CN109691350A - 一种同时提高类胡萝卜素和虫草素含量的蛹虫草优质子实体生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种同时提高类胡萝卜素和虫草素含量的优质蛹虫草子实体的生产方法。本发明所提供的培养方法将蛹虫草子实体培养过程分为发菌、原基分化、子实体生长和代谢产物积累4个不同的阶段，对不同的阶段分别进行温度、光照和湿度控制。子实体生长和代谢产物积累阶段在白光照射的基础上，用蓝光灯带补充Led蓝光照射，子实体样品采用热风低温烘干或冷冻干燥。本发明利用常规培养基，通过分阶段培养条件控制，生产得到的蛹虫草子实体产品，类胡萝卜素和虫草素含量同时提高，呈深黄色或橙色，外观品相好，产品的商品价值高，简便易行，可以实现蛹虫草子实体的优质生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种蛹虫草子实体的培养方法，特别涉及一种同时提高类胡萝卜素和虫草素含量的蛹虫草优质子实体生产方法。
背景技术
蛹虫草(Cordyceps militaris(L.)Fr.)又名北虫草，北冬虫夏草，是一种具有较高营养价值和滋补作用的珍稀食药用菌。生物分类上隶属于子囊菌门(Ascomycota)、子囊菌纲(Ascomycetes)、肉座菌目(Hypocreales)、虫草菌科(Cordicipitaceae)、虫草属[Cordyceps(Fr.)Link]。《新华本草纲要》称，蛹虫草“全草：味甘，性平。有益肺肾，补精髓，止血化痰的功能”，现代药理学研究也证实了蛹虫草抗肿瘤、抗病毒、降血压等多种功能。因其滋补作用和药用功效与名贵但难以人工培养的冬虫夏草相近，正日渐成为冬虫夏草的理想替代品。
蛹虫草富含高蛋白、氨基酸、SOD、腺苷以及多种微量元素及维生素、虫草酸等有效成分，并含有独特的虫草素和类胡萝卜素(冬虫夏草不含有虫草素和类胡萝卜素)，我国卫生部于2009年3月16日正式将其列为了新资源食品(现为新食品原料，中华人民共和国卫生部公告2009年第3号http://www.moh.gov.cn/publicfiles/business/htmlfiles/zwgkzt/pgg/200903/39591.htm)，其产品不仅在国内被越来越多的消费者所接受，在东南亚也十分畅销。
虽然蛹虫草已经实现了产业化生产，但是市场上子实体产品质量参差不齐，首先表现在其色泽差异较大，有的蛹虫草子实体发白，有的浅黄色，有的橙黄色。蛹虫草子实体的颜色来自于其含有的类胡萝卜素，我们的检测结果表明不同的产品类胡萝卜素含量差别很大(Yang T.,Sun J.D.,Lian T.T.,Wang W.Z.and Dong C.H.2014.Process optimizationfor extraction of carotenoids from Cordyceps militaris,an edible andmedicinal fungus,International Journal of Medicinal Mushrooms 16(2):125-135.)，并建议类胡萝卜素可以作为蛹虫草子实体产品的质量标准。类胡萝卜素除具有着色的功效外，还具有抗氧化、抗肿瘤、延缓衰老和维生素A源等多种功效。蛹虫草子实体类胡萝卜素含量的高低不仅影响其产品的外观色泽即品相，也直接影响其生物学功效。
其次，蛹虫草特有的活性成分虫草素的含量变异大。我们对目前市场上蛹虫草子实体有效成分含量测定的结果表明部分产品虫草素含量低至无法检测，多数产品在1mg/g以下。虫草素作为蛹虫草中最重要且特有的活性成分，早在2008年美国FDA已经将其进行了二期临床试验，用于白血病的治疗(http://clinicaltrials.gov/show/NCT00709215)。另外虫草素还有抑制炎症(Kim HG,Shrestha B,Lim SY,et al.Cordycepin inhibitslipopolysaccharide-induced inflammation by the suppression of NF-kB throughAkt and p38inhibition in RAW 264.7macrophage cells[J].European journal ofpharmacology.2006,545:192–199)，预防高血脂(Guo P,Kai Q,Gao J,et al.Cordycepinprevents hyperlipidemia in hamsters fed a high-fat diet via activation ofAMP-activated protein kinase[J].Journal of pharmacological sciences.2010,113:395–403)，抑制癌细胞增殖(Tian XW,Li YJ,Shen YY,et al.Apoptosis and inhibitionof proliferation of cancer cells induced by cordycepin[J].Oncologyletters.2015,10:595–599)；抑制癌细胞转移和抗血小板凝集(Tuli HS,Sharma AK,Sandhu SS,et al.Cordycepin:a bioactive metabolite with therapeutic potential[J].Life sciences.2013,93:863–869)等多种功效。
