CN102919129B - 一种以珙桐叶片为外植体的组织培养获得珙桐再生苗的方法 - Google Patents

一种以珙桐叶片为外植体的组织培养获得珙桐再生苗的方法 Download PDF

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Abstract

一种以珙桐叶片为外植体的组织培养获得珙桐再生苗的方法，步骤如下：（1）珙桐叶片愈伤组织获得；（2）愈伤组织增殖；（3）诱导丛生芽；（4）丛生芽增殖；（5）诱导生根。上述方法中，步骤（1）至步骤（5）中的环境温度为22~26℃，环境湿度优选60%~90%。使用上述方法，愈伤组织的分化率较高，可达50%以上；生根率达100%，移栽成活率达90%以上。

Description

一种以珙桐叶片为外植体的组织培养获得珙桐再生苗的方法
技术领域
本发明属于通过组织培养获得再生苗的方法，特别涉及一种通过珙桐组织（叶片）培养获得珙桐再生苗的方法。
背景技术
珙桐(Davidia involucrata Baillon)亦称为水梨子或鸽子树，为珙桐科(Davidiaceae)珙桐属(Davidia)植物，是我国特有的单型属珍稀树种，作为第三纪古热带植物区系的孑遗种，被列为国家一级重点保护植物，需要加强保护。珙桐树高10~20米，开花时，其棕红色头状花序和基部两片苞叶的结构形似白鸽，远看就像一群白鸽栖息在绿荫丛中，因而也具有很高的观赏价值。
珙桐用种子繁殖较为不易，往往发芽率低、发芽时间长，故目前多采用无性繁殖。珙桐栽培中常用的无性繁殖方式包括扦插繁殖、嫁接繁殖、埋条繁殖和高压繁殖等。但这些繁殖方式繁殖系数低、速度较慢，且成活率不高，所以现在城市绿化中还见不到珙桐的身影。针对这一现状，采用组织培养方法来繁殖珙桐被越来越多的人所尝试，目前关于珙桐组织培养的报道主要集中在对愈伤组织的诱导与培养上，关于再生体系的研究较少。在仅有的再生体系研究中，又多以珙桐冬芽或带芽茎段做为外植体，在操作时需要采集在珙桐生长过程中非常重要的芽或茎，这会造成对珙桐这一濒危植物的破坏。而现在以珙桐叶片为外植体的再生体系效率极低，仅有的成功报道其愈伤组织分化率仅为6%，这并不能满足实际运用中的需要。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种以珙桐叶片为外植体的组织培养获得珙桐再生苗的方法，以提高珙桐叶片愈伤组织再生途径的效率，获得移栽成活率高的再生苗。
本发明所述以珙桐叶片为外植体的组织培养获得珙桐再生苗的方法，步骤如下：
（1）珙桐叶片愈伤组织获得
取灭菌后的幼嫩珙桐叶片，接种于愈伤组织诱导培养基上，避光培养25~30天，得到珙桐叶片愈伤组织，所述愈伤组织诱导培养基以MS为基础培养基，每升愈伤组织诱导培养基中含有吲哚丁酸1.5~2.5mg、6-苄氨基腺嘌呤0.5~1.5mg、蔗糖20~30g和琼脂粉5~5.8g，其pH值控制在5.8~6.1；
（2）愈伤组织增殖
将步骤（1）获得的珙桐叶片愈伤组织接种于愈伤组织增殖培养基上，避光培养18~28天，以使愈伤组织增大，所述愈伤组织增殖培养基以MS为基础培养基，每升愈伤组织增殖培养基中含有吲哚丁酸1.5~2.5mg、6-苄氨基腺嘌呤1~2.5mg 、蔗糖20~30g和琼脂粉5~5.8g，其pH值控制在5.8~6.1；
（3）诱导丛生芽
将步骤（2）增殖后的珙桐叶片愈伤组织切割后接种于芽分化培养基上，于光照强度1500~2000lx、光照时间10~14h/d的光照条件下培养25~30天，以诱导丛生芽，所述芽分化培养基以MS为基础培养基，每升芽分化培养基中含有吲哚丁酸 0.33~1mg、6-苄氨基腺嘌呤 3~10mg、蔗糖20~30g和琼脂粉5~5.8g，其pH值控制在5.8~6.1；
（4）丛生芽增殖
