸二氢钾1.25克、硫酸镁0.625克、维生素B10.625克、黄豆粉25克、酵母粉25克、水1250克，自然pH值；

按称取葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、维生素B1、黄豆粉、酵母粉和水，混匀，倒入量杯量取体积，然后倒入锅中煮沸8分钟，煮沸后沉淀20分钟，把上清液倒入量杯中，加水补足蒸发量，冷却至室温；

2.液体培养基灭菌

将液体培养基倒入三角瓶内，填装量为三角瓶容积的70％，装瓶后用无菌透气封口膜将瓶口封好进行高压蒸汽灭菌，

灭菌方法：使用高压灭菌锅，当压力达到49千帕时，打开高压灭菌锅放气阀排出冷气，冷气放尽后，关闭放气阀重新升温，待压力达到117千帕时再保持1小时，灭菌后静置冷却至室温；

3.接种

在无菌条件下将冬虫夏草菌种接种至灭菌后的液体培养基中；每瓶中接种冬虫夏草菌种量为液体培养基填装量的4％；

4.液体菌种培养

将接种后的三角瓶置于摇床，在25℃环境下，摇床转速为140转/分，培养10天，得到液体菌种；

5.固体培养基选择

选取健康的活体幼蚕作为固体培养基材料，清水冲洗掉虫体上的灰尘和杂质；

6.固体培养基制备

将幼蚕放入提前清洗晾干的洁净广口玻璃瓶(一般广口瓶)，装虫量为玻璃瓶容积的70％，装瓶后用无菌透气封口膜封口，高压蒸汽灭菌，方法同步骤2；

7.接菌

在无菌条件下将步骤4培养获得的液体菌种装入预先灭过菌的喷雾器中，用喷雾器将液体菌种均匀地喷洒在虫体上，搅拌均匀，封好瓶盖，隔绝空气；

9.黑暗发菌

将接完菌种的玻璃瓶放在无光黑暗培育发菌室培养架上，控制温度为19℃，湿度为55％，培育发菌30天；

10.光照诱导

用日光灯管给予冷光，光照度为3500Lx，光照时间30天，控制温度为27℃，湿度为82％，当虫体培养基菌丝由白色变为暗黄色要生长子实体时，培育发菌完毕；

11.烘干

将培育好的幼蚕虫体从玻璃瓶内倒出，放在烘干箱内55℃烘干，获得人工培育的冬虫夏草成品，如图7和图8所示为培育好的以幼蚕为宿主虫体的冬虫夏草的背面和腹面图；

12.封装保存

使用真空封装机进行封装，封装后放到通风干燥处保存。

将上述3个实施例中三种不同宿主虫体培育的冬虫夏草送第三方专业检测机构检测，按照《中华人民共和国药典》2010年版一部的要求，使用液相色谱仪检测，其中检出腺苷含量均≥0.033％，高于药典规定的腺苷含量0.010％，并且其中虫草酸、虫草多糖、各种微量元素等有效成分含量均不低于野生冬虫夏草。

