JPH03272628A

JPH03272628A - 植物材料の生産方法及びカンプトテシンの製造方法

Info

Publication number: JPH03272628A
Application number: JP2070746A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Sudo; 浩須藤; Yuki Hasegawa; 由紀長谷川; Yuji Matsunaga; 松永　祐士
Original assignee: Kanebo Ltd
Current assignee: Kanebo Ltd
Priority date: 1990-03-20
Filing date: 1990-03-20
Publication date: 1991-12-04

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は組織培養によって抗腫瘍性物質カンプトテシン
を含有するキジュ及びフサ逅ズキの植物材料を大量に生
産する方法に関する。

〔従来の技術及び発明が解決しようとするＲ題〕キジｚ
　（Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａ　ａｃｕｍｉｎａｔａ　Ｄ
ＥＣＮＥ）及びクサミズキ（Ｎｏｔｈａｐｏｄｙｔｅｓ
　ｆｏｅｔｉｄａ　（ＷＩＧＨＴ）ＳＬＥＩＩＭＥＲ）
は、その全草中に抗腫瘍性物質カンプトテシンを含有し
、カンプトテシンの原料植物として知られている。これ
らの植物から抽出・精製したカンプトテシンには強い副
作用があるため、そのままで用いることはないが、最近
、カンプトテシンを材料とした、副作用の少ないカンプ
トテシン誘導体が開発され、その治療薬への利用が検討
されている。

カンプトテシンの製造方法は、従来から（Ａ）土壌で栽
培した植物体から抽出する方法が用いられているが、そ
の他にも（Ｂ）未分化組織であるカルスの培養による方
法、（Ｃ）不定芽、不定根の器官培養による方法、（Ｄ
）化学合成による方法、が知られている。しかしながら
、（Ａ）による方法によると次にあげる問題がある。

（１）　　植物の基本的な性質により、栽培可能な地域
が限定される。

（２）　　植物体の生長が天候等の自然条件に左右され
るため、計画的な生産が出来ない。

また、これら（Ａ）による問題点を解決するための方法
として（Ｂ）　、　（Ｃ）の方法についての研究が進め
られてきたが、これらの方法によっても、カンプトテシ
ンの含有率が親植物と比較して極めて低いという問題が
あり、工業的なカンプトテシンの生産方法として実用化
されるに至っていない。

（Ｄ）についての研究も種々なされているが、カンプト
テシンの化学構造は極めて複雑であるため、工業的な化
学を威には底切していない。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明は、キジュ及びクサミズキの生産するカンプトテ
シンを安定に、効率良く大量に生産する方法を提供する
ことを目的とする。

ｃｒｊｉＷＩ点を解決するための手段〕本発明は、キジ
ｓ　（Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａ　　ａｃｕｍｉｎａｔａ
ＤＥＣＮＥ）又はクサミズキ（Ｎｏｔｈａｐｏｄｙｔｅ
ｓ　　ｆｏｅｔｉｄａ（ＭＩＧＨＴ）　ＳＬＥＵＭＥＲ
）の芽をシュート再生用培地でシュートに再生させる工
程と、該シュートを植物体再生用培地で植物体に再生さ
せる工程とを包含する植物材料の生産方法及びそれらの
シュート又は植物体中のカンプトテシンを採取すること
を特徴とするカンプトテシンの製造法である。

本発明においてシュートとは根を有さない茎葉であり、
植物体とはシュートに根が生えたものである。

また、本発明において芽とは、キジュ又はクサミズキの
頂芽、側芽、不定芽、多芽体などいずれのものも適用で
きるが、多芽体であることが最も好ましい、芽が多芽体
である場合には、植物材料の増殖率が大幅に向上する。

本発明によって生産された植物材料は苗として利用でき
る他、そのままカンプトテシンの抽出材料とすることも
できる。

以下、本発明の方法を詳細に説明する。

キジュ又はフサ藁ズキの頂芽、側芽、不定芽又は多芽体
を用意し、次亜塩素酸ナトリウム等の溶液を用いて定法
によりこれらを無菌化処理し、シュート再生用培地に置
床する。シュート再生用培地としては、植物組織培養に
通常用いられるムラシゲ・スクーグ、リンスマイヤー・
スクーグ。

Ｂ５．ニッチ＆ニッチ、ｗｐ、ホワイト等の基本培地に
、サイトカイニン類を添加したものが用いられる。

シュート再生用培地に添加されるサイトカイニン類とし
ては例えばベンジルアデニン、カイネチン、ゼアチン等
が挙げられ、その添加量は０．１〜５μＭが好ましい。

この範囲より多いとシュートが伸長せず、少ないと褐変
・枯死するため好ましくない。

このような培地を用いて、シュート再生培養を約２００
０〜２００００　Ｌ　ｕ　ｘの光照射下、約２０〜３０
℃にて行うことにより、２〜４週間で茎葉の伸長が起こ
り、シュートが再生する。

