CN111040963B - 一种葛仙米藻殖段诱导方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种葛仙米藻殖段诱导方法，通过把葛仙米群体诱导成具有藻殖段释放信号的灰绿色群体；及利用撕裂这种温和的方法，使得群体完全失去渗透保护，辅以通气及前后条件剧烈变化的多重诱导下，促使藻丝折断而分化成葛仙米藻殖段。有益效果：绝对真空下的碳源缺失，在辅以增强葛仙米光合作用的温度光照条件的协同作用下，诱使葛仙米群体色素降解而成为具有藻殖段释放信号的葛仙米群体，再采用撕裂后通气诱导，使得藻丝能顺利地破胶质鞘而出，发生折断而分化成具有“伪空泡”的藻殖段，均匀分散于诱导培养液中，极大地缩短了藻殖段诱导周期，且造成的机械损伤极小，在诱导过程中具有藻殖段发育所需的营养和光照，有效地增强藻殖段的发育活性。
Description
技术领域
本发明涉及葛仙米的培植技术领域，具体为一种葛仙米藻殖段诱导方法。
背景技术
葛仙米是一种淡水固氮蓝藻，为典型念珠藻之一。藻殖段繁殖是念珠藻的主要繁殖方式。一种快捷快速的藻种繁育技术是葛仙米规模化培养的核性技术，而藻种繁育技术的核心又在于拥有一种速度快、活性高、数量大的藻殖段诱导方法。有关葛仙米育种技术中，分别采用藻殖段和匀浆藻丝为起点繁育内部藻丝呈丝状分布的葛仙米微球体，与匀浆藻丝相比藻殖段繁育葛仙米微球体更具优越性，其表现为藻殖段发育快，周期短，由藻殖段发育而成的葛仙米球体具有更高的应对环境突变的能力。在自然状态下，念珠藻群体低频释放藻殖段来繁衍生息，所释放藻殖段的数量极少，难以满足葛仙米规模化生产育种的需要。
诱导藻殖段分化的基础是群体破裂，这是缩短藻殖段诱导周期的关键。中国专利(申请号： 99120005.5)，藻种制备中采用的方法是用氨苄青莓素除菌，然后纯培养并诱导藻殖段，最后对藻殖段进行培养，获得藻种。该方法操作复杂，需抗生素进行无菌纯化，藻种制备周期长，形成藻殖段的数量相对较少，难以适应大规模繁育藻种的需要。现有专利(申请号：201410269492.4)将葛仙米球体浸泡于纯化水中，并进行光源诱导，待葛仙米球体自发破裂后收集滤液，而获得藻殖段，虽然获得不错藻殖段诱导效果，但促使葛仙米破裂的动力是营养饥饿，通常生物体对饥饿具有一定的耐受期限，以营养饥饿作为诱导葛仙米藻殖段的动力对藻殖段诱导效率具有不可忽视的影响，诱导时长较长；再者静态诱导，葛仙米中富含的黏性胶质使得藻殖段抱团堆积而分散性较差；一般藻殖段保持活性的方式是从环境中吸收营养而开始发育，而纯化水中营养匮乏，不能满足藻殖段发育的营养需要而至藻殖段活性偏低。
藻殖段是葛仙米球体在不适应外界环境变化的情况下自发破裂释放出来的具有“伪空泡”的短链藻丝，“伪空泡”是指示藻殖段活性的关键指标。在葛仙米大规模生产实践过程中，在培养环境剧烈变化时，发现大粒径葛仙米对环境突变的应对能力较弱，其最初的表现是葛仙米颜色从黑色变成灰绿色，可见这种色素降解是诱导葛仙米释放藻殖段的重要信号，而后葛仙米群体表面开始溶解而释放藻殖段；在正常培养条件下，发现大粒径葛仙米群体表面易于出现破孔而逐步释放藻殖段，最终仅剩一空壳浮于液面，可见藻表破孔后葛仙米失去胶质鞘的渗透保护作用，对葛仙米藻殖段的释放具有重要作用；一般大粒径的葛仙米群体另一个重要特点是藻细胞数量大而藻殖段释放量也大。根据以上所观察的特点，有必要对葛仙米藻殖段诱导技术进行创新，而获得更佳优越、更快且能很好地保护藻殖段活性的藻殖段诱导方法。鉴于此，本发明通过人为的干预而开发一种全新的葛仙米藻殖段诱导技术。
发明内容
针对现有葛仙米藻殖段诱导技术的不足，本发明的目的是提供一种葛仙米藻殖段诱导方法，把葛仙米群体诱导成具有藻殖段释放信号的灰绿色群体；及利用撕裂这种温和的方法，使得群体完全失去渗透保护，辅以通气及前后条件剧烈变化的多重诱导下，促使藻丝折断而分化成葛仙米藻殖段。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种葛仙米藻殖段诱导方法，具体步骤如下：
