CN104031865B - 一种快捷高效的葛仙米育种方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种快捷高效的葛仙米育种方法，包括1)将葛仙米球体浸泡于纯化水中，并进行光源诱导，待葛仙米球体自发破裂后收集滤液；2)将滤液与藻殖段培养液混合，置于室内恒温恒光的条件下通气培养后获得微球体形态的葛仙米；3)微球体形态的葛仙米作为球体种源进入下一级扩大培养，在培养的过程中，不断有子球体从球体种源上出芽并最终脱落，直接形成一个独立的微球体形态的葛仙米。本发明先通过诱导的方法使葛仙米球体破裂，从而获得藻殖段；再通过培养藻殖段获得微球体；最后利用所得微球体进行出芽繁殖。整套育种方法极大的缩短了育种周期，简化了育种工艺；对藻种的纯度无任何要求，制种量大，经济实惠，适合葛仙米规模化生产。

Description

一种快捷高效的葛仙米育种方法

技术领域

本发明涉及一种蓝藻的培育技术，尤其涉及一种快捷高效的葛仙米育种方法。

背景技术

葛仙米学名拟球状念珠藻(Nostoc sphaeroides Kutzing)，又称天仙米、天仙菜，是一种可以食用的固氮蓝藻。葛仙米不仅营养丰富，而且具有可观的药用价值和保健功能。葛仙米富含氨基酸、蛋白质、维生素C、维生素B1和B2、多种矿物质，其含钙量之高在蔬菜中极为少见，其多糖具有很好的美容护肤功效。据《本草纲目》和《本草纲目拾遗》等记载，葛仙米可治疗夜盲症、脱肛、烧烫伤等。此外，据《全国中草药汇编》介绍，葛仙米性寒、味淡，具有清热、收敛、益气、明目等药用保健功效。因此，葛仙米是一种经济价值极高的天然蓝藻。湖北省鹤峰县走马镇是世界上最大的葛仙米产区，近年来葛仙米的原生态环境遭到了严重破坏，鹤峰县葛仙米年产量已从20年前的25×10³Kg锐减至0.5×10³Kg。有调查表明，目前葛仙米自然资源短缺，甚至有绝迹的可能，因此，开发葛仙米人工养殖技术势在必行。

葛仙米的生活史较为复杂，其球体形态是由单个细胞串连成串后形成的丝状体经过不同的生长阶段发育而来。因此源源不断的培养葛仙米丝状体，是获得高产量球体形态葛仙米的一种重要育种方式。葛仙米的丝状体包括营养丝状体和藻殖段丝状体。营养丝状体由营养细胞和异形胞组成。营养丝状体是通过机械的方式(如匀浆)将葛仙米的球体破坏，并使球体内的长藻丝断裂成短藻丝，因其受到了机械破坏，因此在后期发育过程中通常需要4-5天的生理修复期；藻殖段是葛仙米球体在不适应外界环境变化的情况下自发破裂释放出来的短链丝状体，因其没有受到机械损伤，所以在后期发育的过程中无需生理修复，且生理活性显著高于营养丝状体。藻殖段的丝体短，缺乏异形胞，具有移动性，因此便于在水层间传播并获得适宜的生长条件。

大量的生产实践数据表明，完成从丝状体阶段到后期相同的生长阶段的发育过程，藻殖段所需要的时间总是比通过匀浆方式获得的营养丝状体所需要的时间短3-5天，并且由藻殖段发育而成的葛仙米球体具有更高的应对环境突变的能力。因此，采用藻殖段作为丝状体种源进行育种能够有效的缩短生产周期，同时葛仙米小球体的质量也能够得到显著的提高。

