CN106434477B - 一种葛仙米异形胞嵌悬育种方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种葛仙米异形胞嵌悬育种方法，包括1)利用营养液将对数生长期的葛仙米诱导形成多异形胞串联藻体；2)裂解所述多异形胞串联藻体，分离获得葛仙米单体异形胞；3)培养所述葛仙米单体异形胞，获得葛仙米藻体。本发明利用琼脂粉和葛仙米多糖干粉形成牢固的架桥作用，增大培养液的浮力，使得异形胞的重力与浮力达到平衡，一方面将营养物质均匀分散，另一方面是一种将异形胞均匀分散且静悬于培养液中的培养模式，无污染源，成功率高，无需消耗电能来进行通气培养，育种成本更低。

Description

一种葛仙米异形胞嵌悬育种方法

技术领域

本发明涉及一种蓝藻的培育技术，尤其涉及一种葛仙米异形胞嵌悬育种方法。

背景技术

葛仙米是念珠藻属(Nostoc Vauch)中拟球状念珠藻(Nostoc sphaeoides Kützing)的俗称，它属于蓝藻门(Cyanophyta)，蓝藻纲(Cyanophyceae)，念珠藻目(Nostocales)，念珠藻科(Nostocaceae)。比发菜还要珍贵稀有，葛仙米又称绿色燕窝。不仅如此，葛仙米中含18种氨基酸，其中包括人体必需的八种氨基酸，干物质总蛋白高达56％左右，粗脂肪8.11％，碳水化合物12.69％，灰分10.88％，叶绿素30.98mg/g，抗坏血酸5.50mg/g，维生素C含量接近鲜枣，比山楂高5倍多，比柑桔高5倍；维生素B1、B2高于一般菌藻类；富含矿物质和微量元素，还有藻胆蛋白和多糖类生物活性成分，其含量分别可达10-20％(DW)和25-47％(DW)，葛仙米多糖也是一种重要的生物活性物质，表现出了一定的提高机体免疫力、抗肿瘤的生物学功效。同时其含钙量高于一般蔬菜，是一种极好的天然富钙营养保健食品。

葛仙米的药用价值也弥足珍贵，是食药两用的佳品。《本草纲目》、《药性考》、《全国中草药汇编》等称葛仙米的功效为：明目益气、令人有子、解热清隔、利肠胃、痰火能疗。可美容养颜，强身健体，补钙、抗癌、久食延年、消除疲劳、收敛、治夜盲症等。

葛仙米藻丝中的异形胞处易发生断裂，而产生单个的异形胞和多细胞营养藻丝，可有效地将异形胞和多细胞营养藻丝分离开来。在适宜的条件下异形胞能发育为新藻体；或在恶劣条件下，异形胞会形成孢子，而后在适宜的条件下发育为新藻体。异形胞相比多细胞营养藻丝而言，抗逆性更好。异形胞具有全套的基因，在一定条件的诱导下表达，重新萌发出新藻体。而多细胞营养藻丝在一定的条件下，形成藻殖段萌发新藻体。

与现有葛仙米育种技术的本质区别在于，现有技术用直接诱导释放藻殖段或由多细胞营养藻丝育种，而本发明用异形胞育种。现有技术所用液体充气悬浮培养，藻殖段动态悬浮，消耗电能较多，不利于生产成本的控制，通气会带入空气中的污染源，易染杂藻、细菌、水生动物、尘埃、蚊子幼虫而导致育种的失败率较高，若对空气进行处理，增加育种成本。

发明内容

针对现有葛仙米育种技术的不足，本发明的目的是提供一种葛仙米单异形胞分离纯化方法，把异形胞从营养细胞中分离纯化出来；及利用单个异形胞繁育出微球体态的葛仙米藻种的育种方法，并建立异形胞发育的生活史图谱。

为实现上述目的，本发明提供一种葛仙米异形胞嵌悬育种方法，包括以下步骤：

1)利用营养液将对数生长期的葛仙米诱导形成多异形胞串联藻体；

所述营养液包括以下组分：氯化镁0.05-0.08g；磷酸氢二钾0.01-0.03g，氯化铁0.003-0.008g，氯化钙0.02-0.04g，碳酸氢钠0.01-0.03g，葡萄糖0.005-0.02g，氯化钠0.005-0.02g，蒸馏水0.5-1L；

