KR20220095540A - 번데기 동충하초의 재배 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 번데기 동충하초(Cordyceps militaris)의 재배 방법에 관한 것으로써, 좀 더 상세하게는 번데기 동충하초의 재배시 오염원을 줄이고, 발이가 잘 되도록하여 자실체의 생산량을 증대시키기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의하면 번데기 동충하초의 오염원을 줄이고, 계대배양 후 번데기 동충하초의 자낭포자에 빛을 조사하여, 흰색 균사와 노란색 균사를 포함하는 자낭포자로 부터 희석평판배양방법에 의하여 순수분리 배양한 황색 또는 노란색 균사를 포함하는 균사만을 선별하여 후속 배양함으로써 번데기 동충하초의 자실체의 생산량을 증대시킬 수 있다.

Description

번데기 동충하초의 재배 방법{Process for cultivating Cordyceps militaris}

본 발명은 번데기 동충하초의 재배 방법에 관한 것으로써, 좀 더 상세하게는 번데기 동충하초의 재배시 오염원을 줄이고, 발이가 잘 되도록하여 자실체의 생산량을 증대시키기 위한 방법에 관한 것이다.

번데기 동충하초(Cordyceps militaris)는 분류학적으로 자낭균문 자낭균강 맥각균과에 속하며 번데기 동충하초속 즉, 코디셉스속(Cordyceps sp)에 속하는 버섯으로 예로부터 인삼, 녹용과 더불어 3대 보약의 하나로 알려져 왔으며, 세계적으로 300종, 우리나라는 20종 정도 분포하고 있으며, 현재 시넨시스(Cordyceps sinesis), 번데기 동충하초(Cordyceps militaris), 눈꽃 동충하초(Isaria japonica) 등 크게 3가지가 유통되고 있는 약용버섯이다.

이러한 번데기 동충하초는 고대로부터 중국에서 결핵, 천식, 황달의 치료 및 아편중독의 해독제, 병후의 보양 및 강장제, 면역기능 강화제로서 이용되어 온 고가의 한방 약재이다.

지금까지 알려진 동충하초의 인공재배방법은 동충하초가 곤충을 기주로 하여 자실체를 형성하는 방법이 주로 알려져 있는데, 그 예로, 대한민국 특허공개공보 제1998-023907호, 특허공개공보 제10-2004-0032001호, 특허등록 공보 제10-0443200호, 특허공개공보 제10-1998-0033558호 등은 곤충을 이용하여 동충하초 자실체를 생산하는 방법을 개시하고 있다.

그러나, 일반 농가에서는 오염원의 관리 등의 문제점들이 있어서 자실체의 증산을 위한 방안들이 여전히 지속적으로 요구되고 있다.

한국 등록번호 제10-0432472호(2004년05월11일) 한국 등록번호 제10-0610983호(2006년08월02일) 한국 등록번호 제10-2123594호(2020년06월10일)

본 발명자들은 위와 같은 종래 기술에 따른 문제점들이 해소되고, 자실체의 생산량을 증대시키기 위하여 예의 연구하던 중, 번데기 동충하초의 재배시 오염원을 줄이고, 자실체의 생산량을 증대시키기 위하여 계대배양 후 번데기 동충하초의 균사에 빛을 조사하게 되면, 흰색 균사와 노란색 균사를 포함하는 자낭포자에서 유래된 황색 또는 노란색 균사를 포함하는 배양액에서 희석도말방법을 이용하여 인접된 균사와 겹침이 없이 분리된 작은 조각의 균사에서 무작위적으로 1 Colony를 분리하여 이식배양하여 일정시간이 지날 때까지는 암배양으로 균사를 증식하고, 이후 명배양을 진행하면, 흰색 그대로 유지되는 균사와 노란색(최종적으로 노란~주황색)으로 변하는 균사로 분리되는 기법을 이용하여 흰색 균주를 배제하고 노란색(최종적으로 노란~주황색)의 단일 콜로니를 선별하여 후속 배양함으로써 번데기 동충하초의 자실체의 생산량을 증대시킬 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서, 본 발명의 목적은, 일면에 있어서, 번데기 동충하초의 재배시 오염원을 줄이고, 자실체의 생산량을 증대시키기 위하여 계대배양 후 번데기 동충하초의 자낭포자에 빛을 조사하여, 흰색 균사와 노란색 균사를 포함하는 자낭포자로부터 황색 또는 노란색 균사를 포함하는 균사만을 희석 도말법에 의해 선별하고 흰색 균주를 배제하여 단일 콜로니를 선별하여 후속 배양함으로써 번데기 동충하초의 자실체의 생산량을 증대시킬 수 있는 번데기 동충하초의 재배방법을 제공하는 것에 있다.

위와 같은 본 발명의 목적은

번데기 동충하초를 계대 배양하는 단계;

배양 후 번데기 동충하초의 자낭포자에 빛을 조사하는 단계;

흰색 균사와 노란색 균사를 포함하는 자낭포자로 부터 황색 또는 노란색 균사를 포함하는 균사만을 희석 도말법에 의해 선별하고 흰색 균주를 배제하여 단일 콜로니를 선별하는 단계; 및

선별된 콜로니가 우점된 상태에서 배양을 지속하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 번데기 동충하초 자실체의 단위 생산량을 증대시키는 방법에 의해 달성될 수 있다.

본 발명에 의하면 번데기 동충하초의 오염원을 줄이고, 계대배양 후 번데기 동충하초의 자낭포자에 빛을 조사하여, 흰색 균사와 노란색 균사를 포함하는 자낭포자 또는 조직분리에서 유래된 것으로 부터 황색 또는 노란색 균사를 포함하는 균사만을 희석 도말법에 의해 선별하고 흰색 균주를 배제하여 단일 콜로니를 선별하여 후속 배양함으로써 번데기 동충하초의 자실체의 생산량을 증대시킬 수 있다.

도 1은 본 발명의 번데기 동충하초 자실체의 단위 생산량을 증대시키는 방법의 공정도이다.
도 2는 실시예 1에 따른 시료의 자실체의 형태를 나타내는 사진이다.
도 3은 야생 주에서 포자가 낙하하여 발아된 균사색의 차이를 나타내는 사진이다.
도 4는 포자로부터 분리된 이후 독립 Colony를 다시 이식한 상태의 평판배지에서 균사를 나타내는 사진이다.
도 5는 독립 콜로니를 분리한 사진이다.
도 6은 핀발이 직전 및 직후의 모습을 나타내는 사진이다.
도 7은 생육 상태에 따른 판배지 상에서 자실체의 사진이다.
도 8은 판바구를 이용하여 재배 종료된 생 자실체 수량(g)을 나타내는 사진이다.
도 9는 현미경용 1 Slide glass의 검경(대물렌즈 100X, 유침)할 횟수 설명도이다.
도 10은 오염균을 나타내는 사진이다.
도 11은 눈꽃 / 번데기 동충하초 균주의 특성 및 제조에서 발생되는 오염 유발 원인균의 형태에 대한 사진이다.
도 12는 우장지 버섯 균사를 나타내는 사진이다.
도 13은 번데기 동충하초에서 2종 균사의 분리 일례를 나타내는 사진이다.
도 14는 번데기 동충하초에서 2종 균사의 분리한 다른 예를 나타내는 사진이다.
도 15는 번데기 동충하초에서 2종 균사의 분리한 다른 예를 나타내는 사진이다.
도 16은 번데기 동충하초에서 2종 균사의 분리한 예를 나타내는 사진이다.
도 17은 삼각액 배양을 진행함에 있어서, 현미경 배율에 따른 균사 및 자낭포자 신장 중인(변형) 형태를 나타내는 사진이다.
도 18은 번데기 동충하초 액배양 중의 혼입된 특이한 오염균 형태를 나타내는 사진이다.
도 19는 오염에 관련되어 있는 극미세 균주를 나타내는 사진이다.
도 20은 버섯 부패 유발 원인균류와 초미세 균류의 크기 비교한 사진이다.
도 21 및 22는 부패 유발성 미세균류의 사진이다.
도 23은 본 연구에서 발이가 잘되고 수량성이 입증된 Line 중에서 2개를 선별하여 다시 희석평판분리 방법에 의하여 확인하였을 경우에 냉장 저장 이후 오랜시간이 지난 후에도 Mono Spore 유래의 노란색 균사 형의 Lot에서는 역시 대부분 노란~주황색의 균사가 나타난 것을 설명하는 사진이다.
도 23은 오랜 기간동안 냉장 저장한 후에도 Mono Spore 유래의 노란색 균사를 보이는 Lot에서는 역시 노란색의 균사를 보이는 것을 설명하는 사진이다.
도 24는 독립 colony를 새로운 배지에 이식한 후 암배양 초기 사진이다.
도 25는 독립 colony를 새로운 배지에 이식한 후 명배양 진행을 나타내는 사진이다.
도 26은 독립 colony 중의 흰색 균사의 출현을 나타내는 사진이다.
도 27은 Petri Dish에 이식 후 배양 8일째(암배양) 이후 빛 조사(명배양)하여 배양 진행 중인 균사 상태를 나타내는 사진이다.
도 28은 독립 콜로니의 배양 과정을 나타내는 사진이다.
도 29는 초발이 증상을 확인하는 사진이다.