目前蛹虫草栽培的专利较多，专利“一种提高类胡萝卜素含量的蛹虫草栽培培养基和培养方法CN201310355926.8”提供了一种利用莜麦为培养基主要成分的提高蛹虫草类胡萝卜素含量培养基。专利“一种提高蛹虫草子实体中虫草素含量的方法CN 104221717A”，通过锌离子胁迫和光照条件调整将虫草子实体中虫草素的含量提高到0.35％；专利“一种提高蛹虫草子实体中虫草素含量的方法CN 105248150 A”通过高温胁迫获得虫草素含量达0.5％的虫草子实体，该方法限于提高虫草素含量；专利“一种提高虫草素含量的蛹虫草培养基及生产方法CN 105505784 A”通过在液体菌种培养基配方中添加腺嘌呤、黄豆粉、蔗糖和蚕蛹粉等营养物质来提高蛹虫草子实体中虫草素含量；这些方法培养基配方复杂、操作繁琐，如CN 105505784 A的培养基原料中包括小米、大麦、黄豆粉、蔗糖、蚕蛹粉、奶粉、红糖、蛋白胨、腺嘌呤、黄豆粉等多种成分。目前为止还没有关于同时提高蛹虫草子实体类胡萝卜素和虫草素含量生产方法的报道。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种同时提高类胡萝卜素和虫草素含量的蛹虫草优质子实体生产方法。
本发明所提供的同时提高类胡萝卜素和虫草素含量的蛹虫草子实体生产方法，是将菌株接种于常规蛹虫草栽培培养基中进行培养，并对其培养过程进行控制，具体为对其不同的培养阶段(发菌、原基分化、子实体生长和代谢产物积累)分别进行温度、光照和湿度控制，从而获得类胡萝卜素和虫草素含量同时提高的蛹虫草子实体。
具体而言，所述方法包括下述步骤：将蛹虫草菌株接种于常规蛹虫草栽培培养基中，并按照如下(1)-(4)的顺序进行培养，从而获得类胡萝卜素和虫草素含量高的优质蛹虫草子实体：
(1)发菌：蛹虫草接种后，发菌阶段为黑暗避光培养，温度维持在15-23℃，自然湿度，避光培养4-8天(如6天或7天)，完成蛹虫草菌株发菌；
(2)原基分化：当菌丝充满培养基表面时，进入原基诱导阶段。此时给予温差刺激，维持白天温度18-23℃，夜晚10-18℃，每天光照10-16小时(如16小时)，光照强度300-2000lux，培养6-12天(如8天)，蛹虫草子座原基形成；所述温差为24小时内的温差在1-10℃的范围；
(3)子实体生长：于18-23℃(如20℃、21℃或22℃)条件下，每天光照8-12小时(如8小时、10小时)，光照强度300-2000lux(如300lux、1500lux、1700lux或2000lux、)，空气相对湿度75-90％，培养10-40天(如28天、30天)，蛹虫草子实体长至6-10厘米长；
(4)代谢产物积累：当蛹虫草子实体生长至6-10厘米长时，维持温度25-30℃(如25℃、30℃)，每天光照8-12小时(如8小时、10小时)，光照强度300-6000lux(如1700lux、6000lux)，空气相对湿度75-90％，继续培养5-20天(如20天)；
在步骤(3)和(4)中，每天经所需光照时长后，再用光强为20-100Lux的Led蓝光灯带补充照射1-3小时(如1小时、2小时)。
在步骤(2)-(4)中，所述光照：白天采用自然光照射，若自然光照时间不能达到所需光照时长，则晚上用日光灯增加光照时间至所需光照时长。
在所述方法的步骤(4)之后，还包括如下步骤：采集所述蛹虫草子实体，采用热风30-40℃烘干或冷冻干燥，获得生产类胡萝卜素和虫草素含量提高的蛹虫草子实体产品，避光保存。
在本发明中，所述蛹虫草菌株具体为蛹虫草(Cordyceps militaris)菌株“大孢子头北虫草09-888”(可购自辽宁锦州市亚泰微生物研究所)，“小孢子头菌株66”(可购自辽宁锦州市亚泰微生物研究所)，或蛹虫草(Cordyceps militaris)菌株“岷源I号”(可购自四川省岷源高新所菌种生产中心)。
在本发明中，所述蛹虫草栽培培养基具体可由固体基物和营养液按照质量配比为1：(0.5-1.5)的比例混合而成；所述固体基物可由质量百分含量为95-99％的谷物(谷物颗粒)和质量百分含量为1-5％的蚕蛹粉混合而成。