现有的葛仙米丝状体制备技术多采用匀浆的方法，这种通过机械破坏的方法使得丝状体断裂获得的丝状体生理活性较低，在培养的过程中需要先恢复生理活性后才能生长发育，因此培养周期长，并且发育率偏低；也有采用人工诱导藻殖段的方法制备丝状体的技术，但是需要采用严格的无菌操作，首先通过平板分离纯化的方法获得无杂藻污染的纯化丝状体，再逐级放大培养，接种和培养液的更换均需在洁净工作台上进行；也有不采用无菌操作技术的育种方法，但是仍然需要对葛仙米球体表面进行化学消毒，并且匀浆后的藻丝需要用无菌水清洗后离心弃上清方可获得。鉴于此，有待开发一种快捷高效的葛仙米育种方法。尚未见有采用葛仙米球体出芽繁殖的育种方法的报道。

发明内容

针对现有技术不足，本发明的目的是提供一种快捷高效的葛仙米育种方法。

为实现上述目的，本发明提供了一种快捷高效的葛仙米育种方法，包括以下步骤，

1)将葛仙米球体浸泡于纯化水中，并进行光源诱导，待葛仙米球体破裂后收集滤液，所述滤液中含有葛仙米藻殖段；

2)将滤液与藻殖段培养液混合，置于室内恒温恒光的条件下通气培养后获得微球体形态的葛仙米；

3)步骤2)培养的微球体形态的葛仙米作为球体种源进入下一级扩大培养，在培养的过程中，不断有子球体从球体种源上出芽并最终脱落，直接形成一个独立的微球体形态的葛仙米。

优选的，所述步骤3)中将直径≤2mm的子球体作为球体种源不断进行出芽繁殖，将直径≥3mm的微球体形态的葛仙米滤出。

优选的，步骤1)中所述光源诱导的条件：光照强度为500-10000lux，培养温度为15-33℃。

优选的，步骤2)中所述滤液与藻殖段培养液以1：1比例混合。

优选的，藻殖段培养液以纯化水为水源，所添加的各种营养成分的浓度如下：

MgSO₄·7H₂O：75mg/L；K₂HPO₄·3H₂O：40mg/L；EDTA·2Na：1mg/L；CaCl₂·2H₂O：9mg/L；柠檬酸：6mg/L；柠檬酸铁铵：6mg/L；Na₂CO₃：20mg/L；H₃BO₃：2.86g/L；MnCl₂·4H₂O：1.81g/L；ZnSO₄·7H₂O：222mg/L；Na₂MoO₄·2H₂O：39mg/L；CuSO₄·5H₂O：79mg/L；Co(NO₃)₂·6H₂O，49m_g/L，无需对藻殖段培养液进行任何消毒处理，如高压蒸汽灭菌等。

优选的，步骤2)中所述通气培养的通气量为5-10L/min/L，培养条件：光照强度为500-10000lux，培养温度为15-33℃。

优选的，所述步骤2)中，每10-20天更换一次藻殖段培养液，每次换液时先停止通气，静置使藻殖段培养物充分沉降，再将上清液倒出，重新注入新鲜的藻殖段培养液。

优选的，每次换液时更换旧培养液的0.2-0.8倍。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1.主要采用出芽繁殖的育种工艺，极大的缩短了育种周期，简化了育种工艺；

2.本发明通过高效的诱导方法使葛仙米球体在完全自发的状态下释放出生理活性高的藻殖段，与匀浆藻丝相比具有更高的生长发育速度，可显著缩短育种周期；

3.葛仙米的整套育种工艺无需在洁净工作区或洁净工作台上进行操作，不需要对培养容器和培养液进行高压蒸汽灭菌或者采用化学方法进行消毒，也不需要采用任何化学方法对葛仙米球体表面进行消毒，整套操作简单易行；

4.培养过程为全开放式，在制种过程中，对藻种的纯度无任何要求；传统的葛仙米制种方法将种源纯度放在首位，采用各种纯化措施以求获得无菌的纯化培养物，如采用固体平板法对葛仙米种源进行分离纯化、向固体培养基或者液体培养基中添加抗生素(如氨苄青霉素等抑制微生物的生长)、离心(通过离心力将微生物和葛仙米藻丝体分开)等，因此整套制种操作执行起来异常繁琐；

