CN110393152B - 一种改良ms液体培养基及蛇足石杉无菌茎尖培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种改良MS液体培养基及蛇足石杉无菌茎尖培养方法，所述的改良MS液体培养基为在原有的MS液体培养基中加入条件培养液，所述的条件培养液为蛇足石杉茎段培养液；将蛇足石杉茎尖培养在改良MS液体培养基中，并于红光下培养。该操作方法简单易行，为蛇足石杉茎尖无菌体系的建立提供新途径。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种改良MS液体培养基及蛇足石杉无菌茎尖培养方法。
背景技术
蛇足石杉(Huperzia serrata(Thunb.)Trev.)为石松目(Lycopodiales)石杉科(Lycopodiaceae)石杉属(Lycopodium L.)多年生草本蕨类植物。蛇足石杉在民间主要用于治疗跌打肿痛、内伤出血、毒虫毒蛇咬伤、烧伤烫伤等病症。蛇足石杉生长缓慢，野生状态其的繁殖主要以孢子繁殖为主，孢子萌发周期长，萌发后属地下生配子体，需6-15年才能成熟。
1927年我国科技工作者报道了从该植物中分离的石杉碱甲具有横纹肌松弛作用，之后的大量研究发现石杉碱甲是一种高效、低毒、可逆和高选择性的乙酰胆碱酯酶抑制剂。现在，被石杉碱甲及经作为治疗阿尔茨海默病(AD，Alzheimer disease)的药物，同时在美国被用做益智的营养保健品。目前，由于化学合成的石杉碱甲临床副作用较大，其来源主要依赖于野生资源，提取率仅为0.006％-0.1％。因此，逐年下去，野生蛇足石杉的资源面临枯竭，而且其生长地的生态环境面临人为严重破坏。
植物组织培养为珍稀濒危植物的人工繁殖提供了重要的途径。之前，很多研究者也尝试通过组织培养平台对蛇足石杉进行快速繁殖，但是成功率很低。这一方面阻碍了蛇足石杉人工繁殖，另一方面延滞了蛇足石杉实验室分子改良的进程。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种改良MS液体培养基及蛇足石杉无菌茎尖培养方法，是通过将蛇足石杉无菌的茎尖接种在改良的MS培养上，再放置到红光下合适的温度中培养，达到提高无菌茎尖成活率的目的。
为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：
一种改良MS液体培养基，所述的改良MS液体培养基为在原有的MS液体培养基中加入条件培养液，所述的条件培养液为蛇足石杉茎段培养液。
可选的，按体积百分比计，条件培养液加入MS液体培养基中的量为10％～40％。
可选的，按体积百分比计，条件培养液加入MS液体培养基中的量为20％。
可选的，按照每100mL的MS液体培养基添加5g蛇足石杉茎段的计量室温培养，摇床转速为100转/分钟，培养3天后收集培养液即得蛇足石杉茎段培养液。
可选的，按体积百分比计，在所述的MS液体培养基中还加入蔗糖，蔗糖的加入量为0.5％～1.5％。
可选的，按体积百分比计，在所述的MS液体培养基中还加入蔗糖，蔗糖的加入量为1％。
一种蛇足石杉无菌茎尖培养方法，包括将蛇足石杉茎尖培养在改良MS液体培养基中，并于红光下培养；所述的改良MS液体培养基为本发明所述的改良MS液体培养基。
可选的，所述的红光的强度为500～2000Lux。
可选的，所述培养的温度为25～35℃。
优选的，所述的红光的强度为1000Lux；所述培养的温度为30℃。
本发明进行蛇足石杉插条生根的方法，具有以下优点：