次にこのようにして邊られたシュートを植物体再生用培
地に移植して植物体を再生させる。植物体再生用培地と
しては、前述の通常用いられる基本培地に、サイトカイ
ニン類とオーキシン類を必要に応じて添加したものが用
いられる。

植物体再生用培地に添加されるサイトカイニン類として
は前述のものが用いられ、オーキシン類としては、例え
ばインドール−３−酢酸、インドール−３−酪酸、α−
ナフタレン酢酸、２．４−ジクロロフェノキシ酢酸等が
挙げられ、その添加量は、サイトカイニン類がＯ〜１μ
Ｍ、オーキシン類が０〜１μＭが好ましい、即ち、サイ
トカイニン類及びオーキシン類は添加しなくてもよく、
例えばキジュに関してはサイトカイニン類は無添加の方
が発根率が良好である。

このような培地を用いて植物体再生培養（発根培養）を
約２０００〜２００００　Ｌ　ｕ　ｘの光照射下、約２
０〜３０°Ｃにて行うことにより、１〜２週間で発根が
起こり、植物体が再生する。再生された植物体を栽培用
の苗として利用する後工程をとる場合には植物体再生培
養は有菌条件下、外環境に馴化しながら例えば、ロック
ウール等を支持体とし、培地としてシＷＩ！を含有しな
いＭＳ培地やハイボネクスを使用して、行うこともでき
る。

この場合も培地中のホルモンは、サイトカイニン類が０
〜１μＭ、オーキシン類が０〜１ｐＭが好ましい。

なお、本発明の出発材料として不定芽を用いる場合、不
定芽は例えば植物体より葉、茎等の組織を取り出し、前
述同様の無菌化処理を行い、これを不定芽誘導用培地に
置床して得ら、れる、この際の不定芽誘導用培地として
は、前述の通常用いられる基本培地に前述同様のサイト
カイニン類とオーキシン類を（必要に応じて）添加した
ものが用いられる。その添加量はサイトカイニン類が０
．１〜１０μＭ、オーキシン類が０．１〜１０μＭが好
ましい、この範囲より多いとカルス化しやすくなり、少
ないと枯死するため好ましくない。

このような培地を用いて、不定芽の誘導培養を約２００
０〜２００００　Ｌ　ｕ　ｘの光照射下、約２０〜３０
°Ｃにて行うことにより４〜８週間後には不定芽が誘導
される。

また、本発明の出発材料として多芽体を用いる場合は次
の方法によって多芽体を得ることができる。

植物体の頂芽９側芽又は不定芽を前述同様の無菌化処理
を行い、これを多芽体誘導増殖用培地に置床して得られ
る。この際の多芽体誘導増殖用培地としては、前述の通
常用いられる基本培地に前述のサイトカイニン類を添加
したものが用いられる。その添加量は５〜５０μＭが好
ましい。この範囲より多いと多芽体が誘導されずカルス
が形成したり、生育阻害が起こりやすくなり好ましくな
い、またこの範囲より少ないと所望の誘導が行えず好ま
しくない、このような培地を用いて多芽体の誘導増殖培
養を、多芽体がカルス化しないように留意しつつ、約２
０００〜２００００　Ｌ　ｕ　ｘの光照射下、約２０〜
３０℃にて行うことにより、３〜６週間後には１個の頂
芽、側芽又は不定芽から１０〜３０個の芽から成る多芽
体が形成される。

多芽体の誘導増殖培養を行う際には、２つの誘導増殖用
培地を用意し、一方の誘導増殖用培地で多芽体に誘導し
、その多芽体をもう一方の誘導増殖用培地に移植する方
法を行うと更に生産倍率が向上する。また、移植の際に
は多芽体を適量ずつにほぐしたり、切り分けると特に好
ましい。

本発明の方法によって大量に得られたキジュ又はクサミ
ズキのシュート及び植物体には親植物より多くのカンプ
トテシンが含有され、メタノール等の溶媒を使用し常法
によって抽出することができる。又、シリカゲル等を用
いたカラムクロマトやＴＬＣにより精製を行う事ができ
る。

〔実施例〕

以下、実施例をあげて本発明を具体的に説明する。なお
、実施例中のカンプトテシンの抽出法及び定量法は次の
ようにして行った。

（カンプトテシンの抽出法）凍結乾燥したサンプルを磨砕後一定重量をはかりとり、
９９％メタノールによって抽出後、濾紙によって枦遇し
、粗抽出物とした。粗抽出液は、メタノールで一定量に
希釈し、定量用のサンプルとした。