본 발명은, 일면에 있어서,

번데기 동충하초를 계대 배양하는 단계;

배양 후 번데기 동충하초의 자낭포자에 빛을 조사하는 단계;

흰색 균사와 노란색 균사를 포함하는 자낭포자로부터 황색 또는 노란색 균사를 포함하는 균사만을 희석 도말법에 의해 선별하고 흰색 균주를 배제하여 단일 콜로니를 선별하는 단계; 및

선별된 콜로니가 우점된 상태에서 배양을 지속하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 번데기 동충하초 자실체의 단위 생산량을 증대시키는 방법을 제공한다.

본 발명은, 추가의 일면에 있어서,

상기 계대 배양하는 단계는 모균주로 부터 분리된 조직을 이용하여 수행함으로써 계대 배양을 최소화하는 것을 특징으로 하는 번데기 동충하초 자실체의 단위 생산량을 증대시키는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 실시예와 도면에 기재된 구성은 가장 바람직한 일례의 실시예에 불과할 뿐이고, 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원 시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등과 변형 예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.

이하, 본 발명에 따른 번데기 동충하초의 자실체의 단위 생산량을 증대시키는 방법에 관하여 첨부된 도면을 참고로 더욱 상세히 설명한다.

도 1은 본 발명의 번데기 동충하초 자실체의 단위 생산량을 증대시키는 방법의 공정도이다. 도면에서 나타낸 바와 같이 본 발명의 자실체의 단위 생산량을 증대시키는 방법은 계대 배양 단계, 광조사 단계, 선별 단계, 후속 배양 단계, 수확 단계 및 포장 단계를 포함한다.

본 발명에 의하면 번데기 동충하초재배에서의 공정개선으로 계대 배양에서 흰색의 균사를 배제하려는 노력에 의해 자실체의 단위 생산량이 증가될 수 있다.

본 발명자들에 의하여 번데기 동충하초 균주를 계대배양 후 배양초기에 암배양을 진행하면 흰색의 균사가 증식되며, 일정 크기로 증식된 흰색의 균사에 형광등의 빛을 조사하면, 시간이 지남에 따라 배양초기에 흰색의 균사가 빛조사에 의하여 흰색 그 상태로 남는 것과 노란색으로 착색되는 2가지 형태의 균사 색을 나타내는 특성이 있음이 밝혀졌다.

번데기 동충하초 재배에서 포자 유래의 종균이나 조직분리 유래의 균사에는 조밀하게 밀접된 상태에서 다수의 포자(Multi Spore)가 발아(깨어나)하여 균사화로 진행된 것으로 그 기원은 Multi Spore 상태로 균사체가 서로 혼재된 상태로 배양이 이루어진다. 이 경우 균사 배양에는 문제가 없어 보이나 발이가 되지 않는 흰색의 균사가 혼입되어 있어 자실체 수가 적어지는 문제가 있다.

동일한 단위에서 자실체의 발이 수가 많아지도록 하려면 흰색 균사와 노란색 균사가 혼입되어 있는 것을 각각 분리해서 노란색의 균사의 것을 사용하는 것이 바람직하다.

대량 재배 현장에서 노란색 균사에 흰색의 균사가 혼입되어 있는 상태에서 재배할 때, 초기 발이과정부터 자실체 발이수가 적어지고, 발이가 더 늦어지게 되며, 흰색의 균사가 더 빨리 증식되어 배지 상부를 덮게 되어 발이가 잘 되지 않는 문제가 있다.

대부분의 농가에서 번데기 동충하초(Cordyceps militaris)는 계대를 수행할 때마다 흰색의 균사가 우점해 가는 과정에 있는 것이 통상의 경우이므로, 종균관리에서 계대배양을 가급적 지양하고, 연속 계대방법보다는 우수한 특성을 갖는 균주에 대하여 소용량의 액배양을 진행한 다음 이의 배양액을 10% Glycerol 또는 10% SDS 용액을 필터링(멸균처리)하여 저온 보관하거나 가장 좋게는 -196℃의 액체질소에 종균을 보관하는 방법을 이용하는 것이 좋다.

통상의 PDA배지와 같은 고체 배지에서는 균사에서 균사로 증식하는 것으로 보이지만, 일련의 다음 단계의 액배양을 진행하게 될 때에 확연하게도 균사에서 발생된 자낭포자가 무수하게 생성되며 발생된 자낭포자가 균사로 신장되면서 점점 균사 및 균사체로 진행된다.

종균제조 과정에서 포자분리 또는 조직분리에 의하여 얻어진 균사를 액체 배양하고 이를 균질화하여 독립 Colony를 유도할 때 처음에는 암배양, 후에는 명배양을 진행하게 되면, 흰색 균사와 노란색 균사로 나타난다. 이 때에 노란색으로 변하는 독립 Colony를 선별하여 사용하면 된다.

특히 흰색 균사는 균사 증식속도는 빠르나, 자실체를 생산하지 못하는 것이므로 희석도말법으로 독립된 군락에서 분리한 균총에서 노란색의 균사를 사용하면 좋다.

이러한 방법에 의하여 번데기 동충하초(Cordyceps militaris)의 흰색 균주를 배제하여 단일 콜로니를 선별하여 후속 배양함으로써 자실체의 생산량을 증대시킬 수 있다.

본 방법에 의하여 노란색의 단일한 상태를 보이는 것도 있지만 간혹 노란~주황색의 균사 사이에 흰색의 균사가 불쑥 튀어 나오는 등의 변이된 균사상이 존재한다. 하지만, 본 방법에 의하여 1차 선발된 노란색 균주에서 다시 희석평판방법에 의하여 분리하였을 경우에는 비교적 거의 대부분이 노란색 균사의 것이 나오는 것으로 확인되었다. 이는 야생에서 수집분리하는 과정에서 포자분리 또는 조직분리할 때에서 다수의 포자(Multi Spore)에서 유래되는 것이 문제가 되는 것으로 판단되고 있다.

따라서 1차적으로 확실하게 선발될 경우에는 이후의 계대에서 노란색을 선발할 경우에 이후에서도 안정적으로 노란색의 균사로 유지될 가능성이 커서 안정적인 자실체 발이가 기대된다.

계대 배양 단계

번데기 동충하초의 계대 배양은 농가에서 보관 중이거나 새로이 채집한 균주를 사용할 수 있고, 통상의 배지를 이용하여 페트리 디쉬, 플라스크, 병배양, 판배양, 또는 바구니 배양 등을 통하여 수행할 수 있다.

계대 배양은 후술하는 바와 같이 모균주로 부터 세대의 계대를 최소화한 것을 이용하는 것이 바람직하다.

기타 배양 조건은 번데기 동충하초의 재배에 관련된 공지의 방법들을 채용하여 바람직하게 수행할 수 있다.

본 발명에서는 삼각프라스크에서 액체 배양할 때에 균사의 증식은 접종 이후 다음날에 확인시 균사에서 균사로 증식이 아니라 균사에서 최초에는 자낭포자를 발생하고 이 자낭포자로부터 대부분의 균사가 증식되는 것을 확인하였으며, 이러한 균사를 분리하여 보았을 때에 흰색:노란~주황색으로 변하는 비율이 약 13~16% : 87~84% 로 나타났다.

따라서 번데기 동충하초 재배에서 균주의 계대배양을 최대한 억제해서 재배할 경우에 자실체의 수량이 증가되는 것을 확인하였다.