所述诱导条件包括：光照强度10000-20000lux，温度25-30℃，震荡培养；

2)裂解所述多异形胞串联藻体，分离获得葛仙米单体异形胞；

3)培养所述葛仙米单体异形胞，获得葛仙米藻体；

所用培养液包括以下组分：琼脂粉0.1-0.5g，葛仙米多糖干粉0.1-0.8g，硫酸镁0.035-0.075g，磷酸氢二钾0.001-0.004g，氯化钙0.003-0.006g，氯化铁0.0003-0.0008g，玉米素0.0001-0.0005g，土壤浸提液20-80mL，蒸馏水0.5-1L；

所述培养条件包括：光照强度500-3000lux的红光，温度20-38℃，湿度60-90％，静置培养。

上述育种方法步骤1)中，

优选地，所述营养液包括以下组分：氯化镁0.075g；磷酸氢二钾0.02g，氯化铁0.006g，氯化钙0.036g，碳酸氢钠0.02g，葡萄糖0.01g，氯化钠0.01g，蒸馏水1L。

优选地，所述诱导条件包括：光照强度12000lux，温度28-30℃，震荡培养。

优选地，所述震荡培养转速为100-200rpm；进一步优选为120rpm。

优选地，所述对数生长期的葛仙米球径为3mm左右。

一般地，震荡培养15-20天即可诱导形成多异形胞串联的藻体。

一般以诱导出现2-3个异形胞串联的藻体为止，可通过以定时取样镜检的方法判断。

上述育种方法步骤2)中，因异形胞的抗逆性好于营养细胞，通过一定的处理裂解营养细胞，连同离心技术，将异形胞和营养细胞分离开来，获得纯度高活性高的单体异形胞。

上述育种方法步骤2)具体包括如下步骤：

1)消毒：将所述多异形胞串联藻体用酒精消毒后立即用无菌蒸馏水清洗去掉残留酒精；优选用70-75％酒精消毒。

2)破碎：将消毒后的所述多异形胞串联藻体加适量无菌蒸馏水破碎，制成藻浆，用0.1mm的滤网过滤，得滤液和滤渣(即葛仙米滤渣)；优选地，以g/mL计，葛仙米(即消毒后的所述多异形胞串联藻体)湿重量与无菌蒸馏水体积比为1:5～1:10，进一步优选为1:8。过滤后所得滤渣(即葛仙米滤渣)可用作后续步骤制备葛仙米多糖干粉。

3)裂解营养细胞：将步骤2)制备的滤液离心，去上清，加入适量甘油溶解沉淀，置于-70～-80℃(例如超低温冰箱中)下冷冻处理24-48h；一般地，可于1000rpm离心5min。优选地，用10％(体积分数)的甘油溶液溶解沉淀；10％(体积分数)的甘油溶液体积与步骤2)制备的滤液的体积比为1:1。

4)紫外辐照：将步骤3)冷冻处理后的样品于15-20℃下融化，离心(一般可于1000rpm离心5min)，去掉甘油，用适量无菌蒸馏水溶解，紫外辐照24-48h，进一步灭活残留的营养细胞；

5)收集异形胞：收集步骤4)中的细胞液，离心(一般可于800-1000rpm离心5-10min)，去上清，收集沉淀即得葛仙米单体异形胞。

一般可将步骤4)中的细胞液均分到50mL离心管，用蒸馏水定容到50mL刻度后，再进行离心。

上述育种方法步骤3)中，

优选地，所用培养液包括以下组分：琼脂粉0.3g，葛仙米多糖干粉0.45g，硫酸镁0.05g，磷酸氢二钾0.0025g，氯化钙0.0045g，氯化铁0.00055g，玉米素0.0003g，土壤浸提液50mL，蒸馏水1L。

优选地，所述培养条件包括：光照强度2000lux的红光，温度28-30℃，湿度75％，静置培养。

本发明红光可采用LED作为光源，红光的波长为645nm。

本发明中葛仙米多糖干粉可选用市售的或按现有技术制备的产品。

优选地，所述葛仙米多糖干粉的制备方法包括以下步骤：以葛仙米或上述步骤所得葛仙米滤渣为原料，加适量蒸馏水稀释，置于0～-80℃(例如超低温冰箱中)冷冻处理3次，每次24-48小时；取出融化，离心(一般可于6000-8000rpm离心5-10min)，去上清，收集沉淀，研磨成浆，浓缩，喷雾干燥(温度60-80℃)，收集干粉过100-200目筛，即得葛仙米多糖干粉。

