KR20020064689A

KR20020064689A - 광조사를 이용한 번데기동충하초의 생리활성 물질 생성향상법

Info

Publication number: KR20020064689A
Application number: KR1020020024044A
Authority: KR
Inventors: 한영환; 김용해; 오정석; 민응기; 곽정훈
Original assignee: 한영환; 신화제약 (주)
Priority date: 2002-05-02
Filing date: 2002-05-02
Publication date: 2002-08-09

Abstract

본 발명은 번데기동충하초(Cordyceps militaris) 균사체에 광을 조사하여 생리활성물질의 생성을 향상시키는 방법에 관한 것으로 기존의 번데기동충하초 자실체를 이용하기 위하여 60일 정도가 소요되는데 비해, 본 발명은 6-7일 정도의 기간만으로 기능성이 부가된 번데기동충하초 균사체를 획득하여 이를 이용 할 수 있다. 본 발명의 방법으로 처리되어 얻어진 번데기동충하초 균사체는 독특한 황색소(카로티노이드)와 증가된 코디세핀(cordycepin) 함량을 가지며, 균사체의 열수 및 에탄올 추출물은 향상된 미백 효과와 항산화 효과를 나타내므로 이를 화장품 원료, 기능성 식품 소재 및 의약품의 원료로 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

광조사를 이용한 번데기동충하초의 생리활성 물질 생성 향상법{Increasement of bio-active substances of Cordyceps militaris by illuminating light}

본 발명은 평판 배양된 번데기동충하초(Cordyceps militaris) 균사체에 광을 조사하여 생리활성물질 생산의 증가시키고, 생성된 생리활성물질을 열수 또는 에탄올 추출하여 생리활성 효과를 증진시켜 이를 화장품 원료, 기능성 식품 원료 및 의약품의 원료로 사용하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 기술된 동충하초는 자낭균강, 맥각균목에 속하며 겨울에는 곤충의 몸 안에 살면서 양분을 흡수하여 곤충을 죽게 한 후 여름에 죽은 곤충의 몸에서 버섯을 만든다는 뜻이다. 동충하초는 곤충기생성 곰팡이의 일종으로 대표적인 속(Genus)으로는 코디셉스(Cordyceps)속, 페실로마이세스(Paecilomyces)속 등이 있으며, 국내 많은 농가에서 대량으로 자실체 배양되어 식품으로 유통되고 있는 종(Species)은 번데기동충하초(Cordyceps militaris) 및 눈꽃동충하초(Paecilomyces tenuipes)가 있다.

이들 중 번데기동충하초에 관해서는 1950년대부터 연구가 시작되어 항세균, 항진균, 항바이러스 및 항종양 활성을 가지는 코디세핀(cordycepin)에 관한 연구가 진행되어 왔으며(Cunningham, K.G., S.A. Hutchinson, W. Manson, and F.S. Spring. 1951.J. Chem. Soc.2299-2300; Anderson, J.M. and R.M. Roth. 1974.Biochim. Biophys. Acta.335(3)285-289; Becker, Y., and U. Olshevsky. 1973.Israel J.Med. Sci.9:1581-1585; Jagger, D.V., N.M. Kredich, and A.J. Guarino. 1961.Cancer Res.21:216-220;), 최근에는 성기능회복에 관한연구(민건우, 박종혁, 윤철호, 정지천, 신억섭, 한영환. 2000.대한한방내과학회지. 21:389-398), 미백효과에 관한연구(출원번호 10-2002-0003259)등 국내·외적으로 번데기동충하초의 다양한 생리활성이 밝혀져 왔다.

