CN101245333A - 叠加式通气培养铁皮石斛胚状体及其干粉工艺 - Google Patents

Abstract

本发明公开了利用叠加式工厂化生产铁皮石斛胚状体及其干粉的工艺流程和技术。该发明克服了高等植物组织培养走出实验室向工厂化生产转化中，易污染，种子成本高，生产速度慢的难关；用该工艺流程使铁皮石斛“比生物生长速率”达到8.4～9.2毫克/克·天。用该工艺生产出的铁皮石斛胚状体干粉，铁皮石斛多糖含量达到16％以上，且多糖含量稳定，遗传稳定性可靠，生物活性高。生产周期短(十天收获一次)。年产干品达到吨位水平。

Description

叠加式通气培养铁皮石斛胚状体及其干粉工艺

技术领域

本发明属于现代生物技术领域。本发明涉及药用高等植物工厂化生产原生药材及干品制备工艺技术；以铁皮石斛为例说明该发明应用之途径。

技术背景

进入21世纪，随着城市进程和人口的膨胀，生态环境遭到不断侵蚀，许多种药用高等植物的原生地遭到破坏，尤其对于像铁皮石斛这类生长缓慢，对生长环境要求苛刻，生物量低下的物种，首当其冲地遭到枯竭和灭绝。现在真正的天然野生铁皮石斛到了一枝难求的地步。

铁皮石斛是石斛家族中药用方面的姣姣者，人们在上个世纪70～80年代时开始试图用生物技术加传统人工引种栽培扩大产量，迄今均收效甚微，存在投入量大，周期长(3～5年)，成活率低等问题。应用生物培养技术拯救这类名贵中药材使其有价有市满足人们需要是一条行之有效的途径。在此技术领域内，尽管已有通过培养方法来制备铁皮石斛材料，但由于其种子为芽蔟，并采用浅层培养，故而周期长，产量低。

发明内容

本发明的目的是，以铁皮石斛为例，采用避免常规植物组织培养中通过脱分化或再分化等的生物技术过程，以免引起遗传变异。药材强调的“地道”。本发明直接从原生植株的休眠芽获取胚状体，保证源头上的“原汁原味”。

本发明的另一个目的是，提供一套使之从实验室规模向工厂化生产转变的工艺流程和技术参数。在此基础上，拯救更多更广泛的药用资源，满足人们不断增长的需要。

本发明提供的铁皮石斛胚状体制备方法，是基于高等植物具有二个全能性——高等植物细胞在一定条件下，能形成完整植株的全能性，和合成原生植株药用有效成份的全能性。

本发明强调使培养物一直保持在高密度，年轻态，是为了保证在工厂化生产过程中，使固液比达到25～35％，“比生物生长速率”达到8.4毫克/克.天，鲜品得率保证在10％以上，有效成份多糖达16％以上。

具体操作步骤：取野外生长成材铁皮石斛茎段，在实验室超净台上仔细剥去叶鞘和叶片，50％乙醇浸润(3～5秒)，放入0.1％升汞中15分钟，然后转到饱和次氯酸钠或次氯酸钙溶液中7～8分钟，在超净台上用灭菌水冲洗三遍，放到灭菌吸水纸上吸干，灭菌刀片切取带节的茎段，接种到1/2MS无机盐，含NAA，BA，蔗糖3％，琼脂粉4.5g/升，经40～50天后起始胚状体形成，等到起始胚状体长成黄豆粒大小时，仔细剥离外植体，每个三角瓶按等边三角形接种3个点，上述固体培养基上，另加入CH1000毫克/升，2.5％蔗糖0.5％麦芽糖。29℃±1，室内自然光照条件下，扩增，达到要求数量后，转入到液体培养基(上述成份去掉琼脂粉)，置于150毫升三角瓶装液量75毫升，90转/分回转或摇床上进行悬浮培养。每7天继代一次。3～4次后进入筛选过程。篩选后的胚状体用于叠加式培养扩增。

符合工厂化生产要求铁皮石斛胚状体筛选过程：

在全过程中，密切注意筛选出生长速率快，胚状体球状物生长密集，从圆球形，大小均匀的年轻态胚状体，颜色上保持鲜活浅绿色，及时淘汰乳白色或丛芽状，芽簇状的培养物。这种培养对于工厂化生产，对于最终成品的铁皮石斛多糖含量的稳定，得干率，固液比等技术参数的满足是至关重要的，是成败关键。

