CN103583368A

CN103583368A - 兔眼蓝莓组培快繁体系的构建方法

Info

Publication number: CN103583368A
Application number: CN201310592650.5A
Authority: CN
Inventors: 张太奎; 刘小珍; 张汉尧
Original assignee: Southwest Forestry University
Current assignee: Southwest Forestry University
Priority date: 2013-11-22
Filing date: 2013-11-22
Publication date: 2014-02-19
Anticipated expiration: 2033-11-22
Also published as: CN103583368B

Abstract

兔眼蓝莓组培快繁体系的构建方法，涉及植物组织培养方法。本发明选取水培苗的茎段为外植体，用酒精和升汞处理后接种在茎芽系诱导培养基中，进一步将茎芽系诱导培养的茎段竖直插于茎芽系增殖培养中，并在生根培养中取IBA浓度2.0mgL^-1，生根率高于85%。上述取水培苗作为来源，其污染率和褐化率明显低于温室培育苗；用酒精和升汞消毒相互促进；茎芽系诱导、增殖与正交实验结果一致；IBA对生根的影响为单因素随机区组实验的结果。

Description

兔眼蓝莓组培快繁体系的构建方法

技术领域

本发明属于植物的栽培方法，特别是涉及植物组织培养方法。

背景技术

蓝莓是一种重要的经济林木，果实深蓝色，果肉细腻，风味独特，被誉为“水果皇后”，“美瞳之果”，被国际粮农组织列为五大健康食品之一。蓝莓具有一定的营养价值和药用价值，果肉富含维生素、蛋白质和矿物质等营养元素(Debnath & McRAE，2001；Debnath，2005)。兔眼蓝莓(Vaccinium ashei.)属杜鹃花科越桔属多年生落叶灌木（Vander, 1988; Ratnaparkhe,2007）。Lohachoompol(2008)认为兔眼蓝莓花青苷含量显著高于高丛蓝莓，丰富的花青苷色素可以缓解眼睛疲劳、改善人的视力。兔眼蓝莓较其它蓝莓长势更强，抗病又抗旱（Powell et al,1989），且较其它蓝莓产量高。除了作为一种水果食用外，兔眼蓝莓正在被开发成果酱、饮料等多种形式（Su & Silva,2006），人们对蓝莓的需求越来越大形成了良好的市场前景，从而带动了大量优质蓝莓品系的扩繁和栽培(Scherm & Krewer,2003；Strik & Yarborough,2005)。

蓝莓的繁殖方式主要为扦插和组培，扦插育苗存在时间限制，而组织培养是无性系快繁、种质改良和遗传资源保存的重要方式之一（Debnath,2007），具有周期短、不受季节和时间的限制及繁殖系数高等特点(Yin & Wang,2009)。据报道（Cao & Hammerschlag, 2000;Debnath,2004）：蓝莓的组培途径分为茎芽系微繁和愈伤增殖两种方式。蓝莓的增殖培养，影响增殖的主导因素有ZT、TDZ和2iP。Debnath和McRAE（2001）在canberry增殖培养中，使用2.5mg/L 2iP综合效果最佳。在bilberry(Shibli和Smith, 1996)、lingonberry (Debnath,2005）和highbush blueberry(Cao和Hammerschlag,2000)增殖培养中，使用1.1mg/L TDZ综合效果最佳。在half-highbush blueberry(Zhao等,2011)的增殖培养中，使用5mg/L ZT综合效果最佳。在lowbush blueberry(Debnath,2004；2009)的增值培养中，使用0.9mg/L ZT综合效果最好。蓝莓的生根方式有瓶内生根和体外生根两种。目前，在bilberry(Shibli和Smith, 1996)、lowbush blueberry(Debnath,2004）和lingonberry (Debnath,2005）体外生根培养中，使用IBA生根粉综合效果最佳。在half-highbush blueberry(Zhao等,2011)的瓶内生根培养中，使用2mg/L IBA综合效果最佳。同时，在蓝莓无菌培养系建立过程中，鲜有关于取材来源对消毒效果影响的报道。

发明内容

本发明旨在通过对兔眼蓝莓组织培养的各步骤研究，包括外材来源、外植体消毒、ZT、NAA和栽培品种对茎芽系增殖、IBA对生根培养的影响，提供一种兔眼蓝莓组培快繁体系的构建方法，建立其优良品系。

