CN102657089A - 一种榉树无菌播种方法 - Google Patents

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陈晓明
覃子海
张日清
汪灵丹
覃玉凤
蔡玲
韦璐阳
王以红
吴幼媚
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一种榉树无菌播种方法，包括以下步骤：外植体采集、消毒；对成熟合子胚的愈伤诱导、愈伤增殖培养、芽分化培养、单芽生根培养。采用本发明能够利用萌发困难的榉树成熟合子胚为外植体获取榉树组培生根小苗，增殖系数达到3～5倍/30天，生根率达75%以上，有效解决了萌芽率低的榉树种子繁育再生植株的问题。

Description

一种榉树无菌播种方法
一、技术领域
本发明涉及林业科学中的林木组织培养育苗技术，具体是一种榉树无菌播种方法。
二、背景技术
榉树（Zelkova schneideriana）属于榆科（Ulmaceae family）榉属(Zelkova)，落叶大乔木，分布于地中海东部至亚洲东部，约10个物种。我国主要产于辽东半岛至西南以东的广大地区。具有树龄长，抗风、抗早、病虫害少、材质优良等特点。榉树木材致密坚硬，纹理美观，不易伸缩与挠曲，耐腐性强，是造船、桥梁以及生产各类高档家具和工艺品的上等木材，属于高档的硬阔叶用材树种；茎皮含纤维，且含量较多，是制造人造棉、绳索和造纸的原料；树根根系发达，能够固持水土，保养水源，改善土壤透气性和结构，是很好的水土保持树种；树形优美，树冠冠幅大，叶色季相变化丰富，因而又是深受人们喜爱的传统色叶园林树种和重要的园林绿化景观树种。由于榉树具有较高经济、生态和景观利用价值，且现存榉树资源非常紧缺，在第一批《国家重点保护野生植物名录》中，榉树被列为国家二级重点保护的野生植物。
榉树花小，落花落果现象严重，且种子的结实率仅在10%左右，已被列为国家二类保护植物。现阶段，我国用材榉木主要依靠进口。开展榉树组织培养研究，对加速优良榉树苗木的繁殖，制备人工种子，开展细胞融合和体细胞杂交等生物技术育种有着极其重要的意义。由于榉树种子消毒极难，消毒后又不易萌发，给榉树的组织培养带来一定困难。因此开展榉树无菌播种技术研究，对于突破榉树组织培养瓶颈具有重要意义。
三、发明内容
本发明的目的提供一种榉树无菌播种方法。利用榉树成熟合子胚进行无菌播种，通过成熟合子胚的脱分化和再分化过程培育出榉树有根组培小苗。以解决榉树种子不易消毒，消毒后不萌发等问题，突破利用榉树成熟合子胚繁育的瓶颈。
本发明通过以下技术方案达到上述目的，一种榉树无菌播种方法，包括如下步骤：
1、外植体的采集、消毒
收集榉树种子，将采回的种子用清水浸泡1天，再用洗洁精搓洗，后用去离子水清洗1～3次，置于超净工作台上去种皮。将去除种皮的成熟合子胚用75％乙醇浸泡灭菌10 s，蒸馏水冲洗1～3次，再用0.1％HgCl2以振荡的方式进行灭菌处理 4～6 min，用无菌水冲洗3～5次。
2、成熟合子胚愈伤诱导、愈伤增殖、芽分化培养、单芽生根培养
将消毒好的去种皮的成熟合子胚接种到改良WPM+6-BA1.0～2.0 mg·L-1+蔗糖30000 mg·L-1+琼脂4000 mg·L-1的培养基上进行诱导培养。培养条件为25±2℃，1000～1500LX，每天光照10～14 h为宜。30 d后将诱导的大团愈伤组织分割成小团，转接到改良WPM+6-BA0.5～1.0 mg·L-1+蔗糖30000 mg·L-1+琼脂4000 mg·L-1的增殖培养基上，以促进愈伤组织的增殖。愈伤组织增殖到一定数量后，转入改良WPM+6-BA2.0mg·L-1+NAA0～1.0 mg·L-1+蔗糖30000 mg·L-1+琼脂4000 mg·L-1的分化培养基上，诱导愈伤组织分化出芽。
将诱导出的株高1.0 cm以上的单芽剪下，接种到生根培养基1/2改良WPM+ IBA 0.1～1.0mg·L-1+蔗糖20000 mg·L-1+琼脂5000 mg·L-1中诱导生根。
所述改良WPM培养基的组成为：
KNO3                   900mg·L-1
NH4NO3                 400 mg·L-1
CaCl2.2H2O              264 mg·L-1
MgSO4.7H2O              370 mg·L-1