광조사 단계

삼각액에서 균사 배양이 진행될 때에 번데기 동충하초의 접종원은 균사 몇 조각이며, 이 접종원에서 처음에 증식되기 시작하는 것은 도 11에서와 같이 수 많은 자낭포자 형태로 발생되어 균사화가 진행되며, 이러한 배양과정에서 큰 균사체 덩어리를 작게 분리하기 위하여 배양액을 고속균질기를 이용하여 10,000~ 12,000rpm의 속도로 균질화하고, 이를 멸균수에 각각 희석도말법으로 각각 1/10량씩 희석한 후 희석한 액을 각각의 페트리 디쉬에 도말하거나 각각의 희석배수의 일정량을 페트리 디쉬의 표면에 부은 후 액을 모두 버리고, PDA 상부 표면의 물기를 말리기 위하여 크린벤치 내부에서 송풍량에 의하여 건조하게 된다. 이후 희석한 각각의 페트리 디쉬의 측면을 테이핑하여 배양하고, 1~3일 이내에 독립된 조그만 균사상을 각각의 독립 Colony를 떼어내어 도 4, 도 5와 같이 페트리 디쉬에 각각의 독립 Colony를 이식하게 된다. 이식된 Colony가 증식하여 하얀 균사 직경이 0.5~2.0cm로 되면, 이후에 빛(예, 형광등)을 조사하게 된다. 번데기 동충하초 균사배양에서 빛을 조사하게 되면, 흰색의 균사와 노란색의 균사로 변하는 특성이 있다. 이때의 빛은 흰색의 형광등 또는 주광색 계열의 LED 빛을 조사한다. 시간이 지나면서 점점 광조사에 의해 흰색 균사와 노란색 균사로 확연하게 구분이 가능해진다.

종래의 재배 방법에서는 무수히 변이가 발생하는 자낭포자가(예, 흰색 균사/노란색 균사) 2종류로 혼입된 상태에서 재배하게 될 때에 균사배양에서 빛을 조사하면서 배양하게 될 때에 자실체의 발이가 잘 되지 않는 흰색의 균사와 자실체로 발이가 잘 되는 노란색의 균사가 존재한다. 이러한 추정은 자실체가 초기 발아할 때에 흰균사가 많아지면 자실체 발이 수가 적어지고, 생육에서도 흰색의 균사가 우점하게 되는 경험적인 것으로 확인된 바 있다. 흰색의 균사가 상부에 막을 형성하게 되면 자실체가 적게 나오거나 아예 방해가 되어 자실체 수가 줄어드는 것이 확인되었기 때문이다.

선별 단계

자낭포자로부터 얻어진 균사는 희석 도말법을 이용하고, 각각의 독립 Colony를 배양할 때에 빛을 조사하여 흰색 균주를 배제하여 황색 또는 노란색 균사를 포함하는 균사만을 선별한다.

후속 배양 단계

황색 또는 노란색의 선별된 콜로니가 우점된 상태에서 배양을 지속한다.

수확 단계 및 포장 단계

상기 언급된 바와 같이 선발된 접종원은 삼각액을 60~150L의 대용량에서 배양한 액종균[(액종균의 영양원은 설탕 3%+대두박 1%+MgSO₄/KH₂PO₄각 0.5%+Antiform 204(Sigma Aldrich A-6426) 2ml ]을 접종하고, 배지 1병에 접종하는 종균량은 15~30ml 정도를 고압분사하여 현미배지의 상부표면에 골고루 접종한다. 현미배지인 경우 초기부터 명배양하여 배양하며, 온도 24℃에서 배양기간은 약 12~15일 정도이고, 진한 붉은 색의 자실체 발이 증상이 보이게 되면, 생육실로 이동하여 온도 16~18℃에서 초기 가습이 85~95%의 상대습도를 유지하고 뚜껑은 발이가 되어 자실체 크기가 2~3cm 정도일 때에 개방하여 진행하며 접종 후 수확시기는 대략 40~55일까지 안정적으로 생육이 가능하다. 사용하는 배지로는 누에, 번데기, 현미, 귀리 등을 이용하여 재배하게 되며, 배양이 완료된 번데기 동충하초 자실체는 수확한 후 필요한 크기로 포장한다.

대략 1병의 850ml PP병에는 현미배지(현미 80g+물 110ml)에서 기존방식으로의 종균관리를 해서 재배할 경우, 자실체 수량은 약 40~45g 수준이고, 계대배양을 최소화한 상태에서 빛 조사할 때에 고른 노란색 균사가 최대한 많이 보이는 균사를 이용한 접종원만을 사용할 경우에 개선된 방법에 의한 재배시 약 60g 정도의 자실체를 얻을 수 있었다.

따라서, 다음의 기준에 의하여 번데기 동충하초 재배시 종균 관리를 할 필요가 있다.

1. 야생 채집의 균주로부터 무균적으로 분리되어야 한다.

2. 최초 포자 분리시에는 특히 단일 Colony로부터 유래된 균사를 이용한다.

3. 잡균의 혼입여부에 대한 오염검사를 실시하고, 오염균을 지속적으로 관리 제어하도록 한다.

4. 유전적인 안정성을 위하여 다수의 교잡을 병행하여 이중에서 형질이 우수한 Colony를 획득하고 유전적으로 안정화된 상태로 계대 배양에서도 변이가 되지 않아야 한다.

5. 번데기 동충하초는 불완전 세대를 포함하는 균주이므로 자낭포자의 증식 및 변형에 유념하여야 한다.

6. 수차례에 걸친 분석에서 번데기 동충하초에서는 일반적인 버섯균사와는 달리 액배양에서 자낭포자에 의하여 중식되고 있으며, 이러한 자낭포자의 생성에서 무수하게 발생되는 포자는 유전적인 결함으로 판단되는 것으로는 특이하게도 균사증식 후에 빛을 주었을 경우에 흰색 균사 그대로인 것과 노란색 균사로 변하는 것이 있다. 이러한 균사색 변화에 의하여 확인 된 바에 의하면, 흰색 균사는 발이가 되지 않는 것이 확인되었고, 노란색으로 변하는 균사는 발이가 되는 것이 확인되었다. 이러한 상태에서 자실체의 수가 많이 발아되어야 풍성한 버섯을 수확할 수 있는 것이 확인됨에 따라 흰색 균사와 노란색 균사의 비율을 검토하게 되었다. 이러한 과정에서 순수분리된 독립된 Colony 중에서 흰색 균사와 노란색 균사의 비율은 대략 85~87%:1로 확인 되었으며, 이러한 흰색 균사와 노란색 균사를 대치 배양한 결과 흰색 균사가 월등한 증식 속도를 나타내고 있어서 비율은 적지만 초기 증식한 이후에는 발이가 되는 노란색 균사의 증식속도를 훨씬 앞지르게 되는 것이 확인되었다. 따라서 계대배양을 진행하여 흰색의 균사가 포함된 균사를 사용하게 될 경우에 점점 더 발이되는 비율이 낮아지게 되는 현상을 보이는 것이 확인되었다.

7. 이러한 현상을 확인하기 위하여 ① 기존에 사용하던 균주로부터 시도하였고, ② 야생채집 균주[L형(Large 번데기 유래), M형(Middle 번데기 유래)]의 2개체에서 Multi Spore(다중 포자) 분리로부터 시도하였는 바, 계대를 진행할 때마다 흰색균을 나타내는 독립 Colony 유래의 것: 흰색균을 나타내는 독립 Colony 유래의 것에서 흰색 균사와 노란색 균사의 비율은 대략 15~13% : 85~87%로 확인되었다.

8. 따라서 번데기 동충하초의 변이를 최대한 방지하기 위하여는 순수분리된 노란색을 갖는 인자의 독립 Colony를 분리해서 사용해야 하며, 가급적 계대배양 횟수를 줄이도록하여 균주를 관리하고 재배되어야 한다. 이처럼 야생채취 후 최초 포자분리 및 조직분리할 때에 Multi Spore로부터 유래될 경우에는 계대를 하게 되면, 2종의 자낭포자에서 유래된 균사가 혼입되고, 이후에는 흰색의 균사 증식이 빠르게 진행되는 문제가 있으므로 발이를 잘 시킬 수 있도록 하기 위하여 계대배양 횟수를 줄이는 노력이 필요하며 이를 위하여는 10% Glycerol, 10% SDS, 10% PEG 멸균용액이 함유된 멸균 수용액을 조제하여 -196℃의 액체질소에 저장하는 방법이나, -70℃의 저온저장고에 저장하여 사용하는 것이 안정적이고, 수량을 증대시킬 수 있는 최적의 방법이라 할 수 있다. 그리고 4~8℃ 냉장보관하는 통상의 버섯균주 보관하는 것과 연속 계대배양하는 것은 지양해야 할 것이다.

9. 일단 Multi Spore 유래한 것에서 순수분리하여 Mono Cell 유래의 것은 노란색의 단일한 균사색과 발이가 잘 되는 종균 Line을 선발하여 확보되면 오랜기간 동안 저온 저장한 평판의 균사로부터 다시 희석평판방법으로 또 다시 분리한다하더라도 이후에는 비교적 단일상의 균사를 갖는 것이 입증되었다.

<실시예>

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명하다.