本发明通过以下方式实现兔眼蓝莓的构建方法的目的：

构建方法包括茎芽系诱导培养、茎芽系增殖培养、生根培养，其中：

选取水培苗的茎段为外植体，先用70%的酒精处理20sec，再用0.1%的升汞处理18min，然后接种在茎芽系诱导培养基中，该培养基组合为WPM+1.0 mgL^-1ZT +5g/L Agar+30g/L Sucrose。

所述的构建方法是将兔眼蓝莓茎芽系诱导培养的茎段竖直插于茎芽系增殖培养中，该培养基组合为WPM+2.0 mgL^-1ZT +0.01 mgL^-1NAA +5g/L Agar+30g/L Sucrose，综合表现最佳。

所述的构建方法是在兔眼蓝莓组培的生根培养中，该培养基组合为1/2WPM+IBA+5g/L Agar+30g/L Sucrose，其中，IBA浓度2.0mgL^-1IBA对生根培养综合表现最好，生根率高于85%。

本发明具有的积极效果和意义是：

本发明在兔眼蓝莓无菌培养系建立过程中，选取水培苗和温室培育苗作为来源，对取材来源与消毒效果影响进行对比，结果表明：取水培苗作为来源，其污染率和褐化率明显低于温室培育苗。而在相同来源外材的条件下，最佳的茎段消毒体系为取水培苗茎段，先用70%酒精处理20s，然后用0.1%升汞处理18min。在此过程中，升汞的效应大于酒精，而且两者之间有交互作用，即酒精和升汞对消毒会产生相互促进的效果。这与Debnath(2004)、Debnath(2005)和Zhao等(2011)的观点不一致。出现这种情况的可能原因有：⑴ 兔眼蓝莓与其它蓝莓物种不同，茎段消毒体系有所差异；⑵ 酒精增加茎段表面的透性，提高升汞对外材的消毒效果；⑶ 水培苗相对温室苗而言，整体的污染度会降低。

在兔眼蓝莓茎芽系增殖培养中，2.0mg/L ZT和0.01mg/L NAA的综合表现最佳。其中，品种间遗传差异是影响株高的主导因素；ZT是影响叶片数量及长度、增值倍数的主导效应，且以2.0mg/L的浓度表现最佳。后者区别于已知的影响蓝莓增殖的主导因素中选择的5mg/L ZT最佳综合效果（half-highbush blueberry，Zhao等,2011)，以及在lowbush blueberry(Debnath,2004；2009)的增值培养中，使用0.9mg/L ZT得到最好综合效果的文献记载。

本发明在兔眼蓝莓生根培养中，2.0mgL^-1IBA对蓝莓生根培养综合表现最佳，生根率大于85%。

附图说明

图1~4是本发明涉及的兔眼蓝莓在增值培养中，叶片数与长度、株高和增值倍数随各因素水平极差变化图。其中，

图1为株高在不同ZT浓度水平和不同NAA浓度水平数值的折线图。

图2为叶片数量在不同ZT浓度水平和不同NAA浓度水平数值的折线图。

图3为叶片长在不同ZT浓度水平和不同NAA浓度水平数值的折线图。

图4为增值倍数在不同ZT浓度水平和不同NAA浓度水平数值的折线图。

图5~图10为兔眼蓝莓组培苗的无菌培养系各阶段示意图。其中，

图5为兔眼蓝莓组培苗的无菌培养系示意图。

图6为兔眼蓝莓‘Brightwell’茎芽系的增殖示意图。

图7为兔眼蓝莓‘Premier’茎芽系的增殖示意图。

图8为兔眼蓝莓‘Garden Blue’茎芽系的增殖示意图。

图9为兔眼蓝莓组培苗生根培养示意图。

图10为兔眼蓝莓组培苗移栽驯化。

以下结合具体实施方式对本发明对进一步说明。本发明包括但不限于实施方式记载的内容。

具体实施方式

（一）以L₁₈(2×3⁷)考查酒精和升汞对水培兔眼蓝莓幼茎段消毒的影响

培养基组合选用1/2MS+5g/L Agar+30g/L Sucrose，调节pH至5.8分装至Sigma Chemical Co.的175mL塑料盖玻璃瓶，121℃灭菌20min。外植体选用‘Brightwell’、‘Premier’、‘Garden Blue’之3种兔眼蓝莓水培的和大田中的当年生幼茎段，采自西南林业大学试验田。用0.1%的洗洁精浸泡叶片1min，然后用流水冲洗2h，置于超净工作台上，采用L₁₈(2×3⁷)正交实验研究70%酒精和0.1%升汞对外植体消毒的影响，接着用无菌水浸泡3次，每次5min。将单芽茎段插于培养基上。实验重复3次，每个重复设18个处理组合，每个处理组合接种30个外植体，如表1。在培养架上摆放采用随机区组实验设计，光照16h/d，培养7d后，记录数据，结果表明：使用水培苗的茎段，先用70%的酒精处理20sec，再用0.1%的升汞处理18min，污染率最低，活性最高。