（カンプトテシンの定量法）カンプトテシンの定量は高速液体クロマトグラフィー（
ＯＤＳカラム、溶離液：メタノール／水＝７／３、蛍光
検出：励起波長３６５ｎｍ／検出波長４２８ｎｍ）によ
って行った。

実施例１キジュ外植え植物より側芽を含む節を切り取り、７０％
エタノールにより２分間の予備滅菌の後、有効塩素濃度
１％の次亜塩素酸ナトリウム水溶液により１０分間滅菌
した。次に、滅菌水によって薬剤を完全に除去し、これ
を無菌の外植体とした。

これを、０．８％寒天によって固形化した１／２１度の
ムラシゲ・スクーグの培地（以下、基本培地と呼称）に
ベンジルアデニンｌｔＩＭを添加したシュート再生用培
地で２５°Ｃ，１００００Ｌｕｘ（７）条件下（以下の
実施例では特に断りの無い限りこの条件下で培養した）
で培養したところ約４週間後に茎葉の展開したシュート
が再生し、このときの生長率は、４週間で１５．７倍（
新鮮重量）であった、得られたシュート中のカンプトテ
シン含有率は４Ｘ１０司％であった。

このシュートを基本培地にα−ナフタレン酢酸０．１μ
Ｍを添加した植物体再生用培地に移植したところ、約３
週間後に９０％以上のシュートからの発根が認められこ
のときの生長率は４週間で１５．５倍であった。得られ
た植物体中のカンプトテシン含有率は１Ｘ１０−’％で
あった。

実施例２キジュ外植え植物より側芽を含む節を切り取り、７０％
エタノールにより２分間の予１滅菌の後、有効塩素濃度
１％の次亜塩素酸ナトリウム水溶液により１０分間滅菌
した０次に、滅菌水によって薬剤を完全に除去し、これ
を無菌の外植体とした。

これを、０．８％寒天によって固形化した１／２濃度の
ムラシゲ・スクーグの培地（以下、基本培地と呼称）に
ベンジルアデニン１０μＭを添加した多芽体誘導増殖用
培地で培養したところ、４週間後に約２０個の芽からな
る多芽体が誘導された。

多芽体はこの培地を使用して継代培養することによって
増殖することができ、このとき、４週間で２１．８倍（
新鮮重量）の増殖率であった。

この多芽体１０ｇをさらに基本培地にベンジルアデニン
３μＭを添加したシュート再生用培地に移植したところ
約４週間後に茎葉の展開したシュート１５７ｇが再生し
、このときの生長率は、４週間で１５．７倍（新鮮重量
）であった。

このシュート１０ｇを基本培地にインドール３−酢酸１
μＭを添加した植物体再生用培地に移植したところ、約
３週間後に９０％以上のシュートからの発根が認められ
、４週間後に１５５ｇの植物体が得られた。

上記の様にして得られたシュート及び植物体を収穫し、
凍結乾燥後メタノールによってカンプトテシンを抽出し
、さらにシリカゲルＴＬＣを用いて精製を行なった。

その結果、シュートの乾物重量は１５．１　ｇで、ここ
から７．６　ｍ　ｇの精製前のカンプトテシンが得られ
、更に５．１ｍｇ（収率６７％）のカンプトテシンが精
製して得られた。また、植物体の乾燥重量は１６、０　
ｇで、これから１６、０　ｍ　ｇの精製前のカンプトテ
シンが得られ、更に１１．２ｍｇ（収率７０％）のカン
プトテシンが得られた。

なお、シュート中のカンプトテシンの含有率を測定した
ところ５×１０−２％（乾物重量比）、植物体中のカン
プトテシンの含有率を測定したところ１Ｘ１０−’％（
乾燥重量比）であった。また、外植えの親植物のカンプ
トテシン含有率は３×１０−３％（乾燥重量比）であっ
た。

実施例３実施例２によって得られた多芽体から実施例２と同様に
シュートを再生し、これを有菌下、ハイポネクス１００
０倍希釈液を含ませたロックウールに移植し、温度９０
％以上、２５℃、４０００Ｌｕｘの条件下に置いたとこ
ろ、４週間後に９０％以上の個体からの発根が認められ
た。また、この４週間での生育率は新鮮重量で５．１倍
であった。