본 실험 및 후속 실험에 사용한 재료는 다음과 같다: 미생물 조작에 필요한 Autoclave, 크린벤치, 토치램프, 메스대(날), 파라필름, PDA 평판배지: PDA 24g/1L, Petri Dish 직경 90mm 1회용 멸균 제품, 삼각액 배지 조성: 설탕 3%+펩톤 0.5%+대두박 0.5%+MgSO₄/KH₂PO₄ 각 0.5%, 희석에 사용할 멸균수 9ml/Tube, 고속균질기: 막대형 분리형 칼날(무균상태), 균이식 도구, 피펫, 75% 에탄올, 꺼즈, 면전 솜, PDA 평판배지는 전날에 조제하여 뚜껑 내부에 습기가 서려있지 않은 상태로 유지하고, 실험 및 조작 방법은 통상의 미생물 배지 조제 방법에 준하여 수행하였다.

실시예 1: 자낭포자에서 유래한 흰색과 노란색의 균사 비율 시험

계대 배양 횟수를 알 수 없는 상태에서 E 농장에서 재배 중인 번데기 동충하초(Cordyceps militaris)의 자실체 생육 중에 Multi Spore 상태로 조직 분리된 평판의 페트리 디쉬에서 흰균사와 노란색 균사의 비율 검사하였다.

균사의 색은 페트리 디쉬에서 계대배양한 후 직경이 5.0cm 이상인 평판에서 배양하고 빛을 주었을 때에 균사의 착색되는 특성을 이용하여 실험을 진행하였다.

삼각액 배양(250~300ml/500ml 삼각프라스크)에 균사를 4~5조각을 넣고, 온도 24℃에서 4~5일 동안 진탕배양(130rpm)하여 액체 균사 배양액을 얻었다. 삼각 프라스크 내의 균사를 고속균질기(10,000~12,000rpm)를 이용하여 균사를 작게 파쇄한 다음 희석 평판 방법으로 희석(1/10, 1/100, 1/1000, ....)하여 각각의 희석 액을 준비된 페트리 디쉬 평판에 부은 후 페트리 디쉬의 뚜껑을 얼여둔 채 크린벤치 내에서 풍량에 의하여 배지 상부의 물기를 제거하였다.

각각의 페트리 디쉬를 표식한 다음 상하를 결합하여 파라필름으로 밀봉하고, 페트리 디쉬를 뒤집어서 항온 배양기에서 균사 배양을 지속하였다. 2~3일째에 독립된 미세한 균사를 무작위적으로 1개씩 떼어내어 각각의 새로운 페트리 디쉬 평판배지에 1개씩(또는 여러개씩) 이식하고, 페트리 디쉬에 균이 증식하여 직경 50mm 이상이 될 때에 빛을 조사하고, 흰색과 노란색의 균사를 구분한 다음, 흰색 균사 비율과 노란색 균사의 비율을 검토하였다.

1/10량씩 11회까지 희석 도말하여 각각의 액을 페트리 디쉬의 평판에서 1~3일 동안 배양하여 독립되어 나온 Colony를 무작위로 분리해 내어 새로운 배지의 각 Petri Dish에 이식하여 배양하고, 균사의 평균 직경이 50~60mm로 진행할 때까지는 암배양하고 이후에는 빛을 주어 변색되는 상태로 다음과 같이 평가하였다.

페트리 디쉬의 평판배지(또는 Test Tube의 사면배지)에 배양된 균사로 빛을 조사하여 대부분의 색은 노란색의 균사상이나, 간혹 표면에 흰균사로 코팅된 상태의 균을 확인하였다.

표 1은 E농장 유래의 번데기 동충하초(C. militaris) 균주에서의 자낭포자의 희석도말 후 독립 Colony 색 차이를 비율(%)로 나타낸 것이다.

	Yellow Colour(갯수)	Y-W Colour(갯수)	White Colour(갯수)
E 유래2 Petri Dish	5	2
E 유래3 Petri Dish	4	3
E 유래4 Petri Dish	4	3	일부 폐기
E 유래5 Petri Dish	9	0
E 유래6 Petri Dish	8	2
E 유래7 Petri Dish	9	1
E 유래8 Petri Dish	10	0
E 유래9 Petri Dish	9	1
E 유래10 Petri Dish	10	1
E 유래11 Petri Dish	11	2
E 유래12 Petri Dish	11	2
E 유래13 Petri Dish	11	2
E 유래14 Petri Dish	9	2
E 유래15 Petri Dish	9	2
E 유래16 Petri Dish	10	1	폐기
E 유래17 Petri Dish	8	2
독립 Colony 수 합	137	26	163
균사 색의 비율	84.1%	15.9%	100

실시예 2: E 농장 유래의 번데기 동충하초 : (표식 1208) 조직분리한 자실체 형태

실시예 1에 따른 재배병으로 부터 자실체 조직 분리하고, 조직 분리한 자실체의 형태를 확인하였다. 도 2는 자실체의 형태를 나타내는 사진이다. a)는 재배병으로 부터의 자실체를 나타내는 사진이고, b)는 조직 분리시 자실체의 크기를 나타내는 사진이며, c), d)는 E 농장의 자실체로부터 분리된 균사의 형태로 흰색의 균사가 혼재되어 있는 상태를 나타낸다.

자실체의 발이가 비교적 약하지만 발이되는 수가 아주 많은 형태의 것으로 부터 조직분리하고, 분리된 균에서 삼각 프라스크의 액체 배양을 하고, 상기 언급된 방법에 의하여 희석평판 방법으로 분리된 독립 Colony를 다시 1개의 페트리 디쉬에 이식하여 균사를 배양하고 일정 크기(직경 50~60mm)가 될 때에 빛을 조사하여 확인한 바 균사에서도 노란색 균사와 흰색의 균사가 있었으며, 이 중에서 노란색 균사가 많은 것 만을 골라서 사진 기록을 남겼을 경우에도 역시 흰색의 균사가 혼입된 상태로 확인되었다.

실시예 3: 야생 종에서 균사색의 차이 확인 시험

2017년 7월 29일에 충북 괴산군에서 2개의 야생 번데기 동충하초를 채집하고, 이를 L형과 M형으로 구분한 후 포자를 분리하여 특성을 평가하였다. 도 3은 야생 주에서 포자를 낙하시켜 발아된 균사색의 차이를 나타내는 사진이다. a) 괴산군에서 채집된 야생 번데기 동충하초 2종, b) 야생 채집균 M형(고치없는 통상의 번데기), c) 야생 채집균 L형(고치 속에 큰 번데기), d) 자실체를 외측 상부에 붙인 상태, e) 돌려서 낙하된 포자 비문

야생채집의 M형(Middle 번데기) 유래

Multi Spore 군락 유래 독립 Colony 분리 후 Yellow Cell과 White Cell의 비율 파악을 위하여 No. M2 Petri Dish에서 낙하 포자 균의 독립 Clony를 카운팅하고 그 결과를 표 2에 나타내었다.

Tube 희석	M2-5	M2-6	M2-7	M2-8	M2-9	M2-10	M2-11	독립 Colony 수(개)
809-1Cell Counting-PDB+A	66	11	7	3	0	0	0	151
809-1Cell Counting-PDA	60	4	0	0	0	0	0
Total 1Cell Counting	M2-2P 유래 독립 Colony
809-이식된 1 cell Colony 수	Petri D.에서의 형상 평가: 전반적 양호한 균사상/Colony 규모가 큰 편

포자를 낙하시킬 경우 야생으로부터 채집해 온 상태이므로 어느 순간에 포자가 낙하할지 알 수 없는 상황이므로 자실체를 페트리 디쉬의 상부에 붙인 후 임의의 일정시간 간격으로 하부 PDA배지 위치를 돌려서 떨어지는 포자가 분산되어 발아되도록 여러 개의 페트리 디쉬의 평판을 이용하였다.

이어서, M형 유래한 독립 Cell의 Yellow Cell과 White Cell의 비율 파악을 위하여 균사배양 5일째부터 빛조사 실시하고, 평가 가능한 독립 Colony 수를 카운팅하고 그 결과를 다음의 표 3에 나타내었다.

	M0-1	M0-2	M0-3	M0-4		M0-5	M0-6	M-1	M-2		M-3	각 합
Yellow-Mono Colony = 86.7%	4	11	4	4		10	8	56	50		23	170
White-Mono Colony =13.3%	0	1	0	0		5	4	16	0		0	26
M 포자 유래	Yellow-Mono Colony(개)				White-Mono Colony(개)					균사색 비율(%)
Yellow-Mono Colony	170									86.7
White-Mono Colony					26					13.3

상기 표 3의 결과로 부터 황색 콜로니의 비율은 86.7%, 이고 흰색 콜로니의 비율은 13.3%인 것으로 확인되었다. 도 4는 포자로부터 분리된 이후 독립 Colony를 다시 이식한 상태의 평판배지에서 균사를 나타내는 사진이다. a) L형 : 빛 조사 전의 분리 균사, b) L형: 빛 조사 이후의 흰색과 변색 균사, c) M형/L형 독립 Colony 분리하는 예.