在所述培养基中，所述营养液的溶剂为水，溶质及浓度如下：葡萄糖8-12g/L(如10g/L)，蛋白胨8-12g/L(如10g/L)，磷酸二氢钾1.5-2.5g/L(如2g/L)，硫酸镁0.8-1g/L(如1g/L)，柠檬酸铵0.8-1.2g/L(如1g/L)，维生素B10.02-0.05g/L(如0.05g/L)，pH5.0。
在本发明中，所述谷物为大米颗粒、莜麦或小麦。
在本发明中，所述培养基中，所述固体基物和所述营养液的质量配比具体为1：1.5。
在所述培养基中，所述蚕蛹粉为蚕蛹经过干燥、粉碎后的产品。
在所述培养基中，所述蚕蛹粉的含水量为10-12％(质量百分含量)，粗蛋白含量为45-55％(质量百分含量)，粗纤维含量为3-6％(质量百分含量)，粗灰分含量为4-5％(质量百分含量)。
所述培养基为经过121℃灭菌1小时后所得的无菌培养基。
本发明利用常规培养基为原料，通过不同生长阶段的培养条件控制，生产得到的蛹虫草子实体产品类胡萝卜素含量高，呈深黄色或橙色，外观品相好，虫草素含量提高，产品的商品价值高。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，但本发明并不局限于此，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
蚕蛹粉：蚕蛹经过干燥、粉碎后的产品。下述实施例所用的蚕蛹粉购自辽宁省丹东市振安区群长土特产公司；无霉变及异味异臭；含水份10-12％，粗蛋白45-55％，粗纤维3-6％，粗灰分4-5％。
大米、小麦、莜麦等谷物：无霉变。
营养液：葡萄糖10g，蛋白胨10g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁1g，柠檬酸铵1g，维生素B10.05g，用水定容至1000ml，调pH值5.0。
马铃薯固体培养基：马铃薯200g煮汁，葡萄糖20g，琼脂15g，用水定容至1L。其中，马铃薯煮汁方法如下：取去皮马铃薯，切成小块煮沸半小时，然后用纱布过滤即可。
PDA液体培养基：马铃薯200g煮汁，葡萄糖20g，用水定容至1L。其中，马铃薯煮汁方法如下：取去皮马铃薯，切成小块煮沸半小时，然后用纱布过滤即可。
实施例1、类胡萝卜素和虫草素含量高的蛹虫草子实体的栽培培养
本实施例中，所采用的蛹虫草(Cordyceps militaris)菌株为“岷源I号”：购自四川省岷源高新所菌种生产中心。
一、蛹虫草栽培培养基的制备
将大米颗粒285g和蚕蛹粉15g混合均匀，分装到10只栽培瓶中，30g/瓶，向每瓶中加入45g营养液，封口，121℃灭菌1小时，待冷却至室温后备用，获得含蛹虫草栽培培养基的培养瓶。
二、种子液的制备
按照常规方法制备蛹虫草菌株的种子液，具体如下：
1、菌株活化
将蛹虫草(Cordyceps militaris)菌株“岷源I号”接种于马铃薯固体培养基上活化，培养温度20℃，培养时间10天。
2、菌种培养
将步骤1的菌丝体，在无菌条件下接种到PDA液体培养基中，培养温度20℃，培养方式为旋涡式摇床培养，转速150转/分钟，培养至对数生长期，得到种子液。
三、子实体培养
将步骤二得到的蛹虫草(Cordyceps militaris)菌株“岷源I号”种子液接种于步骤一制备的蛹虫草栽培培养基中按照如下(1)-(4)的顺序进行培养，从而获得类胡萝卜素和虫草素含量提高的蛹虫草成熟子实体：
(1)发菌：于18℃黑暗避光培养7天，湿度自然，菌丝充满培养基完成蛹虫草菌株发菌；
(2)原基分化：维持白天温度20-22℃，夜晚15-18℃，空气相对湿度75-85％，每天光照16小时，光照强度为2000lux，培养6天，蛹虫草子座原基形成；
(3)子实体生长：于20℃条件下，每天白光光照10小时，光照强度为2000lux，并用光强为20Lux的Led蓝光灯带额外补充照射2小时，空气相对湿度75-90％，培养28天，蛹虫草子实体长至6-10厘米长。
(4)代谢产物积累：于30℃条件下，每天光照10小时，光照强度6000lux，并用光强为20Lux的Led蓝光灯带额外补充照射2小时，空气相对湿度75-90％，培养20天。
四、子实体的采收和干燥
将培养瓶中生长到6-10厘米长的蛹虫草子实体进行采收，热风烘干(30-40℃)，得到蛹虫草子实体产品，产品避光保存。
五、蛹虫草子实体中类胡萝卜素含量的测定
将步骤四得到的干燥后蛹虫草子实体产品打碎成粉，按照如下方法测定子实体中类胡萝卜素和虫草素含量，实验重复三次结果取平均值。
1、类胡萝卜素含量测定方法：
(1)称取0.5g菌粉，放入三角瓶中，加入7.5mL浓度为1mol/L的HCl，同时加入2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)使其终浓度为0.1％(1g/L)，避光放置30min，沸水浴4min，冰上冷却。