그러나 초기에 발표된 논문들과 최근 발표된 몇몇 연구들을 제외하고는 주로 자실체 추출물을 이용한 연구가 대부분을 차지하고 있으며, 또한 1997년 이후에 출원 또는 등록된 번데기동충하초 관련특허 역시 자실체 생성방법에 관한 것이 주를 이루고 있을 뿐(등록번호10-0201051, 등록번호10-0239211, 등록번호10-0288105, 출원번호10-1999-0004301, 출원번호10-1999-0011661, 출원번호10-1999-0039727), 외부자극을 통한 균사체의 생리활성물질(카로티노이드 및 코디세핀)의 생산증대와 추출물의 생리활성도(미백효과 및 항산화효과) 증가에 관한보고는 전무한 상태이다. 특히 번데기동충하초의 자실체를 이용하기 위해서는 60일 이상의 장기배양을 필요로 하기 때문에, 본 발명과 같이 6-7일간 배양된 균사체를 이용하는 기술개발은 의의가 크다고 할 수 있다.

이에 본 발명자들은 평판배지에 6-7일간 배양된 번데기동충하초(Cordyceps militaris) 균사체에 적정기간 광을 조사하여 생리활성물질 생산의 향상을 꾀할 수 있었으며, 특히 본 발명을 통하여 처리된 균사체 추출물의 생리활성도가 증가됨으로써 이를 우수한 화장품제조 원료로, 기능성 식품의 원료 및 의약품의 원료로 사용이 가능하게 되었다.

본 발명의 목적은 광조사를 이용한 번데기동충하초의 생리활성 물질 생성 향상법을 제공하는 것이다. 본 발명에 사용되는 동충하초균은 본 발명자들에 의해서 채집되고 한국농용미생물보존센터(KACC)에 기탁한 번데기동충하초(Cordyceps militarisKACC 93001)이다. 본 발명에 따라 배양되고 처리된 번데기동충하초의 균사체는 열수 또는 에탄올 등 용매를 이용하여 추출물을 획득할 수 있다.

균사체의 배양배지로는 고형평판배지를 이용할 수 있다. 6-7일간 300 ml 삼각플라스크에 50 ml의 Luria-Bertani 평판배지를 제조하여 액체배양된 동충하초를 약 1 ml 정도 접종한다. 접종 후 10-30?? 범위에서 암배양 한다. 균사가 배지 전면에 배양된 후 500-3,000 lux 정도의 형광을 24-48시간 조사한다. 광조사된 균사체는 전면에 황색소를 형성하게 된다. 황색소가 형성된 번데기동충하초 균사체를 30 ml 열수 또는 에탄올로 50-60?? 정도의 온도에서 중탕하여 추출하고 이를 10 ml 로 농축하여 샘플을 제조한다. 대조군(control)으로는 같은 기간 암배양한 번데기동충하초 균사체를 같은 방법으로 추출 및 농축하여 사용하였다.

제조된 샘플을 이용하여 번데기동충하초의 생리활성 물질의 증가를 확인하기 위하여 생산된 총 카로티노이드(total carotenoid)와 코디세핀(cordycepin)의 양을 각각 분광광도계(spectrophotometer)와 HPLC를 이용하여 정량하였다. 또한 생리활성효과의 증대 확인을 위하여 타이로신을 기질로 이용한 미백효과 측정법과 2종의 항산화 측정법(NBT법 및 DPPH법)을 분광광도계를 이용하여 측정하여 대조군과 비교하였다.

이에 본 발명에 관한 자세한 내용은 실시예와 실험예를 중심으로 상세하게 설명하고자 하나, 다음의 실시예에 의하여 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

[실시예1] 번데기동충하초 균사체의 배양

300 ml 삼각 플라스크에 Luria-Bertani 평판배지(효모추출물 0.5%, 트립톤 1%, NaCl 1%, 한천 1.5%, pH 7.0)를 50 ml 제조하였다. 동일한 액체배지에 기 배양된 번데기동충하초(Cordyceps militarisKACC 93001)를 1 ml 제조된 LB 평판배지에 접종하고 습도 50-90%, 온도 10-30?? 범위에서 6-7일간 암배양 하여 배지 전면에 고르게 균사체가 생장하였다.