ロックウールに移植４週間後の植物体中のカンプトテシ
ン含有率を測定したところ、１Ｘ１０−”％（乾物重量
比）であった。

実施例４実施例２のキジュをクサミズキに、基本培地をムラシゲ
・スクーグの培地から８５培地に変え、さらに、多芽体
誘導増殖用培地に添加するホルモンをゼアチン５μＭ、
シュート再生用培地に添加するホルモンをゼアチン０．
１μＭ、植物体再生用培地に添加するホルモンをインド
ール−３−酪酸とする他は、実施例２と同様の操作をし
たところ、多芽体の増殖率は９．５倍／４週間、シュー
トの生長率は１２．３倍／４週間であった。また、発根
率は８２％であった。

このとき、植物体中に含まれるカンプトテシンの含有率
を測定したところ、８　Ｘ　１０−”％であり、親植物
では、３Ｘ１０−”％であった。又、得られたシュート
及び植物体から、メタノール抽出及びシリカゲルＴＬＣ
を用いて、カンプトテシンを好収率で得る事ができた。

実施例５実施例２のキジュをクサミズキに、多芽体誘導増殖用培
地に添加するホルモンをカイネチン５０μＭに、植物体
再生用培地に添加するホルモンをインドール−３−酢＃
０．５μＭ、ベンジルアデニン０．５μＭとする他は、
実施例２と同様の操作を行ったところ、実施例２と同様
、カンプトテシンの含有率の高い植物体が得られた。

〔発明の効果〕

本発明の方法によれば、自然環境等の影響を受けること
がなく、また増殖性に優れた組織培養法により、キジ二
またはクサミズキのシュート及び植物体を得ることが可
能であり、かくして従来法に比してはるかに改善された
高い効率を有するカンプトテシンの製造方法が提供され
る。

手続補正書（自発）平底２年５月１１平底２年特許願第７０７４６号２、発明の名称植物材料の生産方法及びカンプトテシンの製造方法３、補正をする者事件との関係　　特許出願人住所　東京都墨田区墨田五丁目１７番４号連絡先〒５３４大阪市部島区友渕町１丁目５番９０号鐘紡株式会社特許部４、補正により増加する請求項の数　　な　し５、補正
の対象明細書の「特許請求の範囲」及び「発明の詳細な説明」
の欄６、補正の内容（１）明細書「特許請求の範囲」の記載を別紙の通り訂
正する。

（２）明細書第２頁第７行目から第８行目にかけてｒキ
ジ二（Ｃａｎｐｔｏｔｈｅｃａ　ａｃｕｓｉｎａｔａ　
ＤＥＣＮＥ）及びクサミズキ（Ｎｏｔｈａｐｏｄｙｔｅ
ｓ　ｆｏｅｔｉｄａ　（ＷＩＧＨＴ）ＳＬＥＵＭＥＲ）
　Ｊとあるを、「キジ二（四五士±［劇ａｃｕｍｉｎａ
ｔａ　ＤＥＣＮＥ）及びクサミズキ（Ｎｏｔｈａｐｏｄ
ｙｔｅｓｆｏｅｔｉｄａ　（ＷＩＧＨＴ）　ＳＬＥＵＭ
ＥＲ）Ｊと訂正する。

（３）明細書第４頁第２行目から第４行目にかけてｒキ
ジ二（Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａ　ａｃｕｍｉｎａｔａ　
ＤＥＣＮＥ）又はクサミズキ（ＮｏｔｈａｐｏｄｙＬｅ
ｓ　ｆｏｅＬｉｄａ　（ＷＩＧ）ＩＴ）ＳＬＥＵＭＥＲ
）　Ｊとあるを、「キジ二（ｈ５工江■■ａｃｕｍｉｎ
ａｔａ　ＤＥＣＮＥ）又はクサミズキ（Ｎｏｔｈａｐｏ
ｄｙｔｅｓｆｏｅｔｉｄａ　（ＷＩＧｔｌＴ）　ＳＬＥ
ＵＭＥＲ）Ｊと訂正する。

７、添付書類の目録以　　上〔別　　紙〕２、特許請求の範囲手続補正書（自発）平底２年６月２９日ＳＬＥＵＭＥＲ）の芽をシュート再生用培地でシュート
に再生させる工程と、該シュートを植物体再生用培地で
植物体に再生させる工程とを包含する植物材料の生産方
法。

ＳＬＥＵＭＥＲ）の芽をシュート再生用培地でシュート
に再生させる工程より得られた該シュート中のカンプト
テシン又は、該シュートを植物体再生用培地で植物体に
再生させる工程より得られた該植物体中のカンプトテシ
ンを採取することを特徴とするカンプトテシンの製造法
。