(2)5000r/min离心10min，弃上清，水洗2次，最后一次8000r/min离心10min。
(3)去上清，向沉淀加入12mL的丙酮：石油醚(体积比4：1)的混合溶剂，再加入2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)使其终浓度为0.1％(1g/L)，室温，150r/min避光震荡1h，8000r/min离心10min，取上清，即为类胡萝卜素提取液。提取过程注意避光。
(4)再重复提取2次，即重复步骤(3)2次，将3次提取液合并，于445nm处测定吸光值。
(5)按以下公式计算类胡萝卜素含量：
式中，A：吸光度；V：丙酮用量(mL)；D：提取液稀释倍数；0.16类胡萝卜素消光系数；W：蛹虫草子实体干重(g)。
结果如表1所示，步骤四得到的干燥后蛹虫草子实体产品中的类胡萝卜素含量为3.68±0.04mg/g。
2、虫草素含量测定方法：
虫草素含量测定方法——高效液相色谱法(HPLC)：
(1)色谱条件：
色谱柱：Puritex C18column(4.6×250mm,5μm，绿百草公司)
流动相：酸水:乙腈(95:5)
检测波长：259nm
流速：1.0mL/min
上样量：10μL
(2)标准曲线的绘制
准确称取虫草素标准品10mg，用流动相溶解定容至100ml，摇匀得到浓度为100μg/ml的储存液。准确吸取0.1、0.2、0.5、1.0、2.0和5.0ml混合标准溶液与10ml容量瓶中，定容，摇匀，得到浓度为1,2,5,10,20,50μg/mL的溶液，按照色谱条件测定，以虫草素浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
(3)样品处理
称取粉碎均匀的样品0.5g于100ml容量瓶中，加入约80ml去离子水，45℃超声破碎30min。取出后，用去离子水定容至100mL，摇匀。取1ml样品12000rpm离心10min，过滤(0.45μm)，进行HPLC分析，标准曲线计算蛹虫草子实体中虫草素含量。
结果如表1所示，步骤四得到的干燥后蛹虫草子实体产品中虫草素含量为5.40±0.04mg/g。
表1本实施例中蛹虫草子实体产品中虫草素和类胡萝卜素含量测定结果(单位：mg/g)
| 重复1 | 重复2 | 重复3 | 平均值±标准差 | |
| 类胡萝卜素 | 3.67 | 3.72 | 3.64 | 3.68±0.04 |
| 虫草素 | 5.35 | 5.42 | 5.43 | 5.40±0.04 |
实施例2、类胡萝卜素和虫草素含量高的蛹虫草子实体的栽培培养
本实施例中，所采用的蛹虫草(Cordyceps militaris)菌株为蛹虫草(Cordycepsmilitaris)菌株“岷源I号”：购自四川省岷源高新所菌种生产中心。
一、蛹虫草栽培培养基的制备
将莜麦285g和蚕蛹粉15g混合均匀，分装到10只栽培瓶中，30g/瓶，向每瓶中加入45g营养液，封口，121℃灭菌1小时，待冷却至室温后备用，获得含蛹虫草栽培培养基的培养瓶。
二、种子液的制备
按照常规方法制备蛹虫草菌株的种子液，具体操作参见实施例1步骤二，得到种子液。
三、接种、培养得到成熟子实体
将步骤二得到的蛹虫草(Cordyceps militaris)菌株“岷源I号”种子液接种于步骤一制备的蛹虫草栽培培养基中按照如下(1)-(4)的顺序进行培养，从而获得类胡萝卜素和虫草素含量提高的蛹虫草子实体：
(1)发菌：于20℃黑暗避光培养6天，湿度自然，菌丝充满培养基完成蛹虫草菌株发菌；
(2)原基分化：维持白天温度21-22℃，夜晚10-18℃，空气相对湿度75-85％，每天光照16小时，光照强度为1700lux，培养8天，蛹虫草子座原基形成；
(3)子实体生长：于22℃条件下，每天白光光照10小时，光照强度为1700lux，并用光强为100Lux的Led蓝光灯带额外补充照射1小时，空气相对湿度75-90％，培养30天，蛹虫草子实体长至8-10厘米长。
(4)代谢产物积累：于25℃条件下，每天光照8小时，光照度1700lux，并用光强为100Lux的Led蓝光灯带额外补充照射1小时，空气相对湿度75-90％，培养20天。
四、子实体的采收和干燥
将培养瓶中生长到8-10厘米长的成熟蛹虫草子实体进行采收，热风烘干(30-40℃)，得到蛹虫草子实体产品，产品避光保存。
五、蛹虫草子实体中类胡萝卜素和虫草素含量的测定
将步骤四得到的干燥后蛹虫草子实体产品打碎成粉，按照如下方法测定蛹虫草子实体中类胡萝卜素和虫草素含量，实验重复三次结果取平均值。
结果如表2所示，步骤四得到的干燥后蛹虫草子实体产品中的类胡萝卜素含量为5.26±0.13mg/g,虫草素含量为7.46±0.16mg/g。
表2本实施例蛹虫草子实体产品中类胡萝卜素和虫草素含量测定结果(单位：mg/g)