[실시예2] 생리활성 물질 생산증대 처리법

실시예1과 같은 방법으로 배양된 번데기동충하초 균사는 배지 전면에 백색의 균사를 형성하였다. 여기에 500-3,000 lux의 형광등의 빛을 24-48시간 조사하였으며, 광도의 측정은 INS사의 DX-100 Digital Lux Meter를 사용하였다.

광 처리된 번데기동충하초 균사체는 전면에 황색이 나타났다. 이는 광에 의해 생리활성물질이 생성된 것으로 빛을 조사하지 않은 대조군의 균사체에서는 황색을 띄지않았다.

[실시예3] 생리활성 물질이 생성된 균사체로부터 추출물의 제조

실시예2의 방법을 이용하여 생성된 황색 번데기동충하초 균사체에 30 ml의 에탄을(ethanol)을 넣고 70-100?? 온도로 10-300 분간 냉각 콘덴서가 부착된 장치를 이용하여 추출물을 제조하였다. 제조된 추출물은 다시 농축기를 이용하여 10 ml로 농축하여 추출물 샘플로 하였다. 대조군의 추출물도 같은 방법을 사용하여 제조하였다.

[실시예4] 생리활성 추출물의 총카로티노이드(total carotenoid) 정량

총카로티노이드의 정량법은 김 등의 방법을 이용하였다(김태수, 정명주, 류병호, 주우홍, 박정욱, 정영기. 1999.한국식품영양학회지. 28(6):1239-1243). 즉, 분광광도계(UV-visible spectrophotometer)를 이용하여 400-500 nm에서 스펙트럼을 측정하였다. 최대 흡광파장에서 측정한 흡광도 값을 Davies 공식을 사용하여 총카로티노이드를 정량하였다. Davies 공식은 총카로티노이드(mg%)=(흡광도*Vol*1000)/(흡광계수*균사체무게g)이었으며, 흡광계수 E1%1cm = 2,200을 사용하였다.

[표.1]에 나타난 것처럼 빛을 처리한 번데기동충하초 균사체는 대조군에 비해 1.68배 증가된 총카로티노이드량을 확인할 수 있었다. 즉 빛 조사에 의해 총카로티노이드 생산이 증가됨을 알 수 있었다.

[표.1]

	광조사 처리군	대조군
추출물의 총카로티노이드량 (mg%)	63.89	34.27

[실시예5] 생리활성 추출물의 코디세핀(cordycepin) 생산량 측정

추출물을 막여과기를 이용하여 여과한 후 HPLC를 이용하여 코디세핀을 정량하였다. 분석조건은 [표.2]와 같다.

빛을 처리한 번데기동충하초 균사체는 대조군에 비해 1.27배 증가된 코디세핀농도를 확인할 수 있었으며, 이를 통해 빛 조사가 번데기동충하초 균사체의 코디세핀 생산을 증가시킨다는 사실을 밝혀낼 수 있었다.[표.3]

[표.2 추출물의 코디세핀(cordycepin) 정량을 위한 HPLC의 분석조건]

항목	조건
Column type	GL Sciences Inc. Inertisil ODS-2(4.6*150 mm) C₁₈
Flow rate	1.0 ㎖/min, ABS 260 nm
Mobile phase	K₂HPO₄8.844 g, Tetrabutyl ammonium chloride(T.B.A) 0.32 g, Acetonitrile 20 ml, D.W. 980 ml

[표.3 추출물의 코디세핀(cordycepin) 농도]

	광조사 처리군	대조군
추출물의 코디세핀 농도(mg/ml)	0.307	0.241

[실시예6] 생리활성 추출물의 미백효과 측정

미백효과의 측정법은 멜라닌 색소의 생성 과정인 tyroniase의 활성저하정도를 측정하는 Siegrist의 방법(Siegrist, W., A.N. Eberle. 1986.Anal. Biochem.159:191-197)을 이용하였다. 즉, 0.1 mM 완충용액, 1.5 mM tyrosine, 200 ul 샘플, 100 ul의 tyrosinase을 혼합하고, 분광광도계를 이용하여 기질인 tyrosine이 산화되는 양을 475 nm에서 측정하였다.