本发明的蛇足石杉无菌茎尖的培养的方法，是通过将蛇足石杉无菌的茎尖接种在改良的MS培养上，再放置到红光下合适的温度中培养，达到提高无菌茎尖成活率的目的。方法简单易行，为蛇足石杉蛇足石杉茎尖无菌体系的建立提供新途径。
具体实施方式
以下如无特殊说明，涉及试剂或液体的加入量中，出现的％指的是体积百分浓度。
野生蛇足石杉的采集地的信息为湖北省恩施地区，湖北省恩施市盛家坝乡，经纬度：109°18′/29°57′。
蛇足石杉无菌茎尖：是指以野生蛇足石杉的茎尖为材料，进行表面消毒后切割成3-5cm的茎尖。茎尖成活率是指在茎尖培养60天后，呈现绿色生长旺盛的茎尖在当时接种的茎尖总数的百分比，如果茎尖50％褪绿发褐或变灰变黑，则认为死亡。
以下所述的MS液体培养基也称MS培养基。MS培养基是常用的基本培养基，是Murashige和Skoog于1962年为烟草细胞培养设计的，其特点是无机盐和离子浓度较高，是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量高，其养分的数量和比例合适，能满足植物细胞的营养和生理需要，因而适用范围比较广，多数植物组织培养快速繁殖用它作为培养基的基本培养基。
将蛇足石杉的叶片切除，茎段洗干净，切割成1厘米的小段，按照每100毫升MS液体培养基添加5克茎段的计量放置到三角瓶中，然后再放置到摇床上室温培养，摇床转速为100转/分钟。培养3天后，去掉茎段，将培养液用灭过菌的细菌过滤器过滤除菌，即得条件培养液。然后按照每升MS培养基添加10％-40％的比例配制成改良的MS培养基。
将野生蛇足石杉植株洗干净，取茎尖，用常规外植体灭菌的方法除去茎尖表面微生物，再接种到改良的MS固体培养基上，培养基中蔗糖的添加剂量为0.5-2％，然后放置于强度为500-2000Lux的红光下培养，培养温度为25-35℃，培养60天后，统计茎尖的成活率。
最佳的培养条件为：在改良的MS培养基中，蛇足石杉茎段培养液的最适添加比例为20％；在改良的MS培养基中，蔗糖的最适添加剂量为1％；红光的光强最适为1000Lux；最适的培养温度为30℃。在这样的条件下，培养60天后，统计茎尖的成活率可达到84％。
以下结合实施例和对比例对本发明作进一步的详细说明。
对比例：
(1)蛇足石杉茎尖的灭菌
在野外采集蛇足石杉植株，清洗表面尘土，切取茎尖(4-6cm)。然后将茎尖用70％的酒精浸泡1分钟，取出后直接浸泡如8％的次氯酸钠溶液中灭菌8分钟，取出并用无菌水冲洗，然后再用0.1％的升汞灭菌8分钟，再用无菌水冲洗三次，最后切割生成3-5cm，即获得用于培养的茎尖。
(2)蛇足石杉茎尖的培养
将茎尖培养在MS固体培养基中，MS培养基中蔗糖添加量1％，然后放置在日光灯光强为1000Lux的室温中培养，培养温度为25℃。60天，统计茎尖的成活率为36％。
实施例1：
(1)蛇足石杉茎尖的灭菌
同对比例。
(2)改良MS培养基制备
改良MS培养基的制备：在野外采集蛇足石杉植株，清洗表面尘土，切除叶片，将茎段切割成1厘米的小段，按照每100毫升MS液体培养基添加5克茎段的计量放置到三角瓶中，然后再放置到摇床上室温培养，摇床转速为100转/分钟。培养3天后，去掉茎段，将培养液用灭过菌的细菌过滤器过滤除菌，即得蛇足石杉茎段培养液。然后按照每升MS培养基添加10％蛇足石杉茎段培养液的比例配制成改良的MS培养基。
(3)蛇足石杉茎尖的培养
将灭过菌的蛇足石杉茎尖接种到改良MS培养基中，培养基中蔗糖添加量1％，然后放置到光强为500Lux的红光下培养，培养温度为25℃。60天，统计茎尖的成活率为57％。
实施例2：
(1)蛇足石杉茎尖的灭菌
同对比例。
(2)改良MS培养基制备