表1 幼茎段消毒水平和参数

Contamination rate = Contaminated explants / Total explants

Browning rate = browning explants / Total explants

（二）以L₉（3⁴）考查ZT和NAA对蓝莓茎芽系增殖的影响

实验考查不同浓度的ZT和NAA对蓝莓茎芽系增殖的影响，采用L₉（3⁴）正交实验设计，正交实验表见表2，设置3次重复，每个重复设9个处理组合，每个处理组合安排30个外植体。培养基组合为WPM+ZT+NAA+5g/L Agar+30g/L Sucrose，外植体选用上一阶段已建立的无菌系，在培养架上摆放采用随机区组实验设计。

表2 L₉(3⁴) 正交试验设计表

蓝莓增值培养的各项指标进行方差分析和多重比较（表3、表4）的结果表明，不同ZT, NAA处理组合对叶片长度与数量、株高和增值倍数的影响差异较为明显：

表3 以ANOVA 分析各处理汇总结果

Data were collected after 8 weeks in culture.

表4 根长、叶片长及叶数、增殖倍数的各处理结果

The data represent the mean±SD.

Data were collected after 8 weeks in culture.

Mean separation within columns and factors by Duncan’s multiple range test, whereby mean associated with different lowercase letters significant differences, and different capital letters extremely significant differences.

结果表明：（1）不同处理组合间，叶片长度差异显著（P=0.010<0.05），经Duncan多重比较，处理组合4、5、6显著高于其它处理组合而同为a组。处理组合9显著高于其它组，而为叶片长次高的ab组。处理组合2和8相当，显著高于其他组，同为叶片长次次高的b组。处理组合3和7相当，显著高于其他组，同为bc组。处理组合1，显著低于其他组而为c组。（2）不同处理组合间，叶片数量差异极显著（P=0.000<0.01），经Duncan多重比较，处理组合6极显著高于其它处理组合而为A组。处理组合5极显著高于其它组，而为叶片数量次多的AB组。处理组合4极显著高于其他组，同为叶片数量次次多的B组。处理组合2，极显著高于其他组而为BC组。处理组合1，极显著低于其他组而为E组。（3）不同处理组合间，株高差异极显著（P=0.000<0.01），经Duncan多重比较，处理组合6和8极显著高于其它处理组合而同为A组。处理组合5极显著高于其它组，而独立为株高次多的AB组。处理组合2、4和9极显著高于其他组，同为株高次次多的B组。处理组合1和7相当，极显著高于其他组而同为BC组。处理组合3，极显著低于其他组而为C组。（4）不同处理组合间，增值倍数极显著（P=0.001<0.01），经Duncan多重比较，处理组合5和6极显著高于其它处理组合而同为A组。处理组合8极显著高于其它组，而独立为增值倍数次多的AB组。处理组合4极显著高于其他组而为增值倍数次次多的B组。处理组合2、3和9相当，极显著高于其他组而同为BC组。处理组合1和7，极显著低于其他组而同为C组。综合各个处理组合，处理组合6综合表现最佳，即2.0mg/L ZT、0.01mg/L NAA 。