1)优选葛仙米群体，获得形态圆润、大粒径的葛仙米群体
筛出形态圆润，色泽均一，硬度适中的大粒径葛仙米群体；
2)通过真空温度光照的协同诱导，获得因色素降解而具有藻殖段释放信号的灰绿色葛仙米群体
将步骤1)中优选葛仙米群体装入蒸煮袋中，添加信号诱导培养液，抽真空30-50秒封口后，置温度 30-40℃，光强度10000-15000lux，静置培养20-40小时，葛仙米色素降解而获得具备藻殖段释放信号的灰绿色葛仙米群体；
所述信号诱导培养液包括以下组分：
从葛仙米体内提取的葛仙米植物水1-3L，K2HPO4·3H2O：30-80mg/L；氯化铵：10-30mg/L；CaCl2·2H2O： 30-72mg/L；柠檬酸：2-6mg/L；柠檬酸铁铵：2-6mg/L；H3BO3：4.72-9.44mg/L，用0.1mol/L的氢氧化钠溶液将培养液的pH调节至8-9.5；
所述葛仙米植物水可按现有技术提取而得；
3)撕裂步骤2)中的葛仙米群体，获得具有“V”形裂缝的葛仙米藻块
用洁净镊子将步骤2)中获得的葛仙米群体，撕裂成具有“V”形裂缝的葛仙米藻块；
4)通气诱导，获得藻殖段
将步骤3)中葛仙米藻块接种于诱导培养液中，在光强500-1000lux，温度为2-10℃下，通气诱导，诱使葛仙米藻块自溶解体，藻丝折断分化成具有“伪空泡”的藻殖段；
所述诱导培养液包括以下组分：
蒸馏水1-3L，NaHCO3：30-60mg/L，K2HPO4·3H2O：60-100mg/L，氯化铵：5-20mg/L，CaCl2·2H2O ：30-72mg/L，NaHCO3：40-80mg/L，H3BO3：2.32-5.72mg/L，土壤浸出液5-10ml/L，用0.1mol/L的盐酸溶液将培养液的pH调节至6.0-7.0；
所述土壤浸出液可按现有技术制备而得；
优选的，所述步骤1)中的葛仙米群体粒径为6-8mm；
进一步优选的，所述步骤1)葛仙米群体为6-8mm且藻体表面具有破孔趋势的葛仙米群体；
优选的，所述步骤2)中的抽真空时长为35秒，温度37℃，光强：12000lux，诱导培养时长24 小时；
优选的，所述步骤2)中，信号诱导培养液包括以下组分：
葛仙米植物水2L，K2HPO4·3H2O：40mg/L，氯化铵：20mg/L，CaCl2·2H2O：36mg/L，柠檬酸：3mg/L ，柠檬酸铁铵：3mg/L，H3BO3：5.72mg/L，用0.1mol/L的氢氧化钠溶液将培养液的pH调节至9.0；
优选的，所述步骤4)中，将葛仙米群体撕成“V”形裂口的一分为二的连体藻块；
优选的，所述步骤4)中，光强为800lux，温度为：8℃；
优选的，所述步骤4)中，诱导培养液包括以下组分：
蒸馏水2L，NaHCO3：40mg/L，K2HPO4·3H2O：40mg/L，氯化铵：15mg/L，CaCl2·2H2O：48mg/L，NaHCO3： 60mg/L，H3BO3：2.86mg/L，土壤浸出液10ml/L，用0.1mol/L的盐酸溶液将培养液的pH调节至6.5。与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
1、绝对真空下的碳源缺失，在辅以增强葛仙米光合作用的温度光照条件的协同作用下，将黑色葛仙米群体诱导成具有藻殖段释放信号的灰绿色葛仙米。
2、采用撕裂这种温和的方式，让葛仙米群体提前破裂而完全失去渗透保护，使得藻丝能顺利地破胶质鞘而出，发生折断而分化成具有“伪空泡”的藻殖段，极大地缩短了藻殖段诱导周期，且造成的机械损伤极小。
3、在诱导过程中通气，促使藻丝折断，不仅加速藻殖段分化，还很好地将藻殖段分散开来，有效地避免藻殖段抱团堆积而影响活性。
4、遵循葛仙米抵抗突变环境释放藻殖段的基本规律，短时间内环境条件骤变，营造模拟藻殖段释放的不利环境从而加快葛仙米群体释放藻殖段，缩短诱导周期。
5、藻殖段释放后的环境中，具有藻殖段发育的营养物质和光照，有效保护藻殖段的活性。