本发明中土壤浸提液可按现有技术方法制备。

优选地，所述土壤浸提液的制备方法包括以下步骤：以g/L计，按照土壤重量与地下水体积比为100-200:1-2混匀，90-100℃水浴加热3次，每次3-5小时；冷却沉降，吸取上清液，抽滤，滤液灭菌，即得所述土壤浸提液。可置于1-4℃冰箱冷藏备用。所述灭菌可采用本领域常规方法，例如高压蒸汽灭菌，121℃，1h。

上述育种方法步骤3)中，当在培养液中能肉眼观察绿色小颗粒藻体时，可定期取样镜检观察；当葛仙米新藻体球径长到0.1-0.25mm，可用0.1mm分样筛收集即得葛仙米藻体。

本发明还包括一种诱导葛仙米(尤其是对数生长期的葛仙米)形成多异形胞串联藻体的营养液，所述营养液包括以下组分：氯化镁0.05-0.08g；磷酸氢二钾0.01-0.03g，氯化铁0.003-0.008g，氯化钙0.02-0.04g，碳酸氢钠0.01-0.03g，葡萄糖0.005-0.02g，氯化钠0.005-0.02g，蒸馏水0.5-1L。

优选地，所述营养液包括以下组分：氯化镁0.075g；磷酸氢二钾0.02g，氯化铁0.006g，氯化钙0.036g，碳酸氢钠0.02g，葡萄糖0.01g，氯化钠0.01g，蒸馏水1L。

本发明还包括一种培养葛仙米单体异形胞形成葛仙米藻体的培养液，所述培养液包括以下组分：琼脂粉0.1-0.5g，葛仙米多糖干粉0.1-0.8g，硫酸镁0.035-0.075g，磷酸氢二钾0.001-0.004g，氯化钙0.003-0.006g，氯化铁0.0003-0.0008g，玉米素0.0001-0.0005g，土壤浸提液20-80mL，蒸馏水0.5-1L。

优选地，所用培养液包括以下组分：琼脂粉0.3g，葛仙米多糖干粉0.45g，硫酸镁0.05g，磷酸氢二钾0.0025g，氯化钙0.0045g，氯化铁0.00055g，玉米素0.0003g，土壤浸提液50mL，蒸馏水1L。

本发明所述营养液、培养液均可用本领域常规方法制备。

本发明还包括上述营养液或上述培养液在葛仙米异形胞嵌悬育种上的应用。

本发明利用琼脂粉和葛仙米多糖干粉形成牢固的架桥作用，增大培养液的浮力，使得异形胞的重力与浮力达到平衡，一方面将营养物质均匀分散，另一方面是一种将异形胞均匀分散且静悬于培养液中的培养模式，无污染源，成功率高，无需消耗电能来进行通气培养，育种成本更低。

本发明的优势：

1、葛仙米藻种由异形胞分化而来，而非藻殖段或营养藻丝发育而来。

2、相比藻殖段而言，异形胞育种，可排除藻殖段内细胞间的相互影响。

3、在葛仙米多糖干粉制备时，用超低温和喷雾干燥时高温破坏葛仙米多糖干粉中残留的藻胆素，排除色素对光的遮挡作用，保证培养液透光性能，有利于异形胞的发育。

4、在培养液中，由琼脂粉和葛仙米多糖干粉溶解后具有蠕动性，中间具有间隙，便于与空气进行营养交换。

5、在培养液中加入玉米素、土壤浸提液来有效促进异形胞的分化，缩短了制种周期。本发明采用LED红光，促进了发育，同时能耗较低。

6、利用葛仙米多糖及琼脂粉对营养的吸附作用，巧妙地将各营养成分均匀分散，保证悬浮异形胞的发育的营养需求。

附图说明

图1为实施例1培养装置示意图，其中，1为培养装置壳体，2为嵌悬的葛仙米单异形胞；3为透明浮力较大的培养液；4为透明三角瓶；5为封口罩；6为波长为645nm的LED红光光源；7为培养装置内部空间杀菌装置；8为培养装置内部湿度控制装置；9为培养装置内部控温系统。