在蓝莓增值培养中，对叶片数与长度、株高和增值倍数随各因素水平变化的趋势和各指标的极差（表5）进行分析如图1~4，差异较为明显：（1）在图1中，株高折线在ZT浓度第2水平和NAA浓度第2水平处均取得最大值。ZT的2水平和3水平极显著地大于水平1，而同为A组。NAA的2水平极显著地大于水平1和3，而独立为A组。栽培种1（‘Premier’）的株高最大，极显著地大于其它水平，而独立为A组。从影响株高的各因素极差值可知，栽培品种>ZT>NAA，这说明栽培品种对于株高的影响占据主导地位，即品种间遗传差异是影响株高的主导因素。ZT对株高影响的效应次之，且以2.0mg/L的浓度最佳。NAA的影响最小，以0.01mg/L浓度最好。（2）在图2中，叶片数量在ZT浓度第2水平、NAA浓度第2水平和栽培种第2水平处均取得最大值。ZT的2水平极显著地大于水平1和3，而独立为A组。NAA的2水平和3水平极显著地大于水平1，而同为A组。栽培种对叶片数的影响差异不显著。从影响叶片数的各因素极差值可知， ZT>NAA>栽培品种，这说明ZT对于叶片数的影响占据主导地位，以2.0mg/L的浓度最佳。NAA的影响次之，以0.01mg/L浓度最好。（3）在图3中，叶片长在ZT浓度第2水平、NAA浓度第2水平和栽培种第2水平处均取得最大值。ZT的2水平极显著地大于水平1和3，而独立为A组。NAA和栽培种对叶片长的影响差异不显著。从影响叶片数的各因素极差值可知， ZT>NAA>栽培品种，这说明ZT对于叶片长的影响占据主导地位，以2.0mg/L的浓度最佳。（4）在图4中，增值倍数在ZT浓度第2水平、NAA浓度第2水平和栽培种第2水平处均取得最大值。ZT的2水平极显著地大于水平1和3，而独立为A组。NAA的2水平和3水平显著地大于水平1，而同为a组。栽培种对增值倍数的影响差异不显著。从影响叶增值倍数的各因素极差值可知， ZT>NAA>栽培品种，这说明ZT对于叶片数的影响占据主导地位，以2.0mg/L的浓度最佳。NAA的影响次之，以0.01mg/L浓度最好。

表5 根长、叶片长及叶数、增殖倍数的区间分析

（三）不同浓度的IBA对兔眼蓝莓组培苗生根的影响

实验中，IBA浓度水平1~6依次为： 0.5mgL^-1、1.0mgL^-1、1.5mgL^-1、2.0mgL^-1、2.5mgL^-1、3.0mgL^-1。每个处理接种30个外植体，重复3次。培养基组合为1/2WPM+IBA+5g/L Agar+30g/L Sucrose，外植体选用上一阶段的无菌系，在培养架上摆放采用随机区组实验设计。

表 6 ANOVA分析各处理生根培养汇总表

表7 各处理的每株平均根数、平均根长及生根率

Treatment	Average root per shoot	Average length of root(cm)	Rooting rate(%)
				1	1.00±1.00^D	0.3±0.10^D	52.37±8.20^C
2	5.00±1.00^C	0.57±0.15^C	71.40±14.30^B
				3	8.33±0.58^AB	0.93±0.06^BC	80.93±8.26^AB
4	10.00±1.00^A	1.20±0.10^A	92.10±0.89^A
				5	7.00±1.00^B	1.07±0.15^AB	85.70±4.30^AB
6	6.67±0.58^BC	0.80±0.10^B	76.10±0.36^B

The data represent the mean±SD.

Data were collected after 6 weeks in culture.

Mean separation within columns and factors by Duncan’s multiple range test, whereby mean associated with different letters extremely significant differences.

培养30d后开始生根（图7），对不同处理间平均根长、平均生根条数和生根率进行方差分析和多重比较(表6和表7)，结果表明，不同处理对生根株数、平均生根条数和生根率影响的差异较为明显：（1）不同处理间，平均根长差异极显著（P=0.000<0.01），经Duncan多重比较，处理4差异极显著地大于其他组而独立为A组。（2）不同处理间，平均生根条数差异极显著（P=0.000<0.01），经Duncan多重比较，处理4的平均生根条数差异极显著地大于其他组而独立为A组。（3）不同处理间，生根率差异极显著（P=0.001<0.01），经Duncan多重比较，处理4的生根率差异极显著地大于其他组而独立为A组。综合各因子，在4水平（2.0mgL^-1IBA）下，蓝莓组培苗在平均生根数、平均根长和生根率方面均优于其他组。综合表现值高的在移栽炼苗阶段成活率更高，生长势更好（图8）。

Claims

1.兔眼蓝莓组培快繁体系的构建方法，包括茎芽系诱导培养、茎芽系增殖培养、生根培养，其特征是选取水培苗的茎段为外植体，先用70%的酒精处理20sec，再用0.1%的升汞处理18min，然后接种在茎芽系诱导培养基中，该培养基组合为WPM+1.0 mg.L^-1ZT +5g/L Agar+30g/L Sucrose。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征是将兔眼蓝莓茎芽系诱导培养的茎段竖直插于茎芽系增殖培养中，该培养基组合为WPM+2.0 mg.L^-1ZT +0.01 mg.L^-1NAA +5g/L Agar+30g/L Sucrose，综合表现最佳。

3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征是在兔眼蓝莓组培的生根培养中，该培养基组合为1/2WPM+IBA+5g/L Agar+30g/L Sucrose，其中，IBA浓度2.0mg.L^-1IBA对生根培养综合表现最好，生根率高于85%。