야생채집의 L형(Large 번데기) 유래

Multi Spore 군락 유래 독립 Colony 분리 후 Yellow Cell과 White Cell의 비율 파악을 위하여 L4-2Petri Dish에서 낙하 포자 균의 독립 Clony를 카운팅하고 그 결과를 표 4에 나타내었다(L4 = 여러 자실체 중에서 자실체 4번째의 것).

Tube 희석에서의 독립 Cell 확인 예	L4--5	L4--6	L4--7	L4--8	L4--9	L4--10	L4--11
독립 Colony 분별 가능여부 및 수량	너무 많음 분리 못함	너무 많음 분리 못함	5	3	0	0	0
배양 5일째- L 계통 유래, 1 Cell Colony의 Counting & 빛 조사	65	18	6	6	2	0	0
L4-2Petri Dish 유래의 독립 Colony 수	105(개)
페트리 디쉬 상의 균사 형상 평가	표식 예; 83EA/8 Petri D. :: 전반적 몽실몽실(오글오글)형 균사상/Colony 크기가 작은 편

이어서, 9일째에 Multi Spore L4-삼각 플라스크를 희석 도말하고 평가 가능한 독립 Colony 수를 카운팅하고 그 결과를 다음의 표 5에 나타내었다.

L 포자 유래	L0-1		L0-2	L0-3	L0-4		L1	L2	L3		1 Colony (개)
Yellow-Mono Colony	340						60	76	1		477
White-Mono Colony	62						5	14	8		89
100%
M 포자 유래		Yellow-Mono Colony(개)				White-Mono Colony(개)				균사색 비율(%)
Yellow-Mono Colony		477								84.3
White-Mono Colony						89				15.7

번데기 동충하초(C. militaris)의 1 Cell을 분리하여 배양한 바에 의하면, 본 시험 이전에도 노란색 균사가 대다수인 상태에서 흰색의 균사는 그 비율이 적은 상태이므로 눈에 잘 띄지 않은 상태에서 발이를 진행할 경우에 다소 자실체 수는 적지만 발이가 되었다. 그러나, 하지만 본 시험에서 밝혀진 바와 같이 흰색의 균사는 자실체의 발이와는 무관한 상태의 것이고, 처음 시작은 적은 수의 균사이므로 열세에 있으나 배양 후기 또는 생육과정에서는 증식속도가 더 빠르게 진행되므로 흰색의 균사가 더 잘 보이게 되었다. 이러한 현상은 계대 배양을 진행 할 때마다 새로이 왕성하게 유지되는 것이 반복될 때에 흰색의 균사가 점점더 우점하게 되는 원인인 것으로 보인다.

이러한 점을 고려하면, 번데기 동충하초(C. militaris) 균사는 가급적 계대 배양을 지양하고 사용해야 하며, 이의 대안으로는 액체질소에 동결하여 -196℃의 액체질소에 저장하는 방법이나, 10% Glycerol 또는 10%SDS 멸균액 등에 넣어 적어도 -70℃의 저장고에 보관하면서 사용하는 것이 권장된다.

이러한 방법이 곤란할 때에는 양호한 1개의 페트리 디쉬를 선발한 후에 평판 균사의 1개 조각만을 이용하고 수십번 사용하 되, 약 6개월 이내의 기간을 두고 사용하는 것이 바람직한 것으로 나타났다.

도 5는 독립 콜로니를 분리한 사진이다. a) L형 독립 Colony 분리하는 예, b) M형 독립 Colony 분리하는 예, c) Yellow Type/White Type 분리한 예, d) Yellow Type 분리한 페트리 디쉬 예.

실시예 4: 현미 배지를 이용한 자실체 발이 시험

현미 배지를 이용하여 자실체의 발이수에 대한 영향을 알아보기 위하여(?) 배양 중에 형광등의 흰색 빛을 조사하여 발이 여부를 확인하였다. 도 6는 핀발이 적전 및 직후의 모습을 나타내는 사진이다. a) 핀발이 직전의 모습, b) 핀발이 직후의 모습.

현미 배지에서 균사가 상부를 덮고 이후 빛 조사 등에 의하여 발이가 되어 상부로 뚫고 나와야 하는 시점에서 흰색의 균사가 왕성하여 균사층이 두꺼워지면(상대적으로 발이가 되는 노란색의 균사가 적기 때문) 자실체 수가 적어지게 되는 직접적인 원인이 된다. 이 시기에 자실체 발이수가 적으면 생육이 종료되어도 결국에는 자실체의 수량이 적게 된다.

위에서 언급된 바와 같이 종균에 잡균이 전혀없고, 발이를 할 수 있는 노란색으로 변색된 균사가 최대한 많이 존재하게 되면, 대용량의 바구니 배지에서도 균일한 발이가 진행되는 것을 확인할 수 있었다.

따라서 번데기 동충하초의 재배에서 다양한 변수 중에서도 종균의 관리는 첫째는 잡균의 혼입이 없을 것과, 2번째 중요한 요인으로는 발이가 잘되는 균사만으로 재배를 하는 것이 필수적이라고 평가할 수 있다. 하지만 계대배양이나 영양원이 풍부한 액배양을 진행함에 있어서 불가피하게도 후차적으로 흰색의 균사를 생성하는 비율은 13.3~15.9% 정도의 비율로 발생되는 상황이고 흰색의 균사의 증식속도가 빠르다는 것을 참고해야 하며, 이러한 점을 고려하여 종균관리의 중요성이 있으며, 이외에는 재배에서 오염 예방에 주력해야 한다.

이러한 관점에서 재배된 자실체의 수량은 다른 방법에 비하여 높게 생산할 수 있는 기법임에 틀림이 없다.

실시예 5: 현미 배양병을 생육 시험

오염없는 무균주와 계대횟 수를 줄이고 노란색 균사의 단일색을 유지하는 종균의 사용으로 자실체의 단위 생산량이 높아짐을 확인하기 위하여 850ml 얇은 PP 배양 병(병입구 뚜껑 직경 65mm)에 현미를 80g 전후로 사용하고, 물 110ml를 첨가하여 배양병에 현미배지를 이용한 생 자실체의 무게를 비교하였다. 그 결과를 표 6에 나타내었다.

	종전 재배 방식	본 실시 방식
병수	1397병	2880병
생 자실체 중량(kg)	56.3kg	179kg
자실체 평균중량(g)/1병	40.3g/1병	62.2g/1병
자실체 평균중량(g)/16병	644.8g/16병	995.2g/16병

상기 표 6의 결과로 부터, 시간 차이 및 약간의 재배과정에서의 차이는 있으나 전반적으로 재배 공정을 개선하면 1병 단위당 생산성을 높일 수 있었다.

이러한 종균 관리를 철저히 하였을 경우에 다른 농장과 비교시 분명한 증수효과가 있었고, 재배종료될 때까지도 자실체에 곰팡이 등이 유병되지 않고 현미배지를 이용하여 재배되는 과정에서 접종 후 55일째가 될 때까지도 양호한 상태를 나타내고 있었다.

실시예 6: 바구니형(판)배지를 이용한 생육 시험

판배지에 현미+번데기 가루를 이용한 생자실체의 생육 상태를 관찰하였다.

도 7은 생육 상태에 따른 판배지 상에서 자실체의 사진이다. a) 판배지 자실체 생육초기 b) 판배지 자실체 생육중기, c) 판배지 자실체 생육후기, d) 판배지 자실체 생육 종료시기.

판배양 바구니를 이용할 경우 오염에 대한 부담이 있으면 절대로 사용해서는 않될 상황이다. 이는 퍼펙트하게 오염없이 재배되는 조건으로 이루어져야만 하는 방법으로 최상의 재배기법이다.

판배지에서 재배를 하게 되면 병으로 하는 것 보다도 병 밑면적 이외에 공간이 30%가 증가될 뿐만 아니라 자실체의 수량도 증수할 수 있으며, 수확시에 자실체를 꺼내기 위하여 병을 짜르는 비용도 줄일 수 있는 유용한 방법으로 본 연구에서와 같이 종균관리를 하면 참으로 유용한 방법이다.

실시예 7: 바구니형(판)배지를 이용한 생육 시험

번데기 동충하초 현미+번데기 가루 함유된 배지에서 1바구니의 순 자실체 평균 중량(g) 평가하고, 그 결과를 도 8 및 표 7에 나타내었다. 도 8은 판바구를 이용하여 재배 종료된 생 자실체 수량(g)을 나타내는 사진이다.