6、所选葛仙米群体是本身具有藻殖段释放潜力的藻表破孔的群体，以此群体诱导的藻殖段，其发育欲望强而活性高。
7、本发明的方法简单，所选葛仙米群体粒径大而藻丝储备量大，藻殖段诱导量大，能够在较短的时间内诱导大量高活性的藻殖段，很好地满足葛仙米规模化生产制种对藻殖段的需求。
附图说明
图1：藻殖段诱导效果示意；
图2：藻殖段中的伪空泡示意；
图3：翡翠绿葛仙米藻殖段诱导过程示意；
图4：翡翠绿葛仙米藻殖段发育活性示意；
图5：翡翠绿葛仙米藻殖段发育而成藻种示意。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：按照本发明的方法诱导藻殖段试验
1)优选葛仙米群体，获得形态圆润、大粒径的葛仙米群体
筛出形态圆润、色泽均一、硬度适中的粒径6-8mm葛仙米群体；
2)通过真空温度光照的协同诱导，获得因色素降解而具有藻殖段释放信号的灰绿色葛仙米群体
将步骤1)中优选葛仙米群体装入蒸煮袋中，添加信号诱导培养液，抽真空35秒封口后，置温度 37℃，光强度为12000lux，静置培养24小时，葛仙米色素降解而获得具备藻殖段释放信号的灰绿色葛仙米群体；
所述信号诱导培养液包括以下组分：
葛仙米植物水2L，K2HPO4·3H2O：40mg/L，氯化铵：20mg/L，CaCl2·2H2O：36mg/L，柠檬酸：3mg/L，柠檬酸铁铵：3mg/L，H3BO3：5.72mg/L，用0.1mol/L的氢氧化钠溶液将培养液的pH调节至9.0；
3)撕裂步骤2)中的葛仙米群体，获得具有“V”形裂缝的葛仙米藻块
用洁净镊子将步骤2)中获得的葛仙米群体，撕裂成具有“V”形裂开的葛仙米藻块；
4)通气诱导，获得藻殖段
将步骤3)中葛仙米藻块接种于诱导培养液中，在光强800lux，温度为8℃下，通气诱导，诱使葛仙米藻块自溶解体，藻丝折断分化成具有“伪空泡”的藻殖段；
所述诱导培养液包括以下组分：
蒸馏水2L，NaHCO3：40mg/L，K2HPO4·3H2O：40mg/L，氯化铵：15mg/L，CaCl2·2H2O：48mg/L，NaHCO3： 60mg/L，H3BO3：2.86mg/L，土壤浸出液10ml/L，用0.1mol/L的盐酸溶液将培养液的pH调节至6.5。
所述土壤浸出液可按现有技术制备而得。
试验结果如下：
表1藻殖段诱导时长及进程
| 诱导时长 | 0h | 24h | 48h | 72h |
| 诱导进程 | 图1-A | 图1-B/图1-C | 图1-D | 图1-E/图1-F/图2 |
观察图1中，A：真空包装6-8mm黑色葛仙米群体；B：获得藻殖段释放信号(色素降解而变绿) 的葛仙米群体；C：撕裂图1-B中葛仙米群体后通气；D：通气诱导24小时，葛仙米群体溶解且液色浑浊；E：葛仙米群体完全分解释放藻殖段；F：无异形胞且具有“伪空泡”的藻殖段。
观察图2中，b：藻殖段细胞内分化的折光性较强的“伪空泡”。
由以上结果可见，本发明诱导藻殖段的时长为3天，诱导率为100％，组成藻殖段的细胞内的“伪空泡”分化充分且均匀，可见藻殖段活性较高。
实施例2：藻殖段发育活性及适用性验证试验
本实施例2与实施例1中的区别在于，在藻殖段诱导方法中，所选用的葛仙米为翡翠绿葛仙米新品种。具体藻殖段发育活性及适用性验证试验方法如下：
用纯化水将诱导获得的藻殖段滤液稀释20倍后接种于BG110琼脂固体培养基(按现有技术制备) 上，在温度25℃，光强3000lux下，静置培养，在10天，15天，25天，30天时，观察在固体培养基表面的发育状态，其结果如表2、表3、图3、图4、图5所示。
表2藻殖段诱导
| 诱导周期 | 24h | 48h | 72h |
| 发育状态 | 图3-A、图3-B | 图3-C | 图3-D |
观察图3中，A：真空包装获得藻殖段释放信号的翡翠绿葛仙米群体；B：撕裂葛仙米群体后通气； C：通气诱导24h的葛仙米群体开始分解；D：通气诱导72h的葛仙米群体完全分解释放藻殖段。
表3翡翠绿葛仙米藻殖段发育活性