5.本方法工艺简单，制种量大，经济实惠，是适合葛仙米规模化生产的一种快捷高效的育种方法。

附图说明

图1葛仙米从丝状体到微球体的发育过程；其中，A：丝状体；B：丝状体周围形成胶鞘；C：丝状体单个细胞开始横向增大；D：丝状体单个细胞开始横向分裂，胶鞘两端的异形胞显著并且肥大；E：细胞全方位横向分裂程度加大，胶被被堆叠整齐的细胞层充实起来形成形态明显的细胞囊，细胞层之间的界面较为明显；F：细胞囊变得更加饱满，细胞层之间的界面不再明显；G：长形细胞囊的中间部位开始出现凹陷，凹陷部位由异形胞相连，从而分化出两个或多个细胞囊；H：细胞囊变得更加肥大，细胞囊内部的细胞未连成藻丝；I：所有细胞囊都发育成了内部细胞呈丝状体分布的微球体。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1葛仙米藻殖段的诱导

将葛仙米球体(以直径≥3mm为宜)清洗后置于敞口容器中，并用纯化水浸泡(以刚刚浸没为宜)，将容器静置于500-10000lux左右的环境下培养，培养温度为15-33℃。待葛仙米的球体完全破裂后用筛网将液体中的残渣滤出，并收集滤液，此滤液中分散着大量葛仙米藻殖段。此藻殖段诱导工艺的诱导率为100％。

实施例2葛仙米藻殖段的培养方法

ⅰ)藻殖段培养液的配制

以纯化水为水源，所添加的各种营养成分的浓度如下：

MgSO₄·7H₂O：75mg/L；K₂HPO₄·3H₂O：40mg/L；EDTA·2Na：1mg/L；CaCl₂·2H₂O：9mg/L；柠檬酸：6mg/L；柠檬酸铁铵：6mg/L；Na₂CO₃：20mg/L；H₃BO₃：2.86g/L；MnCl₂·4H₂O：1.81g/L；ZnSO₄·7H₂O：222mg/L；Na₂MoO₄·2H₂O：39mg/L；CuSO₄·5H₂O：79mg/L；Co(NO₃)₂·6H₂O，49mg/L。

无需对藻殖段培养液进行任何消毒处理，如高压蒸汽灭菌等。

ⅱ)藻殖段的培养

将实施例1中收集到的分散着大量葛仙米藻殖段的藻液与步骤ⅰ)制备的藻殖段培养液以1:1的比例混合，置于室内恒温恒光的条件下通气培养，所通空气无需过滤，通气量控制在5-10L/min/L，培养光强为500-10000lux，培养温度为15-33℃。培养容器无需进行消毒处理(如高压蒸汽灭菌或者用H₂O₂浸泡等)。整套操作可在普通工作区操作，无需在洁净工作台上进行。

藻殖段培养初期无需进行生理修复，2-3天后即可发育到B阶段或C阶段(参见图1)。

ⅲ)培养液的更换

每10-20天更换一次培养液，培养液的配制见步骤ⅰ)中藻殖段培养液的配制，每次换液时需要先停止通气，静置使藻殖段培养物充分沉降，再将上清液倒出，重新注入新鲜的藻殖段培养液。整套操作可在普通工作区进行，无需在洁净工作台上进行。每次换液时更换旧培养液的0.2-0.8倍。

ⅳ)藻殖段培养物的收获

一般培养了10天以上的藻殖段丝状体(图1中A)可形成微球体(图1中I)。微球体形态的葛仙米适应性强，可作为球体种源进入下一级扩大培养。参见表1，发育状态A-I阶段是葛仙米从丝状体发育成球体的9个必经阶段，将匀浆处理得到的营养丝状体和自发破裂释放出的藻殖段丝状体分别发育到A-I阶段所需要的时间进行了比较，藻殖段在整个过程的发育速度明显高于匀浆营养丝状体的发育速度。

表1  葛仙米从初始丝状体分别发育到图1中9个生长状态所需要的时间(天)