图2为葛仙米从单异形胞到微球体的发育过程(即生活史)，其中，A：透明的单体异形胞，如同句号，体积非常小；B：透明的双环细胞，分成明显的内环和外环，且细胞体积显著增大；C：细胞体积进一步增大，外环增厚且颜色加深。内环消失，变成折光性较强的块状，块状的边缘出现一个内陷口；D：内层裂解成多块，外环变薄分化成外层结构；E：内部出现球状的藻细胞雏形，外层进一步变薄，包裹饱满；F：藻丝细胞雏形通过细胞分裂，内部细胞数量增多，但排列紊乱，藻细胞间未串成念珠状，外层增厚且透明；G：在内部靠近外层的部位，分化出新的内生异形胞；H：藻丝细胞进一步增多，内部藻丝细胞间无间隙，群体个头变大、无外生端异形胞的微球体；I：细胞连成念珠状，藻丝间隙明显，透明层外凸形成芽体，且藻丝向芽体内迁移；J：芽体内藻丝数量增多，形成长形双球状连体，外层内陷，内陷处的藻丝横向排列；K：外层极度内陷，分裂成2个球体；L：通过发育，藻体体积增大；通过不断地出芽及群体二分裂，繁育出更多的小藻体。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。

以下实施例所用葛仙米多糖干粉的制备方法包括如下步骤

A、以实施例1步骤二所得葛仙米滤渣为原料。

B、加蒸馏水稀释，放入超低温冰箱-79℃处理24小时，重复3次。

C、取出融化，在6000rpm离心10min，去掉上清液的藻胆素，收集离心沉淀。

D、利用超细研磨机将沉淀物磨成浆，浓缩。

E、将步骤D中浓缩物在80℃下喷雾干燥，收集干粉过200目筛，即得葛仙米多糖干粉。

以下实施例所用土壤浸提液的制备方法包括如下步骤：

A、选土：选择肥沃的新鲜土壤。

B、称取土壤装入2000mL的三角瓶中，加入地下水。

土水配比：土壤100-200g，地下水：1-2L

C、将三角瓶放在90-100℃下水浴加热3次，每次3-5小时。

D、冷却沉降，用虹吸法将上清液吸入2000mL三角瓶。

E、将收集的上清液进行抽滤，收集滤液，装入2000mL三角瓶，封口。

F、将抽滤液于高压蒸汽灭菌(121℃，1h)，冷却即得所制，置于1-4℃冰箱冷藏，备用。

实施例1用单体异形胞繁育葛仙米藻种

步骤一、诱导形成多异形胞串联藻体；

挑选对数生长期的3mm葛仙米，按15g/L接入装有无菌营养液的2000mL三角瓶，在瓶口加上封口膜，而后置于恒温摇床上，120rmp，12000Lux，28℃，高密度摇晃培养18天，取样镜检观察到藻丝内出现2-3个异形胞串联为止。

所述营养液组分为：氯化镁0.075g；磷酸氢二钾0.02g，氯化铁0.006g，氯化钙0.036g，碳酸氢钠0.02g，葡萄糖0.01g，氯化钠0.01g，蒸馏水1L。制备方法包括按配比称取各原料，按常规方法混匀、灭菌。

步骤二、分离异形胞：异形胞的抗逆性好于营养细胞，通过一定的处理裂解营养细胞，连同离心技术，将异形胞和营养细胞分离开来，获得纯度高活性高的葛仙米单体异形胞。

步骤三、配制异形胞培养液：按以下组分配制，于高压蒸汽灭菌锅内，121℃，灭菌60min，冷却即得。

培养液中的组分：琼脂粉0.3g，葛仙米多糖干粉0.45g，硫酸镁0.05g，磷酸氢二钾0.0025g，氯化钙0.0045g，氯化铁0.00055g，玉米素0.0003g，土壤浸提液50mL，蒸馏水1L。