用本发明生产出的铁皮石斛鲜品，清水冲洗后放到合格认证的室内，常温下，凉干至其含水量在5％以后，在55℃烘箱中，烘至绝对干重，超级粉碎，定量包装后，经医用钴室伽玛射线灭活菌。

本发明的工艺流程达到了如下的结果：

1、本发明通过铁皮石斛胚状体为实例，获得的产品，其药用有效成份——铁皮石斛多糖达到16％以上，并保持产品质量的稳定性，生产过程的连续性。

2、通过本发明生产流程，能大大地提高象铁皮石斛这一类生长缓慢，对生长环境苛刻，生物量低下的名贵中药材，年产量达到吨位水平，大大超过了任何实验室规模。

附图说明

图1，叠加式通气培养铁皮石斛胚状体及其干粉工艺流程图

图2，小容量叠加式通气培养装置示意图。

其中，1通气泵、2通气管、3配气阀(三通)、4进气过滤器、5进气管、6容器、7液面层、8排气头、9排气管、10排气过滤器。

具体实施案例

实施案例仅为说本发明，详细描述工艺技术特征。应理解，下述实施例仅用于本发明，不用于限制本发明的范围。

本发明下述所涉及的培养基：

MS培养基

KNO₃         1900mg/L       H₃BO₃         6.2mg/L

NH₄NO₃       1650mg/L       KI            0.83

MgSO₄·7H₂O  370mg/L        Na₂Mo₄·2H₂O  0.25

CaCl₂·2H₂O  440mg/L        MnSO₄·4H₂O   22.3

KH₂PO₄       170mg/L        ZnSO₄·7H₂O   8.6

Na₂-EDTA     37.3mg/L       CoCl₂·6H₂O   0.025

Fe₂SO₄       27.8mg/L       CuSO₄·5H₂O   0.025

CH           1000mg/L       肌醇          100mg/L

蔗糖         25g/L          B₁            50mg/L

麦芽糖       5g/L           B₆            1.5mg/L

5％香蕉汁                   PH 5.8

NAA BA  适量

121℃1.1大气压灭菌21分钟

固体培养基4.5g/L琼脂粉

液体培养基去脱脂琼即成

实施例1.起始胚状体的诱导

为保证遗传上的一致性，避免常规组织培养中，由于脱分化和再生分化过程而带来的遗传变异。该工艺的技术关键是直接从野外生长的铁皮石斛原生植株休眠芽上获得胚状体，从而保证源头上的原汁原味。

将采集的原生植株茎段经灭菌后，在超净台上，切取带节的切段，每段含一个节。节上下保留0.5公分，以便减少污染利于成功。每个150毫升三角瓶中装50毫升的固体培养基，每瓶插一段。40～50天后形成起始胚状体。

实施例2起始胚状体的扩增

将黄豆粒大小的胚状体“球”，小心地剥离外植体，移到增值培养基上，每瓶放三个点呈等边三角形，以利于形成条件培养基，达到快速增值的目的。

实施例3适合工厂化生产要求的胚状体筛选

能否筛选出满足工厂化生产要求的胚状体，是该工艺的物质基础，技术保证。将固体培养基上扩增获得胚状体，按5％(w/w)接种量，接种到液体培养基中，放在回转式(90转/分)摇床上进行悬浮培养，保持室内自然光照，29℃±1；每七天继代一次；经3～4次继代后，不间断地进行挑选那些保持圆球状、生长密集、浅绿色的胚状体“球”。淘汰那些长成丛芽状或芽簇壮的培养物，使培养物一直保持在形态上的一致性和年轻态，以利于提高“比生物生长速率”满足于工厂化生产。这样的培养物最终能保证“固液比”和鲜品的得干率(10％以上)，最终获得较高的生产率。

资料显示，高等植物组织培养能否成功的关键是培养物的“比生物生长速率”能否达到5.7毫克/克.天。(约自然生长速率的850倍以上)通过该工艺筛选到的胚状体其生长速率达到8.4毫克/克.天。

实施例4小容量叠加式通气悬浮培养铁皮石斛胚状体的工艺流程

该工艺流程专门针对高等植物在实验室水平规模转向工厂化规模转化而设计的。高等植物工厂化悬浮培养中污染关，种子成本大，培养周期长，三大难关。该工艺的特点是，采用小容量，一对一接种，分级连续培养种子，分级收集终端成品，使污染风险降到最低，使生产流程连续运转。以铁皮石斛这种名贵、生长缓慢、自然资源极度枯竭的中药材为例，能以工厂化规模生产铁皮石斛干粉，年产量达到“吨”位水平，满足人类需要。