实施例3葛仙米小球体(直径≤2mm)的出芽繁殖

将实施例2中形成微球体的葛仙米进行扩大培养。培养光照为500-10000lux，培养温度为15-33℃。

各种营养成分的浓度如下：

MgSO₄·7H₂O：0-75mg/L；K₂HPO₄·3H₂O：0-40mg/L；EDTA·2Na：0-1mg/L；CaCl₂·2H₂O：0-9mg/L；柠檬酸：0-6mg/L；柠檬酸铁铵：0-6mg/L；Na₂CO₃：0-20mg/L；H₃BO₃：0-2.86g/L；MnCl₂·4H₂O：0-1.81g/L；ZnSO₄·7H2O：0-222mg/L；Na₂MoO₄·2H₂O：0-39mg/L；CuSO₄·5H₂O：0-79mg/L；Co(NO₃)₂·6H₂O：0-49mg/L。

培养水源仍然是纯化水，亦可选择各项指标符合国家饮用标准的自来水或洁净的天然水体(如地下水、河道水、湖泊水或者水库水)。在用纯化水以外的培养水源配制营养成分时需要根据水源各自的特性对各种营养成分的添加量进行调整。

采用上述培养工艺，微球体阶段的葛仙米(从图1中I阶段开始到直径≤2mm的球体)在扩大培养的过程中会不断进行出芽繁殖，即不断有子球体从母球体上出芽并最终脱落，直接形成一个独立的微球体，无需重新经历从丝状体到微球体的发育过程。定期用筛网将直径≥3mm母球体筛选出来，保留直径≤2mm的母球体继续培养。采用此培养工艺，微球体的出芽率可达90％以上。制备相同生物量和相同大小的微球体种源，此出芽繁殖的工艺周期比直接从匀浆得到的营养丝状体培养到微球体的育种周期短15-20天，比直接从自发释放出的藻殖段丝状体培养到微球体的育种周期短10-15天。而且此出芽繁殖的育种工艺更加简便易行。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (6)

1.一种快捷高效的葛仙米育种方法，其特征在于，包括以下步骤，

1)将葛仙米球体浸泡于纯化水中，并进行光源诱导，待葛仙米球体自发破裂后收集滤液，所述滤液中含有葛仙米藻殖段；

2)将滤液与藻殖段培养液混合，置于室内恒温恒光的条件下通气培养后获得微球体形态的葛仙米；

3)步骤2)培养的微球体形态的葛仙米作为球体种源进入下一级扩大培养，在培养的过程中，不断有子球体从球体种源上出芽并最终脱落，直接形成一个独立的微球体形态的葛仙米；

步骤2)中所述通气培养的通气量为5-10L/min/L，培养条件：光照强度为500-10000lux，培养温度为15-33℃；藻殖段培养液以纯化水为水源，所添加的各种营养成分的浓度如下：

MgSO₄·7H₂O：75mg/L；K₂HPO₄·3H₂O：40mg/L；EDTA·2Na：1mg/L；CaCl₂·2H₂O：9mg/L；柠檬酸：6mg/L；柠檬酸铁铵：6mg/L；Na₂CO₃：20mg/L；H₃BO₃：2.86g/L；MnCl₂·4H₂O：1.81g/L；ZnSO₄·7H₂O：222mg/L；Na₂MoO₄·2H₂O：39mg/L；CuSO₄·5H₂O：79mg/L；Co(NO₃)₂·6H₂O，49mg/L，无需对藻殖段培养液进行任何消毒处理。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中将直径≤2mm的子球体作为球体种源不断进行出芽繁殖，将直径≥3mm球体形态的葛仙米滤出。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述光源诱导的条件：光照强度为500-10000lux，培养温度为15-33℃。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述滤液与藻殖段培养液以1：1混合。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中，每10-20天更换一次藻殖段培养液，每次换液时先停止通气，静置使藻殖段培养物充分沉降，再将上清液倒出，重新注入新鲜的藻殖段培养液。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，每次换液时更换原培养液的0.2-0.8倍。