步骤四、接异形胞培养：将步骤二中分离的葛仙米异形胞接种于装有无菌培养液的三角瓶中，摇晃使得异形胞均匀分散，嵌悬于培养液中，封闭瓶口。于光强2000lux的LED红光、温度30℃、湿度75％的培养空间静置培养；可采用图1所示的装置培养；

步骤五、镜检及收集藻种：在培养液中能肉眼观察绿色小颗粒藻体时，定期取样镜检观察，当新藻体球径到0.1mm，用0.1mm分样筛收集即得。

其中，步骤二分离异形胞具体包括以下步骤：

1)消毒：选多异形胞串联的葛仙米15g，加70-75％酒精浸泡5秒，取出立即用无菌蒸馏水清洗3次，去掉残留酒精。

2)破碎及过滤：按葛仙米重量(湿重):无菌蒸馏水体积为1g/8mL的配比，倒入粉碎机中将葛仙米粉碎成藻浆，再用0.1mm的滤网过滤，分别收集滤液和滤渣(即葛仙米滤渣)。

3)裂解营养细胞：将滤液分装入50mL的EP(eppendorf)管内，1000rpm离心5分钟，去掉上清液，每管加入50mL的10％(体积分数)的甘油溶液溶解沉淀，而后放入超低温冰箱，-80℃下处理45h。

4)紫外辐照：取出于15-20℃下融化，于1000转离心5分钟，去掉甘油，用少量无菌蒸馏水溶解，而后紫外辐照30h，进一步灭活残留的营养细胞。

5)收集异形胞：收集步骤4)中的细胞液，均分到50mL离心管，用蒸馏水定容到50mL刻度后，900rpm离心10min，去上清收集沉淀即得葛仙米单体异形胞。

培养结论：

异形胞育种的生活史与藻殖段育种的生活史(参见中国专利公布号CN104031865A)是具有本质的区别。藻殖段发育为多细胞同时发育，而单个异形胞的发育为单细胞发育。藻殖段发育形成端异形胞，且外生的微群体，而异形胞发育形成内生异形胞的微群体。发育后期是以出芽及群体二分裂的方式产生新藻体，从而增加细胞数量，达到育种的目的。由此可见，葛仙米异形胞具有全能性，在适宜条件下，可以发育出新的葛仙米藻体。

对比例1

与实施例1的区别仅在于：步骤一对数生长期的葛仙米群体，不经营养液诱导产生多异形胞串联藻体，直接裂解分离纯化得到异形胞，结果发现，得到的单体异形胞极少，发育的密度急剧下降。所以实施例1中的营养液的诱导产生多异形胞串联藻体是必要的，提高分离纯化异形胞得率及具有显著提高异形胞存活率的效应。

对比例2

与实施例1的区别仅在于：步骤三所选用的光源为日光灯，相比红光源而言，异形胞的育种周期延长了5天，结果延长了异形胞从双环细胞发育出藻丝细胞雏形的(生活史：A-D)周期。

对比例3

与对比例2的区别仅在于：步骤三中异形胞培养液不加玉米素，结果发现异形胞停滞不发育。

对比例4

与实施例1的区别仅在于：步骤三中异形胞培养液分别加入10mL和100mL的土壤浸提液。当加10mL土壤浸提液时，异形胞发育受阻；当加100mL土壤浸提液时，异形胞虽能发育，但发育密度下降。表现出营养不良阻碍发育及营养过剩降低存活率的趋势。

综上所述，实施例1与对比例比较而言，诱导产生多异形胞串联藻体、红光、玉米素、适量的土壤浸提液对异形胞的发育是必要的。由对比例的结果看，对比例的培养效果都差于实施例1。主要表现出降低异形胞存活率，发育迟缓，降低异形胞分离纯化得率，延长发育周期。因而实施例1的培养条件及培养方法、培养液最有利于异形胞发育。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.一种葛仙米异形胞嵌悬育种方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)利用营养液将对数生长期的葛仙米诱导形成多异形胞串联藻体；

所述营养液包括以下组分：氯化镁0.05-0.08g；磷酸氢二钾0.01-0.03g，氯化铁0.003-0.008g，氯化钙0.02-0.04g，碳酸氢钠0.01-0.03g，葡萄糖0.005-0.02g，氯化钠0.005-0.02g，蒸馏水0.5-1L；