| 培养周期 | 10天 | 15天 | 25天 | 30天 |
| 发育状态 | 图4-A | 图4-B | 图4-C | 图4-D |
图5-A：培养25天时，葛仙米球体；图5-B：培养30天时，葛仙米球体。
通过以上实验例，本发明的方法诱导葛仙米球体释放藻殖段的诱导率为100％，诱导时长短至3天。所诱导的藻殖段接种于固体培养基上，育成葛仙米原始藻种密度极高。可见本发明的诱导藻殖段方法，不仅缩短藻殖段诱导时长而有效地缩短育种周期，而且藻殖段活性较高。本发明藻殖段诱导方法对不同品种葛仙米藻殖段均具有相同的诱导效果，可见其具有较好的适用性。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其它实施方式。
Claims (7)
1.一种葛仙米藻殖段诱导方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）筛选葛仙米群体，获得形态圆润、大粒径的葛仙米群体
筛出形态圆润，色泽均一，硬度适中的大粒径葛仙米群体；
2）通过真空温度光照的协同诱导，获得因色素降解而具有藻殖段释放信号的灰绿色葛仙米群体
将步骤1）中葛仙米群体装入蒸煮袋中，添加信号诱导培养液，抽真空30-50秒封口后，置温度30-40℃，光强度10000-15000lux，静置培养20-40小时，葛仙米色素降解而获得具备藻殖段释放信号的灰绿色葛仙米群体；
所述信号诱导培养液由以下组分组成：
从葛仙米体内提取的葛仙米植物水1-3L，K2HPO4·3H2O：30-80mg/L；氯化铵：10-30mg/L；CaCl2·2H2O：30-72mg/L；柠檬酸：2-6mg/L；柠檬酸铁铵：2-6mg/L；H3BO3：4.72-9.44mg/L，用0.1mol/L的氢氧化钠溶液将培养液的pH调节至8-9.5；
所述葛仙米植物水可按现有技术提取而得；
3）撕裂步骤2）中的葛仙米群体，获得具有“V”形裂缝的葛仙米藻块
用洁净镊子将步骤2）中获得的葛仙米群体，撕裂成具有“V”形裂缝的葛仙米藻块；
4）通气诱导，获得藻殖段
将步骤3）中葛仙米藻块接种于诱导培养液中，在光强500-1000lux，温度为2-10℃下，通气诱导，诱使葛仙米藻块自溶解体，藻丝折断分化成具有“伪空泡”的藻殖段；
所述诱导培养液由以下组分组成：
蒸馏水2L，NaHCO3：40mg/L，K2HPO4·3H2O：40mg/L，氯化铵：15mg/L，CaCl2·2H2O：48mg/L，NaHCO3：60mg/L，H3BO3：2.86mg/L，土壤浸出液10ml/L，用0.1mol/L的盐酸溶液将培养液的pH调节至6.5；
所述土壤浸出液可按现有技术制备而得。
2.根据权利要求1所述的一种葛仙米藻殖段诱导方法，其特征在于，步骤1）中的葛仙米群体粒径为6-8mm。
3.根据权利要求2所述的一种葛仙米藻殖段诱导方法，其特征在于，步骤1）中的葛仙米群体为6-8mm且藻体表面具有破孔趋势的葛仙米群体。
4.根据权利要求1所述的一种葛仙米藻殖段诱导方法，其特征在于，步骤2）中的抽真空时长为35秒，温度37℃，光强：12000lux，诱导培养时长24小时。
5.根据权利要求1或2所述的一种葛仙米藻殖段诱导方法，其特征在于，步骤2）中，信号诱导培养液由以下组分组成：葛仙米植物水2L，K2HPO4·3H2O：40mg/L，氯化铵：20mg/L，CaCl2·2H2O：36mg/L，柠檬酸：3mg/L，柠檬酸铁铵：3mg/L，H3BO3：5.72mg/L，用0.1mol/L的氢氧化钠溶液将培养液的pH调节至9.0。
6.根据权利要求1或2所述的一种葛仙米藻殖段诱导方法，其特征在于，步骤3）中，将葛仙米群体撕成“V”形裂口的一分为二的连体藻块。
7.根据权利要求1或2所述的一种葛仙米藻殖段诱导方法，其特征在于，步骤4）中，光强为800lux，温度为8℃。
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