판바구니 생자실체 중량(g)	판바구니 재배 No. 6	판바구니 재배 No. 7
1바구니(g)	1366.5g	1351.0g
1병 기준 중량(g)	85.4g/ 1병	84.4g/1병

6개 바구니에서 재배된 자실체 수량은 거의 동일한 수준으로 No. 6, 7은 평균적인 수량이며, 생육과정에서도 오염없이 재배가 가능하였으며, 평균 자실체의 생 중량도 16병을 담은 상태보다도 약 30% 정도의 증수효과가 있게 된다.

실시예 8: 액체종균의 오염검사 및 종균 스크린 작업

번데기 동충하초 계통의 다음의 균주를 사용하였다.

* PP 균주:

No. 1 ~ No. 39 : 1차/2차 검경으로 M2 / M4 / M17 / M123 선발

* E 균주:

페트리 디쉬 계대 : 심한 오염 균 7~8종류 오염균 존재, 1차 2개 페트리 디쉬, 2차 1개 페트리 디쉬

위 1차 유래된 자체 배양 후 자체 생육한 자실체로부터 조직을 분리하였다.

* Y 균주 :

페트리 디쉬 계대: 극심한 오염 균 7~8종류 오염균 존재, 생육되어 가져 온 2병(중) 자실체 유래의 조직을 분리하였다.

* S 균주 : 자실체 유래

조직분리 1차: 생육돼 가져온 4병(중) S11 /S12 /S16 /S20 /S21 /S24 /S25/ S27를 선발하였다. 조직분리 2차: 분획된 배양액의 자실체로부터 분리하였다.

* G 균주 : 균사 배양병 1개를 가져 온 후 자체 생육으로 자실체 유래 조직분리(1차)하고, 10여개 등을 선발하였다.

* 신균주: 2020년에 순수 분리한 균주.

액체 종균에 대하여 참고자료[심규광 등(2012, 한국 버섯학회:팽나무버섯 액체 종균의 접종 전 오염검사; 한국버섯학회지, 2012, Vol 1, p44-48, 심규광, 유영진, 구창덕, 김명곤]이 기술된 방식에 의하여 액체 종균의 오염 여부를 현미경 검경 방법을 적용하여 시험하였다.

시험관 액 배양액을 Slide glass에 도말하여 Giemsa Stain Sol. 염색 과정을 거쳐 검경하였으며, Giemsa Stain Solution으로 염색할 경우 간균성 균류(Bacillus spp.)나 구균성 균류를 쉽게 구별할 수 있다. 본 적용 예에서와 같이 접종전 액체 종균에서 활용할 경우에는 오염균류의 유무만을 평가하는 것으로도 접종전 오염 여부를 검사할 수 있다.

액체종균 검사에서 액체종균 접종 전 현미경 검경 방법에 의한 오염원의 수를 평가하기 위하여 오염균의 상대적인 수를 다음과 같이 정의하여 기준을 설정하여 전반적인 평가를 위한 기준을 정하였다.

액체 종균의 접종 전 현미경 검경 방법으로 짧은 시간 내에 검사하는 방법으로는 아래의 도 9의 도식된 예와 같이, 1Slide glass의 전체 면적을 보기 위하여 22,000회의 관찰을 하여야 하나 번데기 동충하초의 경우 불완전균류에 속하여 자낭포자를 생산하여 관찰에 어려움이 크고, 특히, 대부분의 종균 관리에 정량적인 기법을 적용한 사례가 없이 이전의 재배담당자가 관리해 온 종균상태는 오염빈도가 너무나 심각한 상황이다.

오염된 종균을 순수 분리하는 스크린 과정 중에 슬라이드 전체 면적을 보려면, 너무나 많은 시간이 소요되므로 1 Slide glass의 전체 면적 중 가로 줄의 220회를 관찰하여 의심되는 균수를 계측(Counting)하여 상대적인 평가를 하는 것도 한 가지 방법이 된다. 도 9는 현미경용 1 Slide glass의 검경(대물렌즈 100X, 유침) 횟수 설명도이다.

도 9에서와 같이 액체 종균을 대용량으로 배양하여 종균의 밀도가 많이 형성되는 시점에서 이 배양액에서 0.1ml 만을 Slide glass에 도말하여 상대적으로 수치화 된 자료로 활용이 가능하다. 기존의 액체 종균 오염 검사 방법 중에서 다양하게 시행되고 있겠지만 이 중에서 가장 정확한 것은 현미경에 의한 대물렌즈 100X에서 오염균을 확인하는 방법일 수 있다.

번데기 동충하초의 채집 후 일반농가에서는 순수분리의 작업에 대한 인식의 부족, 기법의 부족, 관찰의 부족 등으로 이미 미세한 감염주를 수립하는 경우는 숱하게 존재한다고 보는 것이 일반적인 상황이다. 특히, 숙주가 고단백질인 유충이나 번데기 등에서 채집되는 야생 번데기 동충하초 균류(예, 눈꽃 번데기 동충하초, 번데기 동충하초 품종)에서 순수분리작업이 잘 되지 못한 채 재배되고 있는 현실에서 대부분의 수립된 품종의 종균에서 7~8개 형태의 다양한 오염 균류가 존재하고 있는 것이 확인된다.

통상은 감염력이 왕성한 일반적인 세균(Bacillus spp.)의 경우에는 다양한 형태로 표현(냄새, 혼탁, 거품, 폭기 배양 중 급격한 CO₂증가 등)되기도 하지만 미세한 수에 의한 오염이나, 특이하게도 본 연구에서 제시된 바와 같이 미생물의 크기가 통상의 오염 원인균(간균)보다 훨씬 작은 다양한 형태의 오염인 경우에는 현미경 검경 방법 외에는 달리 확인할 수 없는 상황이다.

실시예 8-1: 번데기 동충하초 계통의 검사

㈜뿌리물산(PP회사)에 보관 중인 페트리 디쉬의 균주를 일자 별로 일련 번호를 부여하였다(No.1~No. 39). 또한, 냉장보관 중인 페트리 디쉬의 계대 일자별로 분류 후 각각의 일자별로 1회차 평판 페트리 디쉬 계대 배양하고, 2회차 평판 페트리 디쉬 계대 배양한 후, 3회차 시험관 액 계대 배양하였다.

삼각프라스크 액배양 배지에 번데기 동충하초를 접종한 후 130rpm으로 진탕되는 상태에서 균사가 증식한 후에 일정한 액을 분획하여 슬라이드 글라스(Slide glass)에 도말하여, 건조시킨 후, 진한 용액 그대로인 Giemsa Stain Sol.액으로 40Sec~60Sec 동안 염색하고, 깨끗한 물로 씻어낸 다음 다시 슬라이드 글라스(Slide glass)를 건조하였다.

광학 현미경 검경에는 처음에는 대물렌즈 10X ~ 40X 로 초점을 맞춘 다음, mineral oil을 떨군 다음 대물렌즈 100X으로 정확한 상의 초점을 맞추고 난 다음 도 10과 같은 슬라이드 글라스(Slide glass)를 이동하면서 관찰하였다. 도 10은 오염균을 나타내는 사진이다. a) 번데기 동충하초 균류의 균사 b)번데기 동충하초의 자낭포자 및 이중격벽 균사.

이 때 주로 오염을 유발하는 균류는 간균(Bacillus spp.)과 구균(Coccus spp.) 그리고 간혹 곰팡이 균류를 관찰하고, 오염 원인균류에는 다음과 같은 유형의 것 들이 있음을 확인할 수 있으므로 주의해야 한다.

실시예 8-2: 번데기 동충하초 균주의 실험

계대횟수가 진행된 년도의 후반부로 갈수록 오염 의심균 수는 상대적으로 더 증가한 상황임을 알 수 있는데, 이는 페트리 디쉬 평판 배지에서 계대 횟수가 늘어날 때마다 전반적으로 의심되는 미생물 수가 더 증가되었음을 추측할 수 있다.

이와 같이 의심 균 수가 적으면서 자실체 발이가 잘 되는 Lot를 선발하는 과정에서 균사색이 잘 변하면서도 발이가 잘되는 Lot를 선발하였다.

PP회사의 보관 중인 약 39개 Lot에서 Giemsa Stain Sol.로 염색하여 검경한 바 모든 균주에서 오염이 확인되었으며, 계대 횟수가 증가할수록 오염원이 증가하는 경항이 있었다.