所述诱导条件包括：光照强度10000-20000lux，温度25-30℃，震荡培养；

2)裂解所述多异形胞串联藻体，分离获得葛仙米单体异形胞；

3)培养所述葛仙米单体异形胞，获得葛仙米藻体；

所用培养液包括以下组分：琼脂粉0.1-0.5g，葛仙米多糖干粉0.1-0.8g，硫酸镁0.035-0.075g，磷酸氢二钾0.001-0.004g，氯化钙0.003-0.006g，氯化铁0.0003-0.0008g，玉米素0.0001-0.0005g，土壤浸提液20-80mL，蒸馏水0.5-1L；

所述培养条件包括：光照强度500-3000lux的红光，温度20-38℃，湿度60-90％，静置培养。

2.根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于，步骤1)所述营养液包括以下组分：氯化镁0.075g；磷酸氢二钾0.02g，氯化铁0.006g，氯化钙0.036g，碳酸氢钠0.02g，葡萄糖0.01g，氯化钠0.01g，蒸馏水1L；和/或，

步骤1)所述诱导条件包括：光照强度12000lux，温度28-30℃，震荡培养。

3.根据权利要求1或2所述的育种方法，其特征在于，步骤2)包括如下步骤：

1)消毒：将所述多异形胞串联藻体用酒精消毒后立即用无菌蒸馏水清洗去掉残留酒精；

2)破碎：将消毒后的所述多异形胞串联藻体加适量无菌蒸馏水后破碎，制成藻浆，用0.1mm的滤网过滤，得滤液和滤渣；

3)裂解营养细胞：将步骤2)制备的滤液离心，去上清，加入适量甘油溶解沉淀，置于-70～-80℃下冷冻处理24-48h；

4)紫外辐照：将步骤3)冷冻处理后的样品于15-20℃下融化，离心，去掉甘油，用适量无菌蒸馏水溶解，紫外辐照24-48h，进一步灭活残留的营养细胞；

5)收集异形胞：收集步骤4)中的细胞液，离心，去上清，收集沉淀即得葛仙米单体异形胞。

4.根据权利要求1或2所述的育种方法，其特征在于，步骤3)所用培养液包括以下组分：琼脂粉0.3g，葛仙米多糖干粉0.45g，硫酸镁0.05g，磷酸氢二钾0.0025g，氯化钙0.0045g，氯化铁0.00055g，玉米素0.0003g，土壤浸提液50mL，蒸馏水1L；和/或，

步骤3)所述培养条件包括：光照强度2000lux的红光，温度28-30℃，湿度75％，静置培养。

5.根据权利要求1或2所述的育种方法，其特征在于，所述葛仙米多糖干粉的制备方法包括以下步骤：以葛仙米或权利要求3所述方法所得葛仙米滤渣为原料，加适量蒸馏水稀释，置于0～-80℃冷冻处理3次，每次24-48小时；取出融化，离心，去上清，收集沉淀，研磨成浆，浓缩，喷雾干燥，收集干粉过100-200目筛，即得葛仙米多糖干粉。

6.根据权利要求1或2所述的育种方法，其特征在于，所述土壤浸提液的制备方法包括以下步骤：以g/L计，按照土壤重量与地下水体积比为100-200:1-2混匀，90-100℃水浴加热3次，每次3-5小时；冷却沉降，吸取上清液，抽滤，滤液灭菌，即得所述土壤浸提液。

7.一种培养葛仙米单体异形胞形成葛仙米藻体的培养液，其特征在于，所述培养液包括以下组分：琼脂粉0.1-0.5g，葛仙米多糖干粉0.1-0.8g，硫酸镁0.035-0.075g，磷酸氢二钾0.001-0.004g，氯化钙0.003-0.006g，氯化铁0.0003-0.0008g，玉米素0.0001-0.0005g，土壤浸提液20-80mL，蒸馏水0.5-1L。

8.根据权利要求7所述的培养液，其特征在于，所述培养液包括以下组分：琼脂粉0.3g，葛仙米多糖干粉0.45g，硫酸镁0.05g，磷酸氢二钾0.0025g，氯化钙0.0045g，氯化铁0.00055g，玉米素0.0003g，土壤浸提液50mL，蒸馏水1L。

9.权利要求7或8所述培养液在葛仙米异形胞嵌悬育种上的应用。