광 처리된 균사체에서 tyrosinase 활성의 45%를 저해 하였으나, 대조군은 전혀 저해를 하지 못하였다.[표.4] 본 발명을 통해 배양된 번데기동충하초균사체는 새로운 방법의 미백효과 측정법에서도 대조군에 비해 좋은 결과를 얻을 수 있었다.

[표.4 추출물의 tyrosinase 활성 저해도(미백효과) 측정]

	광조사 처리군	대조군
추출물의 tyrosinase 활성 저해도(%)	45.23	0

[실시예7] 생리활성 추출물의 증가된 항산화효과 측정(NBT 법)

NBT(Nitroblue tetrazolium)를 이용한 항산화 효과의 분석은 빛에 의해 산화되는 riboflavin의 산화정도를 측정하는 김 등의 방법을 사용하였다(김창진, 이형규, 김영호, 김시관, 서영배, 이현석, 윤봉식.1996. 신물질탐색. 자유아카데미 325-349). 즉, 2.6 ml의 40 mM 완충액, 100 ul NBT, 200 ul EDTA/cyanide 및 100 ul의 샘플을 넣고 흡광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 560 nm에서 분당 변화량을 측정하였다.

빛을 처리한 번데기동충하초 균사체의 추출물은 대조군에 비해 1.52배 증가된 활성산소 소거 능력을 나타내었다.[표.5]

[표.5 추출물의 항산화효과 측정(NBT방법)]

	광조사 처리군	대조군
추출물의 항산화효과(NBT법) 활성 (unit)	1.76	1.16

[실시예8] 생리활성 추출물의 증가된 항산화효과 측정(DPPH 법)

0.2 mM DPPH 1 ml 과 샘플 2 ml을 혼합하여 30분간 방치한 후, 산화되는 DPPH의 산화정도를 흡광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 517 nm에서 변화량을 측정하였다(김창진, 이형규, 김영호, 김시관, 서영배, 이현석, 윤봉식. 1996. 신물질탐색.자유아카데미325-349).

광을 처리한 번데기동충하초 균사체의 추출물은 대조군에 비해 1.42배 증가된 활성산소 소거 능력을 나타내었다.[표.6]

[표.6 추출물의 항산화효과 측정(DPPH방법)]

	광조사 처리군	대조군
추출물의 항산화효과(DPPH법) 활성(unit)	60.49	42.65

본 발명에 의해 처리된 번데기동충하초 균사체는 총카로티노이드 및 코디세핀과 같은 생리활성 물질이 증가됨을 알 수 있다. 또한 미백효과와 항산화효과의 활성이 증가된 균사체 및 추출물을 획득할 수 있다.

Claims

번데기동충하초(Cordyceps militaris) 균사체를 고형배지에 온도 10-30??, 습도 50-90%에서 6-7일간 암배양 후 24-48시간 500-3,000 lux의 광을 조사하여 황색의 색소가 확인되는 생리활성물질 생산법.
제1항에 있어 생리활성 물질이 생성된 번데기동충하초 균사체 열수 추출물 제조시 80-121?? 온도로 10-300 분간 열을 가하여 열수 추출물을 제조하는 방법.
제1항에 있어 생리활성 물질이 생성된 번데기동충하초 균사체 에탄올(ethanol)과 같은 유기용매로 70-100?? 온도로 10-300 분간 냉각 콘덴서가 부착된 장치를 이용, 추출물을 제조하는 방법.
제2, 3항에 있어 열수 및 유기 용매 추출물의 미백효과 및 항산화효과를 를 검정하고 이를 화장품의 원료로 사용하는 방법
제2, 3항에 있어 열수 및 유기 용매 추출물의 총 카로티노이드량 및 항산화효과를 정량 및 검정하고 이를 기능성 식품의 원료로 사용하는 방법.
제2, 3항에 있어 열수 및 유기 용매 추출물의 코디세핀를 정량하고 이를 의약품의 원료로 사용하는 방법.