把步骤（3）获得的丛生芽切割后接种于芽增殖培养基上，于光照强度1500~2000lx、光照时间10~14h/d的光照条件下培养25~30天，以使丛生芽生长，所述芽增殖培养基以MS为基础培养基，每升芽增殖培养基中含有6-苄氨基腺嘌呤0.1~0.5mg、赤霉素0.1~0.5mg、蔗糖20~30g和琼脂粉5~5.8g，其pH值控制在5.8~6.1；
（5）诱导生根
从步骤（4）增殖后的丛生芽上切下幼芽，接种于第一生根培养基中培养3~6天，再转接到第二生根培养基中培养，在第二生根培养基中的培养时间以达到幼苗移栽要求为限（时间约25~30天），用上述两种生根培养基培养时的光照条件为：光照强度为1500~2000lx、光照时间10~14h/d，所述第一生根培养基以1/2MS培养基为基础培养基，每升第一生根培养基中含有生长素5~15mg、蔗糖15~20g和琼脂粉5~5.8g，其pH值控制在5.8~6.1，所述第二生根培养基以1/2MS培养基为基础培养基，每升第二生根培养基中含有活性炭1~2g、蔗糖15~20g和琼脂粉5~5.8g，其pH值控制在5.8~6.1。
上述方法中，步骤（1）至步骤（5）中的环境温度优选22~26℃。
上述方法中，步骤（1）至步骤（5）中的环境湿度优选60%~90%。
上述方法中，第一生根培养基中的生长素为吲哚乙酸、吲哚丁酸、萘乙酸中的任一种。
上述方法中，基础培养基MS的组成见“胡孔峰等. 植物组织培养技术及应用[M].郑州：河南科学技术出版社，2006”；1/2MS是将MS中大量元素母液组分（NH4NO3，KNO3，CaCl2·2H2O，MgSO4·7H2O，KH2PO4）的含量减半。
上述方法中，愈伤组织诱导培养基、愈伤组织增殖培养基、芽分化培养基、芽增殖培养基、第一生根培养基和第二生根培养基的pH值调节，采用浓度1mol/L的氢氧化钠溶液或浓度1mol/L的盐酸。
上述方法中，作为外植体的幼嫩珙桐叶片的灭菌可采用的外植体消毒方法有多种，常用消毒剂包括质量浓度70~75%的乙醇、氯化汞溶液、次氯酸钠溶液等。本发明优选的灭菌方法是：首先在洗洁精稀释溶液中浸泡以去除附着于叶片表面的污渍（时间约10min），然后用流水冲洗以去除杂质与洗洁精溶液（时间约1 h），再于无菌条件下依次用质量浓度75%的乙醇消毒（时间约30 s）、质量浓度0.1%的氯化汞水溶液消毒（时间约4 min），继后从氯化汞水溶液中取出幼嫩珙桐叶片用无菌水冲洗去除残留的消毒液。
本发明方法的有益效果：愈伤组织的分化率较高，可达50%以上；生根条数多、质量好，生根率达100%，移栽成活率达90%以上，再生体系总体效率好，可以运用于再生植株的大量生产及农杆菌介导的遗传转化研究。此外，实施本发明方法只需简单的植物组织培养设备即可，实用性强、操作简便，且不受季节限制。
附图说明
图1是采集作为外植体的珙桐幼嫩叶片的枝条图；
图2是在诱导培养基上培养诱导出的珙桐叶片愈伤组织图；
图3是在增殖培养基上培养增殖后的珙桐愈伤组织图；
图4是在芽分化培养基上培养初期分化出的珙桐丛生芽图；
图5是在芽分化培养基上培养30天分化出的珙桐丛生芽图；
图6是将珙桐丛生芽切割后接种于芽增殖培养基上培养前的状态图；
图7是在芽增殖培养基上培养增殖后的珙桐丛生芽图；
图8是在芽增殖培养基上培养增殖后用于生根的珙桐再生苗图；
图9是接种于第二生根培养基中培养开始生根的珙桐再生苗图；
图10是接种于第二生根培养基中培养生根后生长良好的珙桐再生苗图；
图11是珙桐再生苗在第二生根培养基中的根系状态图；
图12是珙桐再生苗的移栽后的状态图。
具体实施方式
下面结合附图通过实施例对本发明所述以珙桐叶片为外植体的组织培养获得珙桐再生苗的方法作进一步说明。
实施例1
本实施例中，幼嫩珙桐叶片从四川省彭州市银厂沟风景区的成年珙桐植株上采集（见图1），所述幼嫩珙桐叶片的灭菌操作如下：将洗洁精（白猫牌）用自来水配制成稀释液，洗洁精与自来水的体积比为1︰1000，将所采集的幼嫩珙桐叶片在所述洗洁精稀释液中浸泡10min后取出用自来水冲洗1h洗净表面杂物，然后于无菌条件下用质量浓度75%的乙醇消毒30s，再投入质量浓度0.1%的氯化汞水溶液中消毒4 min，继后取出用无菌水冲洗5次即完成灭菌。将灭菌后的珙桐叶片用剪刀剪成大小约1 cm2的小块用于接种。