工艺流程：

级序	周期(天)	容器(L)	装液量(L)	接种率	固液比	培养方式
							一级种	10	0.1	0.45～0.5	7％	25～30％	摇床
二级种	10	2	1	5％	25～35％	通气
							三级种	10	5	4	5％	25～35％	通气
四级种	10	10	8	5％	25～35％	通气
							五级种	10	20	16	5％	25～30％	通气

叠加式培养及产量：

培养容器体积(升)	培养单位(培养容器数)	单位数	日产量(公斤)
				1	5	5	3.1
20	5	5	62.5

实施例5铁皮石斛胚状体多糖含量及稳定性的测定

经该工艺流程生产的铁皮石斛多糖，无论在任何一级收获的成品，其多糖含量都达到16％以上，与原生植株含量相似或相等，且成品质量相对稳定。

项目	样品1	样品2	样品3	样品4
					鲜品重(g)	25.60	39.73	13.00	18.70
干品重(g)	3.228	3.555	1.487	2.169
					多糖含量(mg/g)	167.32	165.3	160.28	172.25

Claims (4)

1. 适合工厂化生产铁皮石斛胚状体的筛选程序。

该工艺包括下列：

A.起始胚状体的诱导：

将采集的原生植株茎段经灭菌后，在超净台上，切取带节的切段，每段含一个节。节上下保留0.5公分，以便减少污染利于成功。每个150毫升三角瓶中装50毫升的固体培养基，每瓶插一段。40～50天后形成起始胚状体。

B.起始胚状体的扩增：

将黄豆粒大小的胚状体“球”，小心地剥离外植体，移到增值培养基上，每瓶放三个点呈等边三角形，以利于形成条件培养基，达到快速增值的目的。

C.适合工厂化生产要求的胚状体筛选：

将固体培养基上扩增获得胚状体，按5％(w/w)接种量，接种到液体培养基中，放在回转式，90转/分。摇床上进行悬浮培养，保持室内自然光照，29℃±1；每七天继代一次；经3～4次继代后，不间断地进行挑选那些保持圆球状、生长密集、浅绿色的胚状体“球”。淘汰那些长成丛芽状或芽簇壮的培养物，使培养物一直保持在形态上的一致性和年轻态，以利于提高“比生物生长速率”满足于工厂化生产。这样的培养物最终能保证“固液比”和鲜品的得干率(10％以上)，最终获得较好的生产率。

D.叠加式通气悬浮培养铁皮石斛胚状体的工艺流程。

该工艺流程专门针对高等植物在实验室水平规模转向工厂化规模转化而设计的。高等植物工厂化悬浮培养中污染关，种子成本大，培养周期长，三大难关。该工艺的特点是，采用小容量，一对一接种，分级连续培养种子，分级收集终端成品，最大培养容器体积为1至100升；每个独立培养单位含10至100个培养容器。在培养温室内(20C-32C)设20-200个培养单位。按此叠加式培养方式，日产量为1公斤至2000公斤。

经该工艺流程生产的铁皮石斛多糖，无论在任何一级收获的成品，其多糖含量都达到16％以上，与原生植株含量相似或相等，且成品质量相对稳定。

2. 一种以权利要求1所叙述的铁皮石斛胚状体，其特征“比生物生长速率”达到8.4～9.2毫克/克·天，每10天增重2倍以上。其有效成份多糖含量达到16％以上，且保持稳定。

3. 一种以权利要求1所叙述的小容量叠加式通气培养铁皮石斛胚状体工艺流程，解决了铁皮石斛胚状体生产走出实验室规模转化为工厂化生产。干品产量达到吨位/年水平。多糖含量达到16％以上。

4. 一种如权利要求2所述的铁皮石斛胚状体的产品用途，所收集鲜品铁皮石斛胚状体通过下列方法制成食用和药用干粉：

收各级培养收集的终端成品。用清水冲洗干净后，在达标的室内常温薄层凉干至含水量5％以下时，在55℃烘箱中，最后烘到绝对干重。超级粉碎，打包，在医用伽玛射线射线室中灭活菌。

注意：整个过程中不能超过65℃以上“高温”。否则会导致铁皮石斛产品中许多生理活性物质的破坏或变性。

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