| 重复1 | 重复2 | 重复3 | 平均值±标准差 | |
| 类胡萝卜素 | 5.12 | 5.29 | 5.38 | 5.26±0.13 |
| 虫草素 | 7.51 | 7.28 | 7.60 | 7.46±0.16 |
实施例3、类胡萝卜素和虫草素含量高的蛹虫草子实体的栽培培养高光照
本实施例中，所采用的蛹虫草(Cordyceps militaris)菌株为“大孢子头北虫草09-888”：购自辽宁锦州市亚泰微生物研究所。
一、蛹虫草栽培培养基的制备
将小麦285g和蚕蛹粉15g混合均匀，分装到10只栽培瓶中，30g/瓶，向每瓶中加入45g营养液，封口，121℃灭菌1小时，待冷却至室温后备用，获得含蛹虫草栽培培养基的培养瓶。
二、种子液的制备
按照常规方法制备蛹虫草菌株的种子液，具体操作参见实施例1步骤二，得到种子液。
三、接种、培养得到成熟子实体
将步骤二得到的蛹虫草(Cordyceps militaris)菌株“大孢子头北虫草09-888”种子液接种于步骤一制备的蛹虫草栽培培养基中按照如下(1)-(4)的顺序进行培养，从而获得类胡萝卜素和虫草素含量提高的蛹虫草子实体：
(1)发菌：于18℃黑暗避光培养7天，湿度自然，菌丝充满培养基完成蛹虫草菌株发菌；
(2)原基分化：维持白天温度20-22℃，夜晚10-15℃，空气相对湿度75-85％，每天光照16小时，光照强度为300lux，培养6天，蛹虫草子座原基形成；
(3)子实体生长：于21℃条件下，每天白光光照8小时，光照强度为300lux，并用光强为50Lux的Led蓝光灯带额外补充照射2小时，空气相对湿度75-90％，培养28天，蛹虫草子实体长至6-10厘米长。
(4)代谢产物积累：于21℃条件下，每天光照8小时，光照度6000lux,并用光强为50Lux的Led蓝光灯带额外补充照射1小时，空气相对湿度75-90％，培养20天。
四、子实体的采收和干燥
将培养瓶中生长到6-10厘米长的成熟蛹虫草子实体进行采收，烘干得到蛹虫草子实体产品，产品避光保存。
五、蛹虫草子实体中类胡萝卜素和虫草素含量的测定
将步骤四得到的干燥后蛹虫草子实体产品打碎成粉，测定其中的类胡萝卜素和虫草素含量，具体测定方法参见实施例1步骤五。实验重复三次结果取平均值。
结果如表2所示，步骤四得到的干燥后蛹虫草子实体产品中的类胡萝卜素含量为2.61±0.08mg/g,虫草素含量为4.71±0.05mg/g。
表3本实施例中蛹虫草子实体产品中类胡萝卜素和虫草素含量测定结果(单位：mg/g)
| 重复1 | 重复2 | 重复3 | 平均值±标准差 | |
| 类胡萝卜素 | 2.61 | 2.66 | 2.55 | 2.61±0.06 |
| 虫草素 | 4.66 | 4.73 | 4.75 | 4.71±0.05 |
实施例4、类胡萝卜素和虫草素含量高的蛹虫草子实体的栽培培养
本实施例中，所采用的蛹虫草(Cordyceps militaris)菌株为蛹虫草(Cordycepsmilitaris)菌株“66”(小孢子头菌株)：购自辽宁锦州市亚泰微生物研究所。
一、蛹虫草栽培培养基的制备
将莜麦285g和蚕蛹粉15g混合均匀，分装到10只栽培瓶中，30g/瓶，向每瓶中加入45g营养液，封口，121℃灭菌1小时，待冷却至室温后备用，获得含蛹虫草栽培培养基的培养瓶。
二、种子液的制备
按照常规方法制备蛹虫草菌株的种子液，具体操作参见实施例1步骤二，得到种子液。
三、接种、培养得到成熟子实体
将步骤二得到的蛹虫草(Cordyceps militaris)菌株“66”种子液接种于步骤一制备的蛹虫草栽培培养基中按照如下(1)-(4)的顺序进行培养，从而获得类胡萝卜素和虫草素含量提高的蛹虫草子实体：
(1)发菌：于18℃黑暗避光培养7天，湿度自然，菌丝充满培养基完成蛹虫草菌株发菌；
(2)原基分化：维持白天温度20-22℃，夜晚10-15℃，空气相对湿度75-85％，每天光照16小时，培养6天，蛹虫草子座原基形成；
(3)子实体生长：于21℃条件下，每天白光光照8小时，光照强度为1500lux，并用光强为100Lux的Led蓝光灯带额外补充照射2小时，空气相对湿度75-90％，培养28天，蛹虫草子实体长至6-10厘米长。
(4)代谢产物积累：于25℃条件下，每天光照8小时，光照度1500lux,并用光强为100Lux的Led蓝光灯带额外补充照射2小时，空气相对湿度75-90％，培养10天。
四、子实体的采收和干燥
将培养瓶中生长到8-10厘米长的成熟蛹虫草子实体进行采收，热风烘干(30-40℃)，得到蛹虫草子实体产品，产品避光保存。
五、蛹虫草子实体中类胡萝卜素和虫草素含量的测定
将步骤四得到的干燥后蛹虫草子实体产品打碎成粉，测定其中的类胡萝卜素和虫草素含量，具体测定方法参见实施例1步骤五。实验重复三次结果取平均值。