本实施例中，以珙桐叶片为外植体的组织培养获得珙桐再生苗的方法步骤如下：
（1）珙桐叶片愈伤组织获得
 使用100ml的三角瓶，每瓶装入约40ml愈伤组织诱导培养基，接种5~6块灭菌后的珙桐叶片小块（叶片背面朝上），避光培养25天，得珙桐叶片愈伤组织（见图2），所述愈伤组织诱导培养基以MS为基础培养基，每升愈伤组织诱导培养基中含有吲哚丁酸1.5mg、6-苄氨基腺嘌呤0.5mg、蔗糖20g和琼脂粉5g，其pH值控制在5.8；
（2）愈伤组织增殖
将步骤（1）获得的珙桐叶片愈伤组织接种于愈伤组织增殖培养基上，避光培养18天，以使愈伤组织增大（见图3），所述愈伤组织增殖培养基以MS为基础培养基，每升愈伤组织增殖培养基中含有吲哚丁酸1.5mg、6-苄氨基腺嘌呤1mg 、蔗糖20g和琼脂粉5g，其pH值控制在5.8；
（3）诱导丛生芽
将步骤（2）增殖后的珙桐叶片愈伤组织切割后接种于芽分化培养基上，于光照强度1500~2000lx、光照时间10h/d的光照条件下培养25天，以诱导丛生芽，所述芽分化培养基以MS为基础培养基，每升芽分化培养基中含有吲哚丁酸0.5mg、6-苄氨基腺嘌呤 3mg、蔗糖20g和琼脂粉5g，其pH值控制在5.8；
（4）丛生芽增殖
把步骤（3）获得的丛生芽切割后接种于芽增殖培养基上，于光照强度1500~2000lx、光照时间10h/d的光照条件下培养25天，以使丛生芽生长，所述芽增殖培养基以MS为基础培养基，每升芽增殖培养基中含有6-苄氨基腺嘌呤0.1mg、赤霉素0.1mg、蔗糖20g和琼脂粉5g，其pH值控制在5.8；
（5）诱导生根
 从步骤（4）增殖后的丛生芽上切下芽高2.5cm以上的幼芽，接种于第一生根培养基中培养3天，再转接到第二生根培养基中培养25天得生根后可移植的珙桐再生苗，用上述两种生根培养基培养时的光照条件为：光照强度为1500~2000lx、光照时间10h/d，所述第一生根培养基以1/2MS培养基为基础培养基，每升第一生根培养基中含有生长素吲哚乙酸 5 mg、蔗糖15g和琼脂粉5g，其pH值控制在5.8，所述第二生根培养基以1/2MS培养基为基础培养基，每升第二生根培养基中含有活性炭2g、蔗糖15g和琼脂粉5g，其pH值控制在5.8。
上述步骤（1）至步骤（5）中的环境温度控制在 22℃，环境湿度控制在 70% 。
（6）移植
将生根后可移植的珙桐再生苗移到自然室温下炼苗4天，取出小苗用自来水冲洗净第二生根培养基后用稀释1000倍的多菌灵液浸泡1h，再移栽在高压灭菌的营养土:蛭石的质量比=2:1的栽培基质上。
本实施例中，丛生芽分化率为50%，生根率100%，移栽成活率91%。
实施例2
本实施例中，幼嫩珙桐叶片从四川省峨眉山市峨眉山风景区的成年珙桐植株上采集，所述幼嫩珙桐叶片的灭菌操作与实施例1相同。将灭菌后的珙桐叶片用剪刀剪成大小约1 cm2的小块用于接种。
本实施例中，以珙桐叶片为外植体的组织培养获得珙桐再生苗的方法步骤如下：
（1）珙桐叶片愈伤组织获得
使用100ml的三角瓶，每瓶装入约40ml愈伤组织诱导培养基，接种5~6块灭菌后的珙桐叶片小块（叶片背面朝上），避光培养28天，得珙桐叶片愈伤组织，所述愈伤组织诱导培养基以MS为基础培养基，每升愈伤组织诱导培养基中含有吲哚丁酸2mg、6-苄氨基腺嘌呤1mg、蔗糖30g和琼脂粉5.2g，其pH值控制在6.0；
（2）愈伤组织增殖
将步骤（1）获得的珙桐叶片愈伤组织接种于愈伤组织增殖培养基上，避光培养21天，以使愈伤组织增大，所述愈伤组织增殖培养基以MS为基础培养基，每升愈伤组织增殖培养基中含有吲哚丁酸2.5mg、6-苄氨基腺嘌呤1.5mg 、蔗糖30g和琼脂粉5.2g，其pH值控制在6.0；