服用方法：将虫体打碎磨粉，装胶囊，每日3次，每次2粒，饭前温水服用，可与各种药同时吃。

现将部分中老年志愿者服用本发明培育的冬虫夏草的效果列出：

李某某：男，59岁，前列腺炎，前列腺增生引起尿频，小腹疼痛，服用后小腹疼痛消失，尿频症状消失。

郭某某：男，67岁，服用后性功能恢复，长出新头发。

郭某：男67岁，糖尿病，服用后，在不怎么忌口的情况下，血糖正常，未得并发症。

王某：男，63岁，糖尿病，腿肿，服用后，血糖正常，腿消肿，未得并发症。

毕某某：男，61岁，痔疮，飞蚊症，服用后痔疮，飞蚊症消失。

唐某某：女，44岁，痔疮，体弱易感冒，服用后痔疮消失，感冒次数明显减少。

李某某：女，57岁，高血压吃降压药引起尿频，服用后尿频症状消失，小便恢复正常。

综上所述，本发明提供的一种人工培育冬虫夏草的方法，通过抑制长草，使其有效成分保存在虫体内部，有效成分含量高于野生冬虫夏草，全程无菌条件培养，无需喷洒农药，无农药残留，具有产业化推广前景。培育出的冬虫夏草虫体经上百名中老年志愿者服用证明，其具有野生冬虫夏草的滋补作用，可完全替代野生冬虫夏草，保护野生资源，适于患有基础疾病或肿瘤，身体虚弱，免疫力低下的人群服用，也适于工作繁忙，身体处于亚健康的中青年人群服用，未发现副作用。

Claims (8)

1.一种人工培育冬虫夏草的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)液体培养基配制

液体培养基按重量比为：葡萄糖：磷酸二氢钾：硫酸镁：维生素B1：黄豆粉：酵母粉：水＝40：1：0.5：0.5：20：20：1000，自然pH值；

按比例称取葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、维生素B1、黄豆粉、酵母粉和水，混匀，倒入量杯量取体积，然后倒入锅中煮沸5-10分钟，煮沸后沉淀20分钟，把上清液倒入量杯中，加水补足蒸发量，冷却至室温；

2)液体培养基灭菌

将液体培养基倒入三角瓶内，填装量为三角瓶容积的60-70％，装瓶后用棉花或橡胶塞或无菌透气封口膜将瓶口封好进行灭菌，灭菌后静置冷却至室温；

3)接种

在无菌条件下将冬虫夏草菌种接种至灭菌后的液体培养基中，接种量为液体培养基填装量的2-6％；

4)液体菌种培养

将接种后的三角瓶置于摇床，在18-25℃环境下，摇床转速为140转/分，培养6-10天，得到液体菌种；

5)固体培养基选择

选取健康的活体宿主虫体作为固体培养基材料，清水冲洗掉虫体上的灰尘和杂质；

6)固体培养基制备

将宿主虫体放入提前清洗晾干的洁净广口玻璃瓶，装虫量为广口玻璃瓶容积的50-70％，装瓶后用无菌透气封口膜或专用瓶盖封口，灭菌；

7)接菌

在无菌条件下将步骤4)培养获得的液体菌种装入预先经过灭菌的喷雾器或注射器中，用喷雾器或注射器将液体菌种均匀地喷洒在虫体上，搅拌均匀，封好无菌透气封口膜或瓶盖，隔绝空气；

8)黑暗发菌

将接完菌种的广口玻璃瓶放在无光黑暗培育发菌室培养架上，控制温度为18-20℃，湿度为50-60％，培育发菌30天；

9)光照发菌

用日光灯管或节能灯管给予冷光，光照度为300-400Lx，光照时间30天，控制温度为25-30℃，湿度为80-85％，当虫体培养基菌丝由白色变为暗黄色时，培育发菌完毕；

10)烘干

将培育好的虫体从广口玻璃瓶内倒出，放在烘干箱内烘干，获得人工培育的冬虫夏草成品；

11)封装保存

使用真空封装机进行封装，封装后放到通风干燥处保存。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述灭菌采用高压蒸汽灭菌或常压蒸汽灭菌。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述高压蒸汽灭菌方法为：使用高压灭菌锅，当压力达到49千帕时，打开高压锅放气阀排出冷气，冷气放尽后，关闭放气阀重新升温，待压力达到117千帕时再保持1小时。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述常压蒸汽灭菌方法为：使用灭菌锅，常压条件下当温度达到100℃时，灭菌保持8小时。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述宿主虫体为大麦虫、黄粉虫或幼蚕。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤7)中接菌量为虫体重量的3-10％。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤10)中烘干的温度为50-60℃。

8.一种人工培育的冬虫夏草，其特征在于，所述冬虫夏草采用如权利要求1-7中任一项的方法培育而成。