번데기 동충하초 균주는 일반적인 (기본)균사 외에도 자낭포자로부터 유래된 자낭포자 유래 균사(화)의 또 다른 생식 과정이 존재하는 까다로운 균주이다. 경험상, 유색을 띄는 균주의 특성이 추가된 상황으로 색 변화가 잘되는 균주 일수록 발이가 잘되는 특성이 있으며, 이처럼 균사의 유색 특성은 빛의 조사와도 밀접한 관계가 있으며, 자실체의 풍성한 수량이 유도되는 것을 확인하였다.

실시예 8-3: 현미경 검경에 의한 확인

도 11은 눈꽃 동충하초/번데기 동충하초 균주의 특성 및 제조에서 발생되는 오염 유발 원인균의 형태에 대한 사진이다. 눈꽃 동충하초의 균사에는 본 연구에서 언급되고 있는 자낭포자 형태는 거의 찾을 수 없다. 하지만 번데기 동충하초에서는 액배양을 진행할 때에 배양 초기에 반드시 무수한 자낭포자 형태를 확인할 수 있다.

이와 같이 번데기 동충하초는 환경의 변화에 따라 자낭포자로 증식하는 정도가 차이가 있고, 자낭포자로부터 유래된 균류도 결국에는 세력이 되어 영양 생장 기간 동안에 강력한 힘을 나타내는 것으로 보이기는 하나, 가장 근본적으로는 포자 분리/조직 분리시에 1Cell 유래의 것이 아닌 혼입된 상태에서 시작된 경우가 있을 수 있다. 자낭포자로부터 유래된 균사는 기타, 다른 활성 등의 다양한 문제로 인하여 후차적으로 흰색을 띄는 균사 막을 형성하여 핀발이를 방해하는 현상으로 나타날 수도 있으므로 노란색형의 균사는 유전적으로 정상적인 것, 흰색의 균사는 유전적으로 결함이 있으나 균사의 증식은 더 잘되는 특성이 있는 것으로 추정 판단되는 바, 이들의 균사를 순수분리하는 작업이 필요해 보인다.

실시예 8-4: 균사 내에 다른 균사가 혼재하여 존재하는 확인 시험

우장지 버섯(Antrodia cinnamomea)은 장지 버섯이라고도 불리는 대만 특유의 진균으로서, 주로 해발 약 450m~1500m의 대만 산간지역에 서식하는 우장수(Cinnamomum camphora)의 썩은 심재(heartwood) 내에서 생장하며, 균사 내에 다른 균사가 혼입될 수 있음은 우장지 버섯을 이용하여 확인하였다.

위 품종에 대하여 희석평판방법에 의하여 분리를 시도하여 독립된 균사를 따로 분리한 바, 균사배양에 영향을 주는 잡균은 없었고, 다음과 같이 흰색의 균사와 노란색의 균사로 분리되었다. 도 12는 우장지 버섯 균사를 나타내는 사진[a) 우장지(버섯) 균사의 혼입 상태 b) 우장지 균사에서 2종의 균사 분리.]이다.

이처럼 우장지 버섯 균사에서 2종류(흰색과 유색 균사)를 2개로 완전히 분리한 경험과 같이 번데기 동충하초 균사에서도 노란색 계열의 균사와 흰색의 균사에서 노란색 균사의 비율이 높아지도록 하는 작업이 필요할 수도 있을 것 같으므로 이종(異種)의 2개 균사를 따로따로 분리하는 작업의 필요성이 있다.

따라서 자체적으로 보관 중이거나 인근의 재배농장에서 입수한 품종을 모아 번데기 동충하초의 다른 Lot에서 흰색의 균사가 존재하는 것을 다음과 같이 확인하였다.

번데기 동충하초에서도 흰균사와 노란색 균사가 혼재되어 있는 것을 확인하였다. 도 13은 번데기 동충하초에서 2종 균사의 분리 일례를 나타내는 사진[a) 액배양 분획에서의 색깔이 다른 양상, b) 페트리 디쉬에서의 흰색 균사의 혼입 양상]이다. 도 14는 번데기 동충하초에서 2종 균사의 분리한 다른 예를 나타내는 사진이다. 도 15는 번데기 동충하초에서 2종 균사의 분리한 다른 예를 나타내는 사진이다.

따라서, 균사들이 혼재하는 경우 어느 것이 균사에서 자실체로 발이되는 것인지 중요하다. 혼재된 균사를 분리하여 대칭배양 Test를 실시하면, 흰색의 균사 증식속도가 아주 빠르게 진행하여 노란색의 균사를 증식하지 못하도록 한다.

도 16은 번데기 동충하초에서 2종 균사의 분리한 예를 나타내는 사진이다. a) E 분리 균주-흰 균사 증식이 더 빠르고, 계대 배양을 지속하면 결국에는 강력한 균주가 우점하는 현상이 발생함, b) E 균주로 부터 분리 후 경합 배양: 노란 균사 + 흰 균사 동일한 량을 재이식 후 흰 균사만 강력하게 증식하여 우점되는 상태가 관찰됨.

도 16에서와 같이 대부분의 Lot에는 흰색의 균사가 노란색의 균사와 함께 공존하는 것으로 파악되었다. 동일한 페트리 디쉬의 평판에서 배양한 노란(노란) 균사와 흰균사의 배양 속도는 흰균사가 빠르게 진행되고 있었고, 이러한 각각의 균사를 한 곳의 중앙에서 배양할 경우에, 결국에는 흰색균사가 더 강력하게 증식하는 현상이 있으므로 종균의 계대에서 횟수를 거듭할수록 최종적으로는 발이가 잘되는 노란색 균사는 퇴화되는 상황이고, 흰색의 균사 증식만이 더 잘 번성하는 경향이 발생하게 된다.

이러한 결과는 실제 배양되고 있고 발이된 이후에 흰색 균사가 점점 더 왕성하게 나타나는 것을 확인시켜 준 결과이다.

현재까지 이와 같은 원리에 대하여 발표된 학술적인 문건이 보고된 바 없는 상황이며, 이러한 기작에 대한 논의가 전혀 이루어지지 않았다. 다만 경험적으로 인지할 수 있는 정도이므로 이러한 원인에 의하여 계대가 점점 진행될수록 자실체의 생산량이 감소하고 있어 계대를 하기보다는 조직분리방법으로 종균(균사)를 자주 만들어 사용할 필요가 있다.

현재까지 계대를 하여 다시 균사 배양을 진행할 경우에 종균관리에 집중적인 시간을 투여했음에도 불구하고, 번데기 동충하초처럼 자낭포자가 존재하는 한, 흰균사와 노란색의 균사를 완벽하게 분리하는 것은 쉽지 않다.

도 17은 현미경 배율에 따른 균사 및 자낭포자의 신장(증식)중인 형태를 나타내는 사진이다.

이는 인근의 농장에서 재배되는 번데기 동충하초 품종의 페트리 디쉬 균주 및 균사 배양하여 생육진행되는 자실체로부터 분리된 오염 원인균(류)의 형태로써, 미세한 균류가 존재하고 있는 것이 확인되었다. 언급한 바와 같이 이처럼 미세하게 균사 사이에 끼어있는 오염원이 있다 해도 버섯재배에서는 생육이 다 끝나도록 아슬아슬하게 재배하는 농가가 있었다. 하지만 이러한 품종에서 완벽한 무균주를 수립하고, 독립 Colony에서 유래된 가급적 노란의 단일한 균사를 이용하는 노력을 하면 1병당 자실체 수량을 높일 수 있게 된다.

도 18은 번데기 동충하초 액배양 중의 혼입된 특이한 오염균 형태를 나타내는 사진이다. 이는 Bacillus(일반적인 세균: Bacillus spp.) 유형의 간균으로 오염을 유발하는 세균 중에서 1 Cell 크기가 비교적 큰 부류에 속한다. Bacillus는 세균류 중 가장 강력한 증식 능력을 가지고 있는 것 중의 하나이며, 대물 렌즈(100X, 유침)로 비교적 큰 크기를 나타낸다. 인간의 직감적인 증상(예 : 냄새, 혼탁, 기포)이 없을 수도 있음에 주의를 요한다.

실시예 8-5: Giemsa Stain Sol.로 염색하여 광학 현미경에 의한 검경 방법

오염에 관계되는 특이한 균류는 다양하며, 이러한 균류의 동정은 하지 못하였다. 도 19는 오염에 관련되어 있는 극미세 균주를 나타내는 사진이다. 본 사진에서와 같이 Colony(군락성)을 이루는 오염 원인균에 대하여는 각별한 주의가 필요하다. 부패균으로 표기된 것과 같은 유형의 오염균에 대하여는 지금까지 언급한 문건이 없는 상황으로 본 개발자는 위와 같은 형태의 원인균에 대하여 대용량의 배지를 배양하는 곰보버섯의 야생주 채취 이후 또는 참송이버섯의 분리과정의 배지와 종균제조과정에서도 검증을 한 바 있다. 지금까지 소용량으로 배양하게 되면 부패균 형태의 것을 감지하지 못하는 상황이나 참송이(표고류) 배지의 1단위가 12~13.5kg로 커지게 되면 열화 현상 등에 의하여 균사체가 약화되었을 경우에 오염상태가 더 심화되어 나타나는 것을 확인 할 수 있었던 부패 유발 원인균류이다.