结果如表4所示，步骤四得到的干燥后蛹虫草子实体产品中的类胡萝卜素含量为3.11±0.01mg/g,虫草素含量为3.88±0.06mg/g。
表4本实施例中蛹虫草子实体产品中类胡萝卜素和虫草素含量测定结果(单位：mg/g)
| 重复1 | 重复2 | 重复3 | 平均值±标准差 | |
| 类胡萝卜素 | 3.04 | 3.11 | 3.18 | 3.11±0.01 |
| 虫草素 | 3.81 | 3.91 | 3.92 | 3.88±0.06 |
对比例1
本对比例是针对实施例1设置的，与实施例1同步实施，所采用的蛹虫草(Cordyceps militaris)菌株为“岷源I号”：购自四川省岷源高新所菌种生产中心。
一、蛹虫草栽培培养基的制备
将大米颗粒285g和蚕蛹粉15g混合均匀，分装到10只栽培瓶中，30g/瓶，向每瓶中加入45g营养液，封口，121℃灭菌1小时，待冷却至室温后备用，获得含蛹虫草栽培培养基的培养瓶。
二、种子液的制备
按照常规方法制备蛹虫草菌株的种子液，具体操作参见实施例1步骤二，得到种子液。
三、子实体培养
将步骤二得到的蛹虫草(Cordyceps militaris)菌株“岷源I号”种子液接种于步骤一制备的蛹虫草栽培培养基中，进行培养，具体操作参见实施例1步骤三，与实施例1步骤三的不同之处仅在于：在子实体生长阶段不给予Led蓝光灯带额外补充照射，在代谢产物积累阶段依然维持子实体生长阶段的培养条件，获得蛹虫草成熟子实体。
四、子实体的采收和干燥
同实施例1步骤四，得到蛹虫草子实体产品。
五、蛹虫草子实体中类胡萝卜素和虫草素含量的测定
将步骤四得到的干燥后蛹虫草子实体产品打碎成粉，测定其中的类胡萝卜素和虫草素含量，具体测定方法参见实施例1步骤五。实验重复三次结果取平均值。
结果如表5所示，步骤四得到的干燥后蛹虫草子实体产品中的类胡萝卜素含量为2.55±0.17mg/g，虫草素含量为3.40±0.05mg/g。
表5本对比例中蛹虫草子实体产品中类胡萝卜素和虫草素含量测定结果(单位：mg/g)
| 重复1 | 重复2 | 重复3 | 平均值±标准差 | |
| 类胡萝卜素 | 2.67 | 2.43 | 2.55 | 2.55±0.17 |
| 虫草素 | 3.35 | 3.42 | 3.43 | 3.40±0.05 |
对比例2
本对比例是针对实施例2设置的，与实施例2同步实施，所采用的蛹虫草(Cordyceps militaris)菌株为蛹虫草(Cordyceps militaris)菌株“岷源I号”：购自四川省岷源高新所菌种生产中心。
一、蛹虫草栽培培养基的制备
将莜麦285g和蚕蛹粉15g混合均匀，分装到10只栽培瓶中，30g/瓶，向每瓶中加入45g营养液，封口，121℃灭菌1小时，待冷却至室温后备用，获得含蛹虫草栽培培养基的培养瓶。
二、种子液的制备
按照常规方法制备蛹虫草菌株的种子液，具体操作参见实施例2步骤二，得到种子液。
三、子实体培养
将步骤二得到的蛹虫草(Cordyceps militaris)菌株“岷源I号”种子液接种于步骤一制备的蛹虫草栽培培养基中，进行培养，具体操作参见实施例2步骤三，与实施例2步骤三的不同之处仅在于：子实体生长和代谢产物积累阶段采用相同的培养条件，采用自然光照，不给予Led蓝光灯带额外补充照射，维持温度22℃，获得蛹虫草成熟子实体。
四、子实体的采收和干燥
同实施例2步骤四，得到蛹虫草子实体产品。
五、蛹虫草子实体中类胡萝卜素含量的测定
将步骤四得到的干燥后蛹虫草子实体产品打碎成粉，测定其中的类胡萝卜素含量，具体测定方法参见实施例1步骤五。实验重复三次结果取平均值。
四、子实体的采收和干燥
同实施例2步骤四，得到蛹虫草子实体产品。
五、蛹虫草子实体中类胡萝卜素和虫草素含量的测定
将步骤四得到的干燥后蛹虫草子实体产品打碎成粉，测定其中的类胡萝卜素和虫草素含量，具体测定方法参见实施例2步骤五。实验重复三次结果取平均值。
结果如表6所示，步骤四得到的干燥后蛹虫草子实体产品中的类胡萝卜素含量为3.63±0.12mg/g，虫草素含量为1.81±0.02mg/g。
表6本对比例中蛹虫草子实体产品中类胡萝卜素和虫草素含量测定结果(单位：mg/g)
| 重复1 | 重复2 | 重复3 | 平均值±标准差 | |
| 类胡萝卜素 | 3.53 | 3.60 | 3.76 | 3.63±0.12 |
| 虫草素 | 1.79 | 1.82 | 1.83 | 1.81±0.02 |
对比例3
本对比例是针对实施例3设置的，与实施例3同步实施，所采用的蛹虫草(Cordyceps militaris)菌株为“大孢子头北虫草09-888”：购自辽宁锦州市亚泰微生物研究所。
一、蛹虫草栽培培养基的制备
将小麦285g和蚕蛹粉15g混合均匀，分装到10只栽培瓶中，30g/瓶，向每瓶中加入45g营养液，封口，121℃灭菌1小时，待冷却至室温后备用，获得含蛹虫草栽培培养基的培养瓶。