Ca(NO3)2. 4 H2O           556 mg·L-1
KH2PO3                  270 mg·L-1
MnSO4.4 H2O             22.3 mg·L-1
ZnSO4.7 H2O             8.6 mg·L-1
FeSO4·7H2O              27.8mg·L-1
Na2-EDTA·2H2O          37.3mg·L-1
CuSO4.5 H2O             0.025 mg·L-1
H3BO3                   6.2 mg·L-1
Na2MoO4.2 H2O           0.25 mg·L-1
KI                     0.83 mg·L-1
CoCl2.6 H2O             0.025 mg·L-1
维生素B1               0.4 mg·L-1
维生素B6               0.5 mg·L-1
烟酸                    0.5 mg·L-1
甘氨酸                  2.0 mg·L-1
肌醇                    100 mg·L-1。
本发明与现有技术相比，具有以下突出的实质性特点和显著进步：
1、由于采用剥去种皮的种子进行消毒，污染率大幅降低。
2、采用榉树成熟合子胚为外植体，通过脱分化和再分化的途径再生完整植株，既能解决榉树种子不萌发的问题，又能通过愈伤组织的增殖，大量繁育该树种，达到保护濒危树种种质资源的目的，增殖系数约为3～5倍/30d。
四、具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
本发明所述的榉树无菌播种方法，包括如下步骤：
1、种子的收集
将新鲜榉树种子或叫小坚果采回后,放在通风荫凉的地方自然干燥至含水量13%以下,然后将种子进行贮藏,试验所用种子的千粒重为13.6g。
2、无菌播种
2.1、成熟合子胚消毒
实例1：将采回的种子用清水浸泡1天，以使种皮软化。再用洗洁精搓洗，洗掉附着在种子上的部分尘土，后用去离子水清洗1次。将种子放置在经过消毒的不锈钢碟子中，置于超净工作台上，用新洁尔灭洗净双手，手工剥去种皮。将去除种皮的成熟合子胚转至经过高压灭菌的空玻璃瓶中，仍置于超净工作台上，用75％乙醇浸泡灭菌10 s，蒸馏水冲洗1次，再用0.1％HgCl2以振荡的方式进行灭菌处理 4 min，最后用无菌水冲洗3次。
实例2：将采回的种子用清水浸泡1天，以使种皮软化。再用洗洁精搓洗，洗掉附着在种子上的部分尘土，后用去离子水清洗2次。将种子放置在经过消毒的不锈钢碟子中，置于超净工作台上，用新洁尔灭洗净双手，手工剥去种皮。将去除种皮的成熟合子胚转至经过高压灭菌的空玻璃瓶中，仍置于超净工作台上，用75％乙醇浸泡灭菌10 s，蒸馏水冲洗2次，再用0.1％HgCl2以振荡的方式进行灭菌处理 5 min，最后用无菌水冲洗4次。
实例3：将采回的种子用清水浸泡1天，以使种皮软化。再用洗洁精搓洗，洗掉附着在种子上的部分尘土，后用去离子水清洗3次。将种子放置在经过消毒的不锈钢碟子中，置于超净工作台上，用新洁尔灭洗净双手，手工剥去种皮。将去除种皮的成熟合子胚转至经过高压灭菌的空玻璃瓶中，仍置于超净工作台上，用75％乙醇浸泡灭菌10 s，蒸馏水冲洗3次，再用0.1％HgCl2以振荡的方式进行灭菌处理6 min，最后用无菌水冲洗5次。
2.2、成熟合子胚的愈伤诱导培养
实例1：将消毒好的成熟合子胚接种到改良WPM+6-BA1.0 mg·L-1+蔗糖30000 mg·L-1+琼脂4000 mg·L-1的培养基上进行诱导培养。培养条件为25±2℃，1000LX，每天光照10 h为宜。培养10 d后，开始有暗黄色愈伤产生，培养30 d后，愈伤团直径约1～1.5cm，80%的外植体可形成愈伤团。把大块愈伤团分成小块转入继代增殖培养。
实例2：将消毒好的成熟合子胚接种到改良WPM+6-BA1.5 mg·L-1+蔗糖30000 mg·L-1+琼脂4000 mg·L-1的培养基上进行诱导培养。培养条件为25±2℃，1250LX，每天光照12 h为宜。培养10 d后，开始有暗黄色愈伤产生，培养30 d后，愈伤团直径约1～1.5cm，80%的外植体可形成愈伤团。把大块愈伤团分成小块转入继代增殖培养。