１、事件の表示平＊２年特許願第７０７４６号２、発明の名称植物材料の生産方法及びカンプトテシンの製造方法３、補正をする者事件との関係　　特許出願人住　所　東京都墨田区墨田五丁目１７番４号連絡先〒５３４　　大阪市部島区友渕町１丁目５番９０号鐘紡
株式会社　特許部５、補正の対象平成２年５月１１日付手続補正書のｒ６．ｌｚＯ内象」
の欄及び添付〔別紙〕６、補正の内容（１）手続補正書の「６、補正の内容」の欄の第６行〜
第８行にかけてｒキジュ（劫五±佳■９ａｃｕｍｉｎａ
ｔａ　ＤＥＣＮＥ　）及びフサ旦ズキ（勤劫工ｐｏｄｙ
ｔｅｓ　ｆｏｅｔｉｄａ　（［ＧＦＩＴ）　ＳＬＥｔ１
ＭＥＲＪとあるを、ｒキジｓ　（Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃ
ａ　ａｃｕｍｉｎａｔａ　ＤＥＣＮＥ）及びクサミズキ
（Ｎｏｔｈａ　ｏｄ　ｔｅｓ　ｆｏｅｔｉｄａ（ＨＩＧ
ＨＴ）　ＳＬＥＵＭＥＲ）Ｊｌと訂正する。

（２）手続補正書の「６．補正の内容」の欄の第１２行
〜第１４行にかけてｊキジュ（廁狸蝕旦Ｌ（Ｃａｍｐｔ
ｏｔｈｅｃａ　ａｃｕｍｉｎａｔａ　ＤＥＣＮＥ　）又
はフサａｃｕｍｉｎａｔａ　ＤＥＣＮＥ　）又はクサミ
ズキ（Ｎｏｔｈａｐｏｄｙｔｅｓ　ｆｏｅｔｉｄａ　（
ＷＩＧＨＴ）　ＳＬＥＵＭＥＲ）　Ｊと訂正する。

７、添付書類の目録（１）別紙（補正後の特許請求範囲の全文を記載した書面）　　　　　　　１　通板上るを、ｒキジｓ　（Ｃａ＋ｍｐｔｏｔｈｅｃａ　ａｃｕ
ｍｉｎａｔａＤＥＣＮＥ　）又はクサジズキ（Ｎｏｔｈ
ａｐｏｄｙｔｅｓ　ｆ。

ｅｔｉｄａ　（ＷＩＧＨＴ）　ＳＬＥＵＭＥＲ）　Ｊ　
ｅ：訂正する。

（３）手続補正書の添付〔別紙〕の第２行〜第４行及び
第８行〜第１０行にかけて、ｒキジュ〔別紙〕２、特許請求の範囲（１）　　キジｓ　（Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａ　ａｃｕ
ｍｉｎａｔａ　ＤＥＣＮＥ）又はクサミズキ（Ｎｏｔｈ
ａｐｏｄｙｔｅｓ　ｆｏｅｔｉｄａ　（Ｗｌ−ＧＨＴ）
　ＳＬＥＵＭＥＲ）の芽をシュート再生用培地でシュー
トに再生させる工程と、該シュートを植物体再生用培地
で植物体に再生させる工程とを包含する植物材料の生産
方法。

ＧＦＩＴ）　ＳＬＥＵＭＥＲ）の芽をシュート再生用培
地でシュートに再生させる工程より得られた該シュート
中のカンプトテシン又は、該シュートを植物体再生用培
地で植物体に再生させる工程より得られた該植物体中の
カンプトテシンを採取することを特徴とするカンプトテ
シンの製造法。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）キジュ（Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａ　ａｃｕｍｉｎ
ａｔａＤＥＣＮＥ）又はクサミズキ（Ｎｏｔｈａｐｏｄ
ｙｔｅｓ　ｆｏｅｔｉｄａ（ＷＩＧＨＴ）ＳＬＥＵＭＥ
Ｒ）の芽をシュート再生用培地でシュートに再生させる
工程と、該シュートを植物体再生用培地で植物体に再生
させる工程とを包含する植物材料の生産方法。
（２）キジュ（Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａ　ａｃｕｍｉｎ
ａｔａＤＥＣＮＥ）又はクサミズキ（Ｎｏｔｈａｐｏｄ
ｙｔｅｓ　ｆｏｅｔｉｄａ（ＷＩＧＨＴ）ＳＬＥＵＭＥ
Ｒ）の芽をシュート再生用培地でシュートに再生させる
工程より得られた該シュート中のカンプトテシン又は、
該シュートを植物体再生用培地で植物体に再生させる工
程より得られた該植物体中のカンプトテシンを採取する
ことを特徴とするカンプトテシンの製造法。