二、种子液的制备
按照常规方法制备蛹虫草菌株的种子液，具体操作参见实施例3步骤二，得到种子液。
三、接种、培养得到成熟子实体
将步骤二得到的蛹虫草(Cordyceps militaris)菌株“大孢子头北虫草09-888”种子液接种于步骤一制备的蛹虫草栽培培养基中，进行培养，具体操作参见实施例3步骤三，与实施例3步骤三的不同之处仅在于：在子实体生长和代谢产物积累阶段不给予Led蓝光灯带额外补充照射，代谢产物积累阶段维持子实体生长阶段的培养条件，即维持光照300lux，获得蛹虫草成熟子实体。
四、子实体的采收和干燥
同实施例3步骤四，得到蛹虫草子实体产品。
五、蛹虫草子实体中类胡萝卜素和虫草素含量的测定
将步骤四得到的干燥后蛹虫草子实体产品打碎成粉，测定其中的类胡萝卜素和虫草素含量，具体测定方法参见实施例3步骤五。实验重复三次结果取平均值。
结果如表7所示，步骤四得到的干燥后蛹虫草子实体产品中的类胡萝卜素含量为1.72±0.14mg/g，虫草素含量为1.44±0.20mg/g。
表7本对比例蛹虫草子实体产品中类胡萝卜素和虫草素含量测定结果(单位：mg/g)
| 重复1 | 重复2 | 重复3 | 平均值±标准差 | |
| 类胡萝卜素 | 1.63 | 1.88 | 1.66 | 1.72±0.14 |
| 虫草素 | 1.29 | 1.35 | 1.67 | 1.44±0.20 |
对比例4
本对比例是针对实施例4设置的，与实施例4同步实施，所采用的蛹虫草(Cordyceps militaris)菌株为“66”(小孢子头菌株)：购自辽宁锦州市亚泰微生物研究所。
一、蛹虫草栽培培养基的制备
将莜麦285g和蚕蛹粉15g混合均匀，分装到10只栽培瓶中，30g/瓶，向每瓶中加入45g营养液，封口，121℃灭菌1小时，待冷却至室温后备用，获得含蛹虫草栽培培养基的培养瓶。
二、种子液的制备
按照常规方法制备蛹虫草菌株的种子液，具体操作参见实施例1步骤二，得到种子液。
三、接种、培养得到成熟子实体
将步骤二得到的蛹虫草(Cordyceps militaris)菌株“66”种子液接种于步骤一制备的蛹虫草栽培培养基中，进行培养，获得蛹虫草成熟子实体。具体操作参见实施例4步骤三，与实施例4步骤三的不同之处仅在于：子实体生长和代谢产物积累阶段不给予Led蓝光灯带额外补充照射；在代谢产物积累过程采用和子实体生长相同的条件，温度维持在21℃。
四、子实体的采收和干燥
同实施例4步骤四，得到蛹虫草子实体产品。
五、蛹虫草子实体中类胡萝卜素和虫草素含量的测定
将步骤四得到的干燥后蛹虫草子实体产品打碎成粉，测定其中的类胡萝卜素和虫草素含量，具体测定方法参见实施例1步骤五。实验重复三次结果取平均值。
结果如表8所示，步骤四得到的干燥后蛹虫草子实体产品中的类胡萝卜素含量为1.76±0.16mg/g，虫草素含量为0.85±0.07mg/g。
表8本对比例蛹虫草子实体产品中类胡萝卜素和虫草素含量测定结果(单位：mg/g)
| 重复1 | 重复2 | 重复3 | 平均值±标准差 | |
| 类胡萝卜素 | 1.93 | 1.60 | 1.76 | 1.76±0.16 |
| 虫草素 | 0.79 | 0.82 | 0.93 | 0.85±0.07 |
对比例5
本对比例是针对实施例2设置的，与实施例2同步实施，所采用的蛹虫草(Cordyceps militaris)菌株为蛹虫草(Cordyceps militaris)菌株“岷源I号”：购自四川省岷源高新所菌种生产中心。
一、蛹虫草栽培培养基的制备
将莜麦285g和蚕蛹粉15g混合均匀，分装到10只栽培瓶中，30g/瓶，向每瓶中加入45g营养液，封口，121℃灭菌1小时，待冷却至室温后备用，获得含蛹虫草栽培培养基的培养瓶。
二、种子液的制备
按照常规方法制备蛹虫草菌株的种子液，具体操作参见实施例2步骤二，得到种子液。
三、接种、培养得到成熟子实体
将步骤二得到的蛹虫草(Cordyceps militaris)菌株“岷源I号”种子液接种于步骤一制备的蛹虫草栽培培养基中，按照如下(1)-(3)的顺序进行培养：
(1)发菌：于20℃避光培养6天，完成蛹虫草菌株发菌；
(2)原基分化：于16-23℃变温条件下，每天光照16小时，培养8天，蛹虫草子座原基形成；所述变温为24小时内的温差在5-7℃的范围；
(3)子实体生长：于22℃条件下，每天光照8小时，空气相对湿度75-90％，培养30天，蛹虫草子实体成熟，长至8-10厘米长。
在步骤(2)和(3)中，所述光照为：白天采用自然光照射(光强50-1000Lux)，若自然光照时间不能达到所需光照时长，则晚上用光强为300-500Lux的日光灯增加光照时间至所需光照时长。
在步骤(2)和(3)中，每天经自然光照射、日光灯补照到所需光照时长后，再用光强为50-100Lux的Led蓝光灯带额外补充照射1小时。