实例3：将消毒好的成熟合子胚接种到改良WPM+6-BA2.0 mg·L-1+蔗糖30000 mg·L-1+琼脂4000 mg·L-1的培养基上进行诱导培养。培养条件为25±2℃，1500LX，每天光照14 h为宜。培养10 d后，开始有暗黄色愈伤产生，培养30 d后，愈伤团直径约1～1.5cm，80%的外植体可形成愈伤团。把大块愈伤团分成小块转入继代增殖培养。
所述改良WPM培养基的组成为：
KNO3                   900mg·L-1
NH4NO3                 400 mg·L-1
CaCl2.2H2O              264 mg·L-1
MgSO4.7H2O             370 mg·L-1
Ca(NO3)2. 4 H2O           556 mg·L-1
KH2PO3                  270 mg·L-1
MnSO4.4 H2O             22.3 mg·L-1
ZnSO4.7 H2O             8.6 mg·L-1
FeSO4·7H2O              27.8mg·L-1
Na2-EDTA·2H2O          37.3mg·L-1
CuSO4.5 H2O             0.025 mg·L-1
H3BO3                   6.2 mg·L-1
Na2MoO4.2 H2O           0.25 mg·L-1
KI                      0.83 mg·L-1
CoCl2.6 H2O              0.025 mg·L-1
维生素B1                0.4 mg·L-1
维生素B6                0.5 mg·L-1
烟酸                     0.5 mg·L-1
甘氨酸                   2.0 mg·L-1
肌醇                     100 mg·L-1。
2.3、愈伤增殖培养
实例1：把生长健康，无褐化的大块愈伤团分成小块转入增殖培养。转接到改良WPM+6-BA0.5 mg·L-1+蔗糖30000 mg·L-1+琼脂4000 mg·L-1的增殖培养基上，以促进愈伤组织增殖。愈伤组织需及时转接，否则会出现褐化死亡的现象。愈伤增殖在23℃条件下，约35d转接一次，培养30 d，愈伤团直径约 1～1.5cm，可分成3块小愈伤团，即增殖系数为3。
实例2：把生长健康，无褐化的大块愈伤团分成小块转入增殖培养。转接到改良WPM+6-BA0.75mg·L-1+蔗糖30000 mg·L-1+琼脂4000 mg·L-1的增殖培养基上，以促进愈伤组织增殖。愈伤组织需及时转接，否则会出现褐化死亡的现象。愈伤增殖在24℃条件下，约32d转接一次，培养30 d，愈伤团直径约 1～1.5cm，可分成4块小愈伤团，即增殖系数为4。
实例3：把生长健康，无褐化的大块愈伤团分成小块转入增殖培养。转接到改良WPM+6-BA1.0 mg·L-1+蔗糖30000 mg·L-1+琼脂4000 mg·L-1的增殖培养基上，以促进愈伤组织增殖。愈伤组织需及时转接，否则会出现褐化死亡的现象。愈伤增殖在25℃条件下，约30d转接一次，培养30 d，愈伤团直径约 1～1.5cm，可分成5块小愈伤团，即增殖系数为5。
2.4、芽分化培养
实例1：待愈伤组织数量较多时，可将部分愈伤组织转入芽分化培养基：改良WPM+6-BA2.0mg·L-1+蔗糖30000 mg·L-1+琼脂4000 mg·L-1。转入培养约7d，愈伤组织上有绿色芽点产生，培养约15d，可见小叶片抽出，培养约40d,可见1～1.5cm高单芽立于愈伤之上。
实例2：待愈伤组织数量较多时，可将部分愈伤组织转入芽分化培养基：改良WPM+6-BA2.0mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1+蔗糖30000 mg·L-1+琼脂4000 mg·L-1。转入培养约7d，愈伤组织上有绿色芽点产生，培养约15d，可见小叶片抽出，培养约40d,可见1～1.5cm高单芽立于愈伤之上。