（3）诱导丛生芽
将步骤（2）增殖后的珙桐叶片愈伤组织切割后接种于芽分化培养基上，于光照强度1500~2000lx、光照时间12h/d的光照条件下培养30天，以诱导丛生芽（见图4、5），所述芽分化培养基以MS为基础培养基，每升芽分化培养基中含有吲哚丁酸0.33mg、6-苄氨基腺嘌呤 5mg、蔗糖30g和琼脂粉5.2g，其pH值控制在6.0；
（4）丛生芽增殖
把步骤（3）获得的丛生芽切割后接种于芽增殖培养基上（见图6），于光照强度1500~2000lx、光照时间12h/d的光照条件下培养30天，以使丛生芽生长（见图7），所述芽增殖培养基以MS为基础培养基，每升芽增殖培养基中含有6-苄氨基腺嘌呤0.25mg、赤霉素0.5mg、蔗糖30g和琼脂粉5.2g，其pH值控制在6.0；
（5）诱导生根
从步骤（4）增殖后的丛生芽上切下芽高2.5cm以上的幼芽，接种于第一生根培养基中培养4天（见图8），再转接到第二生根培养基中培养30天得生根后可移植的珙桐再生苗，用上述两种生根培养基培养时的光照条件为：光照强度为1500~2000lx、光照时间12h/d，所述第一生根培养基以1/2MS培养基为基础培养基，每升第一生根培养基中含有生长素吲哚丁酸 10mg、蔗糖20g和琼脂粉5.2g，其pH值控制在6.0，所述第二生根培养基以1/2MS培养基为基础培养基，每升第二生根培养基中含有活性炭1g、蔗糖15g和琼脂粉5.2g，其pH值控制在6.0。
上述步骤（1）至步骤（5）中的环境温度控制在24℃，环境湿度控制在60%。
（6）移植
将生根后可移植的珙桐再生苗移到自然室温下炼苗4天，取出小苗用自来水冲洗净第二生根培养基后用稀释1000倍的多菌灵液浸泡1h，再移栽在高压灭菌的营养土:蛭石的质量比=2:1的栽培基质上。
本实施例中，丛生芽分化率为53%，生根率100%，移栽成活率94%。
实施例3
本实施例中，幼嫩珙桐叶片从四川省雅安市荥经县龙苍沟自然保护区的成年珙桐植株上采集，所述幼嫩珙桐叶片的灭菌操作与实施例1相同。将灭菌后的珙桐叶片用剪刀剪成大小约1 cm2的小块用于接种。
本实施例中，以珙桐叶片为外植体的组织培养获得珙桐再生苗的方法步骤如下：
（1）珙桐叶片愈伤组织获得
使用100ml的三角瓶，每瓶装入约40ml愈伤组织诱导培养基，接种5~6块灭菌后的珙桐叶片小块（叶片背面朝上），避光培养30天，得珙桐叶片愈伤组织（见图2），所述愈伤组织诱导培养基以MS为基础培养基，每升愈伤组织诱导培养基中含有吲哚丁酸2.5mg、6-苄氨基腺嘌呤1.5mg、蔗糖30g和琼脂粉5.8g，其pH值控制在6.1；
（2）愈伤组织增殖
将步骤（1）获得的珙桐叶片愈伤组织接种于愈伤组织增殖培养基上，避光培养28天，以使愈伤组织增大，所述愈伤组织增殖培养基以MS为基础培养基，每升愈伤组织增殖培养基中含有吲哚丁酸2.5mg、6-苄氨基腺嘌呤2.5mg 、蔗糖30g和琼脂粉5.8g，其pH值控制在6.1；
（3）诱导丛生芽
将步骤（2）增殖后的珙桐叶片愈伤组织切割后接种于芽分化培养基上，于光照强度1500~2000lx、光照时间14h/d的光照条件下培养28天，以诱导丛生芽，所述芽分化培养基以MS为基础培养基，每升芽分化培养基中含有吲哚丁酸1mg、6-苄氨基腺嘌呤10mg、蔗糖30g和琼脂粉5.8g，其pH值控制在6.1；
（4）丛生芽增殖
把步骤（3）获得的丛生芽切割后接种于芽增殖培养基上，于光照强度1500~2000lx、光照时间14h/d的光照条件下培养28天，以使丛生芽生长，所述芽增殖培养基以MS为基础培养基，每升芽增殖培养基中含有6-苄氨基腺嘌呤0.5mg、赤霉素0.5mg、蔗糖30g和琼脂粉5.8g，其pH值控制在6.1；
（5）诱导生根