四、子实体的采收和干燥
将培养瓶中生长到8-10厘米长的成熟蛹虫草子实体进行采收，热风烘干(30-40℃)，得到蛹虫草子实体产品，产品避光保存。
五、蛹虫草子实体中类胡萝卜素和虫草素含量的测定
将步骤四得到的干燥后蛹虫草子实体产品打碎成粉，测定其中的类胡萝卜素和虫草素含量，具体测定方法参见实施例2步骤五。实验重复三次结果取平均值。
结果如表9所示，步骤四得到的干燥后蛹虫草子实体产品中的类胡萝卜素含量为4.19±0.07mg/g；虫草素含量为0.96±0.09mg/g。
表9本对比例中蛹虫草子实体产品中的类胡萝卜素和虫草素含量测定结果(单位：单
位：mg/g)
| 重复1 | 重复2 | 重复3 | 平均值±标准差 | |
| 类胡萝卜素 | 4.12 | 4.26 | 4.18 | 4.19±0.07 |
| 虫草素 | 0.92 | 0.89 | 1.06 | 0.96±0.09 |
对以上4个实施例和4个对比例的结果进行比较分析，发现：实施例1所得到的蛹虫草子实体产品中的类胡萝卜素含量为3.68±0.04mg/g，虫草素含量为5.40±0.04mg/g，这相对比作为对照的对比例1得到的蛹虫草子实体产品中的类胡萝卜素含量2.55±0.17mg/g和3.40±0.05而言，分别提高了44.31％和58.82％。实施例2所得到的蛹虫草子实体产品中的类胡萝卜素含量为5.26±0.13mg/g，虫草素含量为7.46±0.16mg/g，这相对比作为对照的对比例2得到的蛹虫草子实体产品中的类胡萝卜素含量3.63±0.12mg/g和1.81±0.02而言，分别提高了44.90％和312.15％；相对比作为对照的对比例5得到的蛹虫草子实体产品中的类胡萝卜素含量4.19±0.07mg/g和0.96±0.09而言，分别提高了25.53％和677.08％。实施例3所得到的蛹虫草子实体产品中的类胡萝卜素含量为2.61±0.06mg/g，虫草素含量为4.71±0.05mg/g，这相对比作为对照的对比例3得到的蛹虫草子实体产品中的类胡萝卜素含量1.72±0.14mg/g和1.44±0.20而言，分别提高了51.74％和227.08％。实施例4所得到的蛹虫草子实体产品中的类胡萝卜素含量为3.11±0.01mg/g，虫草素含量为3.88±0.06mg/g，这相对比作为对照的对比例4得到的蛹虫草子实体产品中的类胡萝卜素含量1.76±0.16mg/g和0.85±0.07mg/g而言，分别提高了76.70％和356.47％。
Claims (5)
1.一种同时提高类胡萝卜素和虫草素含量的蛹虫草子实体生产方法，包括下述步骤：将蛹虫草菌株接种于蛹虫草栽培培养基中，并按照如下(1)-(4)的顺序进行培养，从而获得类胡萝卜素和虫草素含量提高的蛹虫草子实体：
(1)发菌：温度维持在15-23℃，湿度自然，避光培养4-8天，完成蛹虫草菌株发菌；
(2)原基分化：给予温差刺激，维持白天温度18-23℃，夜晚10-18℃，每天光照10-16小时，光照强度300-2000lux，培养6-12天，蛹虫草子座原基形成；所述温差为24小时内的温差在1-10℃的范围；
(3)子实体生长：于18-23℃条件下，每天光照8-12小时，光照强度300-2000lux，空气相对湿度75-90％，培养10-40天，蛹虫草子实体长至6-10厘米长；
(4)代谢产物积累：维持温度25-30℃，每天光照8-12小时，光照强度300-6000lux，空气相对湿度75-90％，继续培养5-20天；
所述步骤(3)和(4)中，每天经所需光照时长后，再用光强为20-100Lux的Led蓝光灯带补充照射1-3小时。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法的步骤(4)之后，还包括如下步骤：采集所述蛹虫草子实体，采用热风30-40℃烘干或冷冻干燥。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述蛹虫草菌株为如下(a)-(c)中任一种：
(a)蛹虫草菌株岷源I号；
(b)蛹虫草菌株大孢子头北虫草09-888；
(c)蛹虫草菌株小孢子头菌株66。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于：所述蛹虫草栽培培养基由固体基物和营养液按照质量配比为1：(0.5-1.5)的比例混合而成；所述固体基物由质量百分含量为95-99％的谷物和质量百分含量为1-5％的蚕蛹粉混合而成。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述谷物为大米颗粒、莜麦或小麦。
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