도 20은 버섯 부패 유발 원인균류와 초미세 균류의 크기 비교한 사진이다. 도 21 및 22는 부패 유발성 미세균류의 사진이다. (초)극 미세균류 부패 유발 원인균류, 부패 유발 원인균류와 초미세 균류 부패 유발 원인균류.

이 중에서 가장 기본적인 것은 야외에서 채집한 균주의 독립 Colony 분리 때에 가장 어려운 작업 중의 하나이지만, 세심한 작업이 되지 못한 결과가 가장 큰 원인이며, 이후에도 균주의 계대 관리 기법을 명확하게할 필요성이 있다.

이상 설명한 바와 같이, 번데기 동충하초(C. militaris)의 품종 차이는 있겠지만 최적의 방법을 적용하여 페트리 디쉬를 관리할 때에, 페트리 디쉬의 PDA 평판 배지에서부터 빛을 조사하여 균사색(노란색->진한 노란색)이 빠르고, 균일하게 잘 변하는 단일한 균주를 얻는 기법으로는 균주를 균질화하여 희석 도말 방법을 이용하면 자실체의 수량을 높일 수 있다.

실시예 9: 희석평판법에 의한 분리 검증

본 실시예에서는 발이가 잘되고 수량성이 입증된 양질의 Line(Lot E-No. E28 & E-No. 33) 중에서 2개를 선별하여 다시 본 희석평판 방법에 의하여 다시 확인하였다. 도 23은 오랜 기간동안 냉장 저장한 후에도 Mono Spore 유래의 노란색 균사를 보이는 Lot에서는 역시 노란색의 균사를 보이는 것을 설명하는 사진이다.

E계열의 번데기 동충하초에서 흰색 균사와 노란색 균사를 분리해 놓고 장기간 4℃에서 방치한 평판 Petri Dish 상태의 것 중에서 노란색 균사로 분류되고, 발이가 양호한 것으로 기록된 것 중에서 2개의 Lot 번호를 골라 진행하였다. 도 23에서와 같이 Lot E-No. E28 & E-No. 33를 앞서 서술한 희석평판방법에 의하여 진행하였다. E-28 Petri Dish는 1차 분리선발한 양호한 Lot No.로 오랜 기간 동안 저온저장한 후에 다시 희석평판방법으로 분리 검증하였다. 도 24는 독립 colony를 새로운 배지에 이식한 후 암배양 초기 사진이다. 도 25는 독립 colony를 새로운 배지에 이식한 후 명배양 진행을 나타내는 사진이다(이식 후 8일째 / 빛조사 3일째). 도 26은 독립 colony 중의 흰색 균사의 출현을 나타내는 사진이다. 독립 Colony 중의 흰색 균사 1/494의 빈도로 출현(상:빛조사 3일째, 하: 빛조사 6일째)되었다. 저장 후 오래된 E-28 Petri Dish로부터 삼각액 배양을 진행하고, 균질화 후 희석평판방법으로 진행하여 얻은 E-28-17 Petri Dish의 White 균사 1개가 확인되었다(흰색 1개/노란색 494개=0.2%). 도 27은 Petri Dish에 이식 후 배양 8일째(암배양) 이후 빛 조사(명배양)하여 배양 진행 중인 균사 상태를 나타내는 사진이다.

발이가 잘되는 것으로 기록된 위의 페트리 디쉬로부터 삼각액 배양을 진행하였다. 삼각액은 약 200ml 이고, 내부에 마그네틱 자석을 넣어 회전시키면서 2~3일간 배양하였다. E-No. E28는 2일 후, E-No. 33는 3일 후 각각 고속균질기로 10,000rpm으로 균질화하여 앞서 언급한 희석평판방법(10의 1배~11배 희석)으로 독립 균사 Colony가 보일 때에 각각의 것을 인접되지 않도록 메스칼로 각각 떼어내어 4일간 배양하고 이후에 형광등 빛을 조사하였다. 빛을 조사하여 변색되는 것과의 비율을 보면 총 494개를 이식하여 확인한 것으로 흰색의 균사와 노란색의 균사 비율은 1/494=0.2%로 매우 안정된 상태의 좋은 균사를 얻을 수 있었다.

이 방법에 의하여 순수한 노란색 균사 유래의 것에서 E-28 & E-33의 페트리 디쉬의 2개구에서 희석평판배양방법에 의하여 균총을 각각 새로운 평판에 이식한 갯수는 총 494개의 독립 Colony를 작업하였고, 새로이 이식한 독립 Colony를 페트리 디쉬 평판에서 균사를 배양하고 이후에 명배양하여 균사의 색을 확인한 바, 494개 중 1개만이 흰색으로 나타나는 것이 확인(발이가 잘 될 수 있는 노란색의 균사비율은 99.8%)되었다. 따라서, 채집 이후에 균주를 제작할 때에 Multi Spore가 아닌 Mono Spore 유래의 것 중에서 발이가 잘되는 것을 선발하여 종균으로 사용하는 것이 자실체의 수량 증가에도 영향을 주는 것이 입증되었다.

실시예 10: 독립 콜로니의 분리 배양

E-28 Petri Dish의 Yellow 유래의 독립 Colony 1개의 균사를 이용하여 삼각액에 접종하고, 온도 24℃, 130rpm에서 진탕 배양, 고속균질화한 균사를 유리병 9L에서 폭기 배양하였으며, 폭기 배양 4일째에 분획하여 귀리 80g+물 110~120ml를 넣어 살균, 방랭한 용기에 폭기 배양한 액체균사를 접종하고, 귀리배지에 접종하여 처음부터 빛조사하여 균사를 배양할 경우 Yellow 균사에서 배양 12일째에 초발이 증상이 확인되었으며, 거의 순수분리된 상태로 평가되었다.

도 28은 독립 콜로니의 배양 과정을 나타내는 사진이다. 도 29는 초발이 증상을 확인하는 사진이다.

도 29에서와 같이 Yellow의 균사색을 보이는 노란색 균사만 있어도 자실체를 생산하는 데에 문제가 없으며, 오리려 흰색의 균사는 배지상부에 흰색의 막을 형성하여 버섯의 (초)발이에 장해를 주는 것은 그 동안의 재배과정에서 확인된 사항이다.

이상과 같이 본 발명은 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 본 발명은 상기의 실시예에 한정되는 것은 아니며, 이는 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이러한 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다. 따라서 본 발명의 사상은 아래에 기재된 특허 청구 범위에 의해서만 파악되어야 하고, 이의 균등 또는 등가적 변형 모두는 본 발명 사상의 범주에 속한다고 할 것이다.

Claims (4)

1. a) 번데기 동충하초를 계대 배양하는 단계;
   b) 배양 후 번데기 동충하초의 자낭포자 유래의 균사에 빛을 조사하는 단계;
   c) 흰색 균사와 노란색 균사를 포함하는 자낭포자로 부터 황색 또는 노란색 균사를 포함하는 균사만을 희석 도말법에 의해 선별하고 흰색 균주를 배제하여 단일 콜로니를 선별하는 단계; 및
   d) 선별된 콜로니가 우점된 상태에서 배양을 지속하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 번데기 동충하초 자실체의 단위 생산량을 증대시키는 방법.
2. 청구항 1에 있어서,
   상기 계대 배양하는 단계는 모주로 부터 분리된 조직을 이용하여 수행함으로써 계대 배양을 최소화하는 것을 특징으로 하는 번데기 동충하초 자실체의 단위 생산량을 증대시키는 방법.
3. 청구항 1에 있어서,
   상기 b) 단계는 이식배양하여 일정시간이 지날 때까지는 암배양으로 균사를 증식하고, 이후 명배양을 진행함으로써 빛을 조사하는 것을 특징으로 하는 번데기 동충하초 자실체의 단위 생산량을 증대시키는 방법.
4. 청구항 1에 있어서,
   배양시 사용하는 배지로는 누에, 번데기, 현미, 및 귀리를 포함하고, 배양이 완료된 번데기 동충하초 자실체는 수확한 후 필요한 크기로 포장하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 번데기 동충하초 자실체의 단위 생산량을 증대시키는 방법.

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