从步骤（4）增殖后的丛生芽上切下芽高2.5cm以上的幼芽，接种于第一生根培养基中培养6天，再转接到第二生根培养基中培养28天得生根后可移植的珙桐再生苗（见图9、10、11），用上述两种生根培养基培养时的光照条件为：光照强度为1500~2000lx、光照时间14h/d，所述第一生根培养基以1/2MS培养基为基础培养基，每升第一生根培养基中含有生长素萘乙酸 15mg、蔗糖20g和琼脂粉5.8g，其pH值控制在6.1，所述第二生根培养基以1/2MS培养基为基础培养基，每升第二生根培养基中含有活性炭1g、蔗糖20g和琼脂粉5.8g，其pH值控制在6.1。
上述步骤（1）至步骤（5）中的环境温度控制在26℃，环境湿度控制在90%。
（6）移植
将生根后可移植的珙桐再生苗移到自然室温下炼苗4天，取出小苗用自来水冲洗净第二生根培养基后用稀释1000倍的多菌灵液浸泡1h，再移栽在高压灭菌的营养土:蛭石的质量比=2:1的栽培基质上（见图12）。
本实施例中，丛生芽分化率为50%，生根率100%，移栽成活率90%。

Claims (1)

1.一种以珙桐叶片为外植体的组织培养获得珙桐再生苗的方法，其特征在于步骤如下：
（1）珙桐叶片愈伤组织获得
取灭菌后的幼嫩珙桐叶片，接种于愈伤组织诱导培养基上，避光培养25～30天，得珙桐叶片愈伤组织，所述愈伤组织诱导培养基以MS为基础培养基，每升愈伤组织诱导培养基中含有吲哚丁酸1.5～2.5mg、6-苄氨基腺嘌呤0.5～1.5mg、蔗糖20～30g和琼脂粉5～5.8g，其pH值控制在5.8～6.1；
（2）愈伤组织增殖
将步骤（1）获得的珙桐叶片愈伤组织接种于愈伤组织增殖培养基上，避光培养18～28天，以使愈伤组织增大，所述愈伤组织增殖培养基以MS为基础培养基，每升愈伤组织增殖培养基中含有吲哚丁酸1.5～2.5mg、6-苄氨基腺嘌呤1～2.5mg、蔗糖20～30g和琼脂粉5～5.8g，其pH值控制在5.8～6.1；
（3）诱导丛生芽
将步骤（2）增殖后的珙桐叶片愈伤组织切割后接种于芽分化培养基上，于光照强度1500～2000lx、光照时间10～14h/d的光照条件下培养25～30天，以诱导丛生芽，所述芽分化培养基以MS为基础培养基，每升芽分化培养基中含有吲哚丁酸0.33～1mg、6-苄氨基腺嘌呤3～10mg、蔗糖20～30g和琼脂粉5～5.8g，其pH值控制在5.8～6.1；
（4）丛生芽增殖
把步骤（3）获得的丛生芽切割后接种于芽增殖培养基上，于光照强度1500～2000lx、光照时间10～14h/d的光照条件下培养25～30天，以使丛生芽生长，所述芽增殖培养基以MS为基础培养基，每升芽增殖培养基中含有6-苄氨基腺嘌呤0.1～0.5mg、赤霉素0.1～0.5mg、蔗糖20～30g和琼脂粉5～5.8g，其pH值控制在5.8～6.1；
（5）诱导生根
从步骤（4）增殖后的丛生芽上切下幼芽，接种于第一生根培养基中培养3～6天，再转接到第二生根培养基中培养，在第二生根培养基中的培养时间以达到幼苗移栽要求为限，用上述两种生根培养基培养时的光照条件为：光照强度为1500～2000lx、光照时间10～14h/d，所述第一生根培养基以1/2MS培养基为基础培养基，每升第一生根培养基中含有生长素5～15mg、蔗糖15～20g和琼脂粉5～5.8g，其pH值控制在5.8～6.1，所述第二生根培养基以1/2MS培养基为基础培养基，每升第二生根培养基中含有活性炭1～2g、蔗糖15～20g和琼脂粉5～5.8g，其pH值控制在5.8～6.1，第一生根培养基中的生长素为吲哚乙酸、吲哚丁酸、萘乙酸中的任一种；
上述步骤（1）至步骤（5）中的环境温度控制在22～26℃，环境湿度控制在60%～90%。
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濒危植物珙桐的组织培养技术研究;李月琴等;《安徽农业科学》;20070630;第35卷(第18期);第1.2.1、1.2.3节 *

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