同实施例1。所不同实施例1的地方是MS培养基添加20％蛇足石杉茎段培养液的比例配制成改良的MS培养基。
(3)蛇足石杉茎尖的培养
将灭过菌的蛇足石杉茎尖接种到改良MS培养基中，培养基中蔗糖添加量1％，然后放置到光强为1000Lux的红光下培养，培养温度为30℃。60天，统计茎尖的成活率为84％。
实施例3：
(1)蛇足石杉茎尖的灭菌
同对比例。
(2)改良MS培养基制备
同实施例2。
(3)蛇足石杉茎尖的培养
同实施例2。不同实施例2的地方是培养基中蔗糖添加量2％。60天，统计茎尖的成活率为75％。
实施例4：
(1)蛇足石杉茎尖的灭菌
同对比例。
(2)改良MS培养基制备
同实施例2。
(3)蛇足石杉茎尖的培养
同实施例2。不同实施例2的地方是红光强为2000Lux。60天，统计茎尖的成活率为77％。
实施例5：
(1)蛇足石杉茎尖的灭菌
同对比例。
(2)改良MS培养基制备
同实施例2。
(3)蛇足石杉茎尖的培养
同实施例2。不同实施例2的地方是培养温度为35℃。60天，统计茎尖的成活率为69％。
实施例6：
(1)蛇足石杉茎尖的灭菌
同对比例。
(2)改良MS培养基制备
同实施例2。所不同实施例2的地方是MS培养基添加40％蛇足石杉茎段培养液的比例配制成改良的MS培养基。
(3)蛇足石杉茎尖的培养
同实施例2。60天，统计茎尖的成活率为70％。
实施例7：
(1)蛇足石杉茎尖的灭菌
同对比例。
(2)改良MS培养基制备
同实施例5。
(3)蛇足石杉茎尖的培养
同实施例2。不同实施例2的地方是培养基中蔗糖的添加剂量为0.5％。60天，统计茎尖的成活率为67％。
实施例8：
(1)蛇足石杉茎尖的灭菌
同对比例。
(2)改良MS培养基制备
同实施例5。
(3)蛇足石杉茎尖的培养
同实施例2。不同实施例2的地方是红光的强度为2000Lux，培养温度为35℃。60天，统计茎尖的成活率为60％。
实施例9：
(1)蛇足石杉茎尖的灭菌
同对比例。
(2)改良MS培养基制备
同实施例1。
(3)蛇足石杉茎尖的培养
同实施例2。60天，统计茎尖的成活率为79％。
Claims (7)
1.一种改良MS液体培养基，其特征在于，所述的改良MS液体培养基为在原有的MS液体培养基中加入条件培养液，所述的条件培养液为蛇足石杉茎段培养液；
按体积百分比计，条件培养液加入MS液体培养基中的量为10%～40%；
按照每100mL的MS液体培养基添加5g蛇足石杉茎段的计量室温培养，摇床转速为100转/分钟，培养3天后收集培养液即得蛇足石杉茎段培养液；
按体积百分比计，在所述的MS液体培养基中还加入蔗糖，蔗糖的加入量为0.5%～1.5%。
2.根据权利要求1所述的改良MS液体培养基，其特征在于，按体积百分比计，条件培养液加入MS液体培养基中的量为20%。
3.根据权利要求1或2所述的改良MS液体培养基，其特征在于，按体积百分比计，在所述的MS液体培养基中还加入蔗糖，蔗糖的加入量为1%。
4.一种蛇足石杉无菌茎尖培养方法，其特征在于，包括将蛇足石杉茎尖培养在改良MS液体培养基中，并于红光下培养；
所述的改良MS液体培养基为权利要求1-3任一权利要求所述的改良MS液体培养基。
5.根据权利要求4所述的蛇足石杉无菌茎尖培养方法，其特征在于，所述的红光的强度为500～2000Lux。
6.根据权利要求4所述的蛇足石杉无菌茎尖培养方法，其特征在于，所述培养的温度为25～35℃。
7.根据权利要求4所述的蛇足石杉无菌茎尖培养方法，其特征在于，所述的红光的强度为1000Lux；所述培养的温度为30℃。
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