实例3：待愈伤组织数量较多时，可将部分愈伤组织转入芽分化培养基：改良WPM+6-BA2.0mg·L-1+NAA1.0 mg·L-1+蔗糖30000 mg·L-1+琼脂4000 mg·L-1。转入培养约7d，愈伤组织上有绿色芽点产生，培养约15d，可见小叶片抽出，培养约40d,可见1～1.5cm高单芽立于愈伤之上。
2.5、生根培养
将株高超过1.0 cm的单芽剪下，接种到生根培养基中诱导生根。10～14 d后，芽的基部开始长出根点，35 d时根长1～3 cm，生根3～4条/株，生根率75％以上。
上述生根培养基的组成为：
1/2改良WPM
IBA                    0.1～1.0 mg·L-1
蔗糖                   20000 mg·L-1
琼脂粉                 5000 mg·L-1。

Claims (1)

1.一种榉树无菌播种方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
1.1外植体的采集、消毒
收集榉树种子，将采回的种子用清水浸泡1天，再用洗洁精搓洗，然后用去离子水清洗1～3次，置于超净工作台上去种皮，将去除种皮的成熟合子胚用75％乙醇浸泡灭菌10 s，蒸馏水冲洗1～3次，再用0.1％HgCl2以振荡的方式进行灭菌处理 4～6 min，用无菌水冲洗3～5次，
1.2成熟合子胚愈伤诱导、愈伤增殖、芽分化培养、单芽生根培养
将消毒好的成熟合子胚接种到改良WPM+6-BA1.0～2.0 mg·L-1+蔗糖30000 mg·L-1+琼脂4000 mg·L-1的培养基上进行诱导培养，培养条件为25±2℃，1000～1500LX，每天光照10～14 h为宜，30 d后将诱导的大团愈伤组织分割成小团，转接到改良WPM+6-BA0.5～1.0 mg·L-1+蔗糖30000 mg·L-1+琼脂4000 mg·L-1的增殖培养基上，以促进愈伤组织的增殖，愈伤组织增殖到一定数量后，转入改良WPM+6-BA2.0mg·L-1+NAA0～1.0 mg·L-1+蔗糖30000 mg·L-1+琼脂4000 mg·L-1的分化培养基上，诱导愈伤组织分化出芽，
将诱导出的株高1.0cm以上的单芽剪下，接种到生根培养基1/2改良WPM+ IBA 0.1～1.0mg·L-1+蔗糖20000 mg·L-1+琼脂5000 mg·L-1中诱导生根，
其中，所述改良WPM培养基的组成为：
KNO3                   900mg·L-1
NH4NO3                 400 mg·L-1
CaCl2.2H2O              264 mg·L-1
MgSO4.7H2O              370 mg·L-1
Ca(NO3)2. 4 H2O           556 mg·L-1
KH2PO3                  270 mg·L-1
MnSO4.4 H2O             22.3 mg·L-1
ZnSO4.7 H2O             8.6 mg·L-1
FeSO4·7H2O              27.8mg·L-1
Na2-EDTA·2H2O          37.3mg·L-1
CuSO4.5 H2O             0.025 mg·L-1
H3BO3                   6.2 mg·L-1
Na2MoO4.2 H2O           0.25 mg·L-1
KI                     0.83 mg·L-1
CoCl2.6 H2O             0.025 mg·L-1
维生素B1               0.4 mg·L-1
维生素B6               0.5 mg·L-1
烟酸                    0.5 mg·L-1
甘氨酸                  2.0 mg·L-1
肌醇                    100 mg